魏佳婷 陳藝聰 曾進勝

細小動脈硬化性腦小血管?。╝rteriolosclerotic cerebal small vessel disease，aCSVD）是最常見的腦小血管?。╟erebral small vessel disease，CSVD）類型[1]，明確 aCSVD 的病理機制是探索其診療手段的關(guān)鍵所在，復制合適的動物模型對aCSVD的病理機制或治療靶點等的研究具有重要意義。因此，本文將從行為學、影像學和病理改變等角度對目前常用的 aCSVD動物模型進行綜述，為建立更接近臨床實際的 aCSVD動物模型提供參考。

1 模型動物選擇

嚙齒類動物是目前最常用于構(gòu)建aCSVD模型的動物，其主要優(yōu)勢有成本-效益比低、繁育周期短和腦體積小，適于行全腦切片。而且，隨著基因編輯技術(shù)在嚙齒類動物中的應用日趨成熟，嚙齒類動物已成為研究分子機制和探索治療靶點的重要工具。超高場強磁共振的應用也促進了嚙齒類動物神經(jīng)影像學的發(fā)展[2-3]。但嚙齒類動物模型也存在顯著的不足之處，嚙齒類動物神經(jīng)系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)、生理和行為學與人類差異大，限制了其研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化。比如，人類腦白質(zhì)非常豐富，約占全腦體積 50%，而且尸檢結(jié)果顯示腦白質(zhì)損害是人類aCSVD的重要病理改變，但嚙齒類動物腦白質(zhì)量少，僅占全腦體積14%，與人類差異大，降低了其在腦白質(zhì)高信號等研究中的應用價值[4-6]。而且人類大腦的腦回和腦溝豐富，但嚙齒類動物為無腦回動物，各腦區(qū)之間缺乏明確的分界標志[7]。另外，研究顯示阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征與aCSVD密切相關(guān)[8]，雖然嚙齒類動物已廣泛應用于睡眠障礙的研究中，但其睡眠特征與人類截然不同，首先，人類為單相性或雙相性睡眠，而嚙齒類動物為多相性睡眠；其次，人類為夜間睡眠，嚙齒類動物則晝伏夜動；最后，與人類相比，嚙齒類動物的快速動眼睡眠和非快速動眼睡眠周期顯著縮短。因此，如果利用嚙齒類動物研究睡眠障礙與aCSVD之間的關(guān)系，其結(jié)果能否延伸至人類仍不明確[9-10]。

近年來，有研究者采用非人靈長類動物（non-human primate，NHP）構(gòu)建 aCSVD模型[11-15]。與嚙齒類動物模型相比，構(gòu)建NHP動物模型的主要不足包括繁育成本高和倫理要求更嚴格。但NHP具有嚙齒類動物無法比擬的優(yōu)勢，其神經(jīng)系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)、血流動力學、生理和行為學與人類更為相似。比如，NHP的大腦白質(zhì)體積占比與人類相似，并且具有腦回腦溝結(jié)構(gòu)，因此更適用于腦白質(zhì)高信號或腦萎縮等的基礎(chǔ)研究[7]；另外，NHP的睡眠覺醒周期、睡眠結(jié)構(gòu)、長度和穩(wěn)定性都與人類接近[16]，在探索睡眠障礙與aCSVD相關(guān)性的研究中，其應用價值高，而且，針對NHP的行為學評估方法和睡眠行為監(jiān)測方法都已建立[15，17]，這也提高了NHP應用于aCSVD相關(guān)研究中的可行性。再者，神經(jīng)影像學是 aCSVD研究的重要部分，不同于嚙齒類動物，NHP對磁共振檢查的場強要求較低，目前臨床上常用的3.0 T磁共振也適用于NHP的影像研究[18-19]。因此，在aCSVD的臨床前研究中，NHP具有嚙齒類動物無法取代的地位。

2 模型構(gòu)建方法

目前常用于復制CSVD動物模型的方法主要包括慢性低灌注、微小栓子血管栓塞、激光誘導穿支動脈閉塞和慢性高血壓導致的CSVD模型等，其中僅慢性高血壓導致的CSVD模型存在細小動脈硬化的病理改變，因此成為復制aCSVD動物模型的重要方法。該方法多采用嚙齒類動物或NHP，其中常用的嚙齒類動物模型包括易卒中型自發(fā)性高血壓大鼠、易卒中型腎血管性高血壓大鼠和血管緊張素II誘導慢性高血壓導致的aCSVD模型，NHP動物模型則主要通過胸主動脈狹窄復制慢性高血壓導致的aCVSD模型。

2.1 易卒中型自發(fā)性高血壓大鼠（stroke-prone spontaneously hypertensive rats，SHRSP） 19 世紀 60 年代，日本京都大學研究人員發(fā)現(xiàn)部分雄性Wistar大鼠具有自發(fā)性高血壓，于是研究人員將這些雄性大鼠與血壓稍高于平均水平的雌性大鼠進行交配，接著從所得的F1代中篩選收縮壓大于150 mmHg的子代，并進行近交，近交約20代后，最終形成了所有成年雄性和雌性大鼠均發(fā)生自發(fā)高血壓的近交系自發(fā)性高血壓大鼠 （spontaneous hypertensive rats，SHR）[20]，SHRSP是在 SHR的基礎(chǔ)上給予特殊的高鹽低蛋白飲食發(fā)展而來的[21]。9～12周齡時，SHRSP血壓可達 200 mmHg以上[22-23]。24周齡時，新物體識別實驗（novel-object recognition test，NORT）和 Morris 水迷宮實驗顯示SHRSP的非空間記憶能力顯著下降，而空間學習能力沒有顯著受損[24]。SHRSP在9～12月齡時出現(xiàn)自發(fā)性皮層和皮質(zhì)下卒中，包括出血性和缺血性卒中，卒中發(fā)病率約80%[22-23]。在出現(xiàn)腦卒中癥狀的SHRSP大鼠中，MRI上可以觀察到缺血性卒中、出血性卒中病灶和腦白質(zhì)高信號病灶，動態(tài)對比增強磁共振顯示病灶的血腦屏障滲透性顯著增強，動脈自旋標記顯示病灶腦血流量顯著下降[25]，而在尚未出現(xiàn)卒中癥狀的SHRSP中，MRI上則尚不能觀察到腦白質(zhì)高信號病變[26]。小動脈內(nèi)皮功能障礙和血腦屏障受損是 SHRSP的早期病理改變，3～5周齡時，SHRSP雖尚未出現(xiàn)高血壓，病理結(jié)果卻顯示其已出現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙和內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白減少[27]。隨著年齡增長，SHRSP小動脈病變逐漸加重，雙光子活體光學成像顯示，17～28周齡時其小動脈病變主要表現(xiàn)為血管壁完整性受損、紅細胞流速減慢和管壁紅細胞附著，30～32周齡時小動脈管腔中紅細胞栓塞形成顯著增多[28]，而且在病變嚴重的小動脈壁上可以觀察到淀粉樣蛋白沉積[28-29]。在出現(xiàn)腦卒中癥狀的SHRSP中，病理顯示其腦小動脈病變包括大分子物質(zhì)滲出、血管壁重構(gòu)、管腔狹窄、管腔栓塞，腦組織呈海綿狀改變，即腦組織疏松和空泡形成[25]，但是在尚未出現(xiàn)卒中癥狀的SHRSP中，病理只能觀察到腦小動脈病變，尚未出現(xiàn)顯著的腦白質(zhì)脫髓鞘或空泡形成[26]。

慢性低灌注可促進SHRSP的腦白質(zhì)病變，對12周齡的SHRSP行單側(cè)頸動脈閉塞術(shù)，術(shù)后動態(tài)對比增強磁共振顯示其白質(zhì)滲透常數(shù)顯著增大，彌散張量成像顯示其表面彌散系數(shù)顯著增大，各向異性系數(shù)顯著減小，提示血腦屏障受損和腦白質(zhì)微結(jié)構(gòu)損害加重。病理顯示，與SHRSP假手術(shù)組相比，單側(cè)頸動脈閉塞術(shù)后，內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白表達進一步下降，腦白質(zhì)中IgG滲出顯著增加，提示血腦屏障受損加重，血腦屏障受損與星形膠質(zhì)細胞中HIF-α和MMP表達上調(diào)密切相關(guān)[30-31]。

SHRSP可較好地模擬人類aCSVD的臨床癥狀、影像學和病理改變，慢性低灌注的 SHRSP可進一步模擬臨床上高血壓和頸動脈狹窄共同作用導致的aCSVD。但是，該模型的遺傳背景特殊，不能排除遺傳因素對血管病變或腦實質(zhì)病變的影響。

2.2 易卒中型腎血管性高血壓大鼠（stroke-prone renovascular hypertensive rat，RHRSP） 該模型采用內(nèi)徑0.3 mm的銀夾縮窄大鼠雙側(cè)腎動脈近腹主動脈端，成功復制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)依賴的慢性高血壓。術(shù)后 12～20周 RHRSP血壓可升至～200 mm Hg，術(shù)后 6～34周，～60%的RHRSP出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，包括偏癱、四肢麻痹和癲癇發(fā)作等，其發(fā)病率顯著高于單側(cè)腎動脈狹窄模型[32]。術(shù)后20周Morris水迷宮實驗顯示 RHRSP的空間學習能力顯著受損[33-34]。MRI T2加權(quán)序列顯示嚴重腦白質(zhì)高信號病灶形成，其中以胼胝體和外囊最為顯著[34]。病理顯示其腦白質(zhì)出現(xiàn)顯著脫髓鞘、神經(jīng)纖維丟失和空泡形成，其中以胼胝體和外囊最為顯著，腦白質(zhì)中白蛋白滲出顯著增多、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞顯著增生、TNF-α水平顯著升高，提示血腦屏障受損和炎癥反應增強[33-34]。梗死或者出血病灶主要位于皮層、頂葉和枕葉腦白質(zhì)，小腦和基底節(jié)卒中灶較少見，梗死灶由小動脈閉塞引起，出血灶則由小動脈壁纖維素性壞死或者微動脈瘤破裂導致[32]。小動脈病理改變包括血管壁α-平滑肌肌動蛋白表達顯著上調(diào)、平滑肌細胞增生、膠原蛋白I/IV沉積顯著增加、管壁纖維素性壞死、透明變性、管壁增厚和管腔狹窄[32-34]，除了小動脈病變，側(cè)腦室附近的小靜脈壁膠原蛋白-I/IV沉積也顯著增加[35]。

慢性低灌注可進一步促進RHRSP的腦白質(zhì)病變，與RHRSP相比，雙側(cè)頸動脈閉塞的RHRSP的空間學習能力進一步下降，病理顯示其彌漫性腦白質(zhì)病變、內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白減少、血腦屏障受損和小靜脈壁膠原蛋白-I/IV沉積加劇[35]。

RHRSP可較好地模擬人類aCSVD的臨床癥狀、影像學和病理改變，RHRSP聯(lián)合慢性低灌注可進一步模擬臨床上高血壓和頸動脈狹窄共同作用導致的aCSVD，而且與SHRSP相比，RHRSP能夠避免遺傳因素對血管或腦實質(zhì)病變的影響。其不足是不同的大鼠個體之間腎動脈直徑存在差異，實際建模時難以統(tǒng)一腎動脈縮窄程度。

2.3 血管緊張素II（Angiotensin II，Ang II）誘導高血壓該模型使用Ang II誘導嚙齒類動物形成高血壓，既往研究通常采用皮下注射的方法間斷給藥，現(xiàn)在則主要通過皮下埋泵的方法持續(xù)給藥，給藥速度一般為400～1000 ng/（kg·min），血壓改變程度和給藥速度相關(guān)。Ang II[800～1000 ng/（kg·min）] 持續(xù)給藥 4 周后 C57Bl/6 小鼠收縮壓升至170 mmHg[36]，NORT顯示其非空間記憶能力顯著受損，常規(guī) MRI和 DTI顯示小鼠腦室體積增大、海馬萎縮、腦白質(zhì)各向異性系數(shù)值減小，但是尚未觀察到腦白質(zhì)高信號，提示白質(zhì)微結(jié)構(gòu)受損，但尚未引起顯著髓鞘脫失，這可能與觀察時間較短有關(guān)[37]。病理結(jié)果顯 Ang II誘導的高血壓小鼠的穿支動脈呈向心性重構(gòu)，表現(xiàn)為管腔狹窄和管壁/管腔比值增大[36]。此外，研究顯示腎素-血管緊張素系統(tǒng)的各個組分亦均在大腦中獨立存在，Ang II除了通過引起高血壓導致腦小血管病變之外，還可直接作用于內(nèi)皮細胞和周細胞Ang II 1型受體（angiotensin II type 1 receptor，AT1R），引起小動脈內(nèi)皮素-1合成增加，內(nèi)皮細胞功能障礙，微循環(huán)血管阻力增大[38]，并促進神經(jīng)炎癥和氧化應激反應。與AT1R不同，表達于大腦中的Ang II 2型受體（an giotensin II type 2 receptor，AT2R）具有抗神經(jīng)炎癥和神經(jīng)保護作用[39]。

Ang II誘導高血壓能夠模擬臨床高血壓引起的小動脈病變和腦白質(zhì)微結(jié)構(gòu)受損等，可用于早期腦白質(zhì)微結(jié)構(gòu)受損的研究，但是Ang II誘導高血壓僅適用于小動物，而大動物如NHP等由于體重大和觀察周期長，其藥物需求大，成本-效益比高，使得Ang II誘導高血壓在大動物中難以應用。而且，Ang II引起腦血管病變的機制并不限于高血壓，Ang II還可直接作用于大腦中的腎素-血管緊張素系統(tǒng)，使得慢性高血壓導致的aCSVD的研究變得更加復雜。

2.4 胸主動脈縮窄 MOSS等[13-15]采用血管夾夾閉恒河猴部分胸主動脈腔徑，并用縫線縫合夾閉的部分管腔，使其胸主動脈腔徑縮窄至2.0～2.5 cm，狹窄率達75%～80%。術(shù)后狹窄部位以上血壓平均水平可達170 mmHg/100 mmHg，狹窄部位以下血壓平均水平為80 mmHg/50 mmHg。術(shù)后1年，延遲樣本非匹配任務 （delayed non-matching to sample test，DNMS） 和概念變換任務 （concept set-shifting task，CSST）測試顯示術(shù)后收縮壓＞150 mmHg的恒河猴的注意力、短期記憶和執(zhí)行功能顯著受損，而術(shù)后血壓輕度升高（＜150 mmHg）的恒河猴的認知功能受損不明顯。病理結(jié)果顯示其小動脈病變主要表現(xiàn)為血管壁增厚，但纖維蛋白原滲出不明顯，并且未觀察到節(jié)段性小動脈壞死、微動脈瘤形成或動脈粥樣硬化等尚未觀察到，腦實質(zhì)病理改變主要表現(xiàn)為大腦皮層、白質(zhì)、小腦和腦干微梗死灶形成（直徑＜500 μm），以內(nèi)囊、放射冠和半卵圓區(qū)最為顯著，梗死灶形狀不一，皮層微梗死灶主要表現(xiàn)為神經(jīng)元丟失，白質(zhì)微梗死灶則表現(xiàn)為有髓纖維丟失，兩者均伴小膠質(zhì)細胞激活和星形膠質(zhì)細胞增生，但尚未觀察到顯著脫髓鞘、腔隙性梗死或微出血。不足的是，研究者未對該模型的神經(jīng)影像學改變進行動態(tài)觀察。該模型腦實質(zhì)病變以微梗死為主要病理改變的原因可能有兩個：一是微梗死為aCSVD的早期表現(xiàn)，而術(shù)后觀察時間較短，僅 1年，因此病理改變?nèi)砸晕⒐Ｋ罏橹?，尚未出現(xiàn)其他病理改變；二是胸主動脈狹窄雖然成功構(gòu)建了高血壓模型，但此時大腦處于高灌注條件下，而臨床上aCSVD患者常合并顱內(nèi)外大動脈狹窄，處于低灌注狀態(tài)，與該動物模型明顯不同，因此該動物模型無法成功復制aCSVD的病理改變。

胸主動脈狹窄恒河猴模型可模擬慢性高血壓導致的微梗死，并采用復雜的行為學評估方法對其認知功能改變進行研究，證實高血壓與執(zhí)行功能和注意能力受損密切相關(guān)。但是該模型亦具有顯著不足之處，首先，胸主動脈狹窄操作難度大，難以推廣。其次，該模型中，恒河猴腦部處于高灌注狀態(tài)，與臨床上aCSVD患者的血流動力學明顯不同。最重要的是，該模型的病理改變和aCSVD患者的病理改變?nèi)源嬖陲@著差異，其腦實質(zhì)中未出現(xiàn)腔隙性梗死或顯著腦白質(zhì)脫髓鞘病灶，小動脈病變以血管壁增厚為主，而缺乏人類aCSVD所具有的纖維素樣壞死、或透明變性等改變。

除了胸主動脈縮窄，有研究亦使用腎動脈狹窄的方法復制慢性高血壓非人靈長類動物模型，但是其所得結(jié)論不一。WOOD等[40]通過單側(cè)腎動脈狹窄構(gòu)建慢性高血壓狨猴模型，術(shù)后僅約40%的狨猴出現(xiàn)高血壓，并且在術(shù)后6周，狨猴血壓開始回落，而PANEK等[41]亦通過單側(cè)腎動脈狹窄，使腎動脈血流速度下降50%，成功復制慢性高血壓食蟹猴模型，術(shù)后4周75%（6/8）的食蟹猴血壓顯著升高，平均血壓由95 mmHg升至130 mmHg，并維持至術(shù)后 24周。GOLDBLATT[42]通過雙側(cè)腎動脈狹窄術(shù)構(gòu)建慢性高血壓獼猴模型，術(shù)后獼猴血壓顯著升高，收縮壓可達200 mmHg，但是該模型術(shù)后獼猴死亡率高，這可能與該研究使用同一大小的血管夾縮窄腎動脈有關(guān)，不同獼猴個體之間動脈直徑變異大，使用同一大小的銀夾可導致部分獼猴腎動脈嚴重狹窄，術(shù)后出現(xiàn)嚴重腎衰，導致死亡。但是，至今尚無研究觀察腎血管性高血壓非人靈長類動物模型是否存在與人類 aCSVD相似的癥狀、影像學或病理改變。

3 總結(jié)和展望

aCSVD的臨床診斷和治療仍面臨許多局限和挑戰(zhàn)，構(gòu)建能夠精確模擬人類aCSVD病理改變和臨床過程的動物模型對推動aCSVD臨床研究具有重要意義。慢性高血壓導致的aCSVD模型能較好地模擬人類aCSVD病理生理改變，目前，aCSVD動物模型的復制多采用嚙齒類動物，但嚙齒類動物的大腦解剖結(jié)構(gòu)、生理和行為學等方面與人類之間差異較大，限制了其研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化。復制慢性高血壓非人靈長類動物模型將為aCSVD的臨床前研究提供較理想的實驗工具，目前胸主動脈狹窄是用于復制慢性高血壓非人靈長類動物模型的主要方法，但是該模型腦部高灌注狀態(tài)和病理改變等與人類aCSVD仍存在明顯差異。RHRSP在aCSVD研究中的成功應用，提示雙側(cè)腎動脈狹窄導致慢性高血壓可能是構(gòu)建aCSVD非人靈長類動物模型的可行方法。