張 榮，李 菁，武永淑，李小明，董金杰，安芳蘭，劉學(xué)榮

（中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046）

佐劑在動(dòng)物和人疫苗技術(shù)中起著非常重要的作用，目前已有許多有機(jī)、無機(jī)、合成和天然來源的化合物證明具有刺激免疫反應(yīng)和有效佐劑特性的能力。其大致可以分為2類：免疫增強(qiáng)劑類（Toll樣受體激動(dòng)劑，皂苷，細(xì)胞因子）和遞送劑類（乳劑，微粒，礦物鹽）[1]。免疫增強(qiáng)劑刺激抗原遞呈細(xì)胞（APCs）促進(jìn)各種細(xì)胞因子的分泌，而遞送劑可以保存抗原的構(gòu)象并將其遞送給APCs，并為抗原的緩慢釋放提供持續(xù)的免疫刺激。例如，TLR激動(dòng)劑和其他免疫刺激物質(zhì)可增強(qiáng)免疫細(xì)胞的募集和細(xì)胞因子的分泌，而乳劑和礦物鹽可在注射部位產(chǎn)生存儲(chǔ)效應(yīng)，延長(zhǎng)抗原的釋放時(shí)間并持續(xù)刺激免疫細(xì)胞。

因?yàn)樯婕俺杀拘б?，食用?dòng)物疫苗的研發(fā)不同于人和其他動(dòng)物疫苗。從安全出發(fā)，例如在人類疫苗中Quil-A和礦物油乳劑等化合物是被限制使用的，但已被廣泛運(yùn)用于畜牧業(yè)疫苗中[2]。本文重點(diǎn)對(duì)商業(yè)化疫苗佐劑和目前正在研究的動(dòng)物疫苗佐劑進(jìn)行了概述，并探討了佐劑之間的協(xié)同效應(yīng)及其作用機(jī)制。

1 礦物鹽

鋁鹽是最早用于疫苗的佐劑之一，能誘導(dǎo)高滴度的IgG抗體，且作用時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，易于配制。鋁佐劑可以促進(jìn)白細(xì)胞介素分泌刺激Th2免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子IL-4，從而誘導(dǎo)IgG1和IgE免疫球蛋白以及嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生，因此成為抗菌和抗寄生蟲疫苗的理想候選佐劑。為了提高鋁鹽對(duì)抗病毒性疾病的有效性，它與其他佐劑聯(lián)合給藥以刺激Th1細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)的策略已在許多研究和臨床試驗(yàn)中使用[3]。鋁佐劑廣泛運(yùn)用在商用的人和動(dòng)物疫苗中，可以預(yù)防具有重要經(jīng)濟(jì)意義的動(dòng)物疫病，如新城疫和口蹄疫（FMD）等。

磷酸鈣是另一種市售礦物鹽佐劑，已運(yùn)用在對(duì)抗各種類毒素和病毒病原體的疫苗生產(chǎn)中。與鋁佐劑相比，磷酸鈣對(duì)局部組織的刺激較小，IgE抗體產(chǎn)生減少。在小鼠和豚鼠模型中，用磷酸鈣納米顆粒給藥的DNA疫苗可誘導(dǎo)足夠的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，以保護(hù)動(dòng)物免受口蹄疫的致死感染，以磷酸鈣為佐劑的新城疫滅活疫苗產(chǎn)生保護(hù)性免疫的效果低于以天然高分子殼聚糖為佐劑的疫苗[4]。

礦物鹽類佐劑在人類和動(dòng)物疫苗學(xué)研究中具有較長(zhǎng)的歷史，是相對(duì)安全和經(jīng)濟(jì)的一類佐劑[5]。雖然在對(duì)抗細(xì)胞外病原體的疫苗中表現(xiàn)出良好的佐劑性能，但在針對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染的疫苗中的應(yīng)用卻有限。

2 乳劑

當(dāng)2種不混溶的液體混合在一起時(shí)就形成了乳劑，其中一種可以組成小液滴，分散在另一種液滴中，并由兩者界面上的表面活性劑層來穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。因?yàn)槠湎鄬?duì)易生產(chǎn)，成本較低，并在產(chǎn)生抗體的應(yīng)答中表現(xiàn)出良好的效能，所以乳劑是動(dòng)物疫苗佐劑的一個(gè)優(yōu)良選擇。

不同類型的乳劑在疫苗中的作用機(jī)制也不同，油包水（W/O）乳劑是水滴在連續(xù)油相中的分散體，抗原被包裹在水相中，周圍是連續(xù)的油相，注入機(jī)體后隨著油的分解緩慢釋放，可以延長(zhǎng)免疫細(xì)胞募集和抗原加工的時(shí)間。最典型的W/O型佐劑是弗氏佐劑，它可以有效誘導(dǎo)高效價(jià)抗體應(yīng)答，但會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的不良反應(yīng)，如局部炎癥病變和疼痛等，限制了其在動(dòng)物和人疫苗中的廣泛應(yīng)用。法國(guó)SEPPIC公司的Montanide（ISA）佐劑是做得最好的商業(yè)化W/O乳劑，ISA含有提純的礦物油或角鯊烯油，與甘露醇酯作為乳化劑，副作用小，被廣泛用于獸用疫苗的生產(chǎn)和研發(fā)。例如在雞新城疫疫苗和豬肺炎支原體亞單位疫苗、豬和牛滅活口蹄疫疫苗以及由各種病毒和細(xì)菌感染的養(yǎng)殖魚類疫苗中使用的都是Montanide的W/O佐劑[6]。

對(duì)于水包油（O/W）乳劑，油滴分散在水相中，與W/O乳劑不同的是，O/W乳劑在注射部位不會(huì)形成抗原庫。O’Hagan DT等[7]對(duì)MF59（一種角鯊烯O/W疫苗佐劑）的研究揭示了O/W乳劑誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的機(jī)制，與氫氧化鋁和磷酸鈣相比，在對(duì)流感病毒刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)中，MF59具有更好的適應(yīng)性。在獸醫(yī)應(yīng)用中，一些商業(yè)化的O/W佐劑被廣泛用于家畜疫苗的制備中，來抵抗各種具有經(jīng)濟(jì)意義的細(xì)菌和病毒引起的疾病[8]。Horohov DW發(fā)現(xiàn)[9]與以磷酸鋁為佐劑的滅活馬流感疫苗相比，MetaStim對(duì)IL-12和IFN-γ的表達(dá)有較高的促進(jìn)作用。因此，與無機(jī)鹽相比，O/W乳劑是更適合用于對(duì)抗病毒病原體的疫苗佐劑。

在雙相乳劑水包油包水（W/O/W）中，含有內(nèi)部水滴的油滴分散成連續(xù)的水相，這種乳劑可以同時(shí)提供抗原從外部水相的快速釋放和從內(nèi)部水相的延長(zhǎng)釋放，可以快速、持續(xù)地刺激免疫細(xì)胞。目前市場(chǎng)上的W/O/W型乳劑還比較少，獸用疫苗中應(yīng)用最廣泛的就是Montanide ISA 201和Montanide ISA 206，與抗原在溫和條件下混合后制備疫苗，保護(hù)不同種類的牲畜免受幾種經(jīng)濟(jì)上重要的病原體（如流感病毒和口蹄疫病毒）感染[10]。

乳劑是獸用疫苗中非常有前景和市場(chǎng)的佐劑，該佐劑的成分廉價(jià)、較易獲得，如礦物油和食品級(jí)乳化劑，但乳劑的物理特性與其誘導(dǎo)動(dòng)物免疫反應(yīng)的能力之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

3 Toll樣受體激動(dòng)劑

TLRs是在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中表達(dá)的膜附著受體，能夠識(shí)別微生物的特定成分并啟動(dòng)宿主固有的防御機(jī)制。某些細(xì)菌來源的成分可以誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，TLRs的激活可以通過誘導(dǎo)特定細(xì)胞因子的表達(dá)，參與抗原特異性免疫來誘導(dǎo)T細(xì)胞的分化。

脂多糖（LPS）是一種TLR4激動(dòng)劑，能刺激APCs分泌激活Th1細(xì)胞的細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-12、IL-18等，這些細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，對(duì)抗病毒和其他細(xì)胞內(nèi)的病原體。細(xì)菌脂蛋白被TLR2識(shí)別，Rau H等[11]在CSF亞單位疫苗中使用銅綠假單胞菌膜脂蛋白OprI，OprI通過TLR2介導(dǎo)的APCs的激活和成熟促進(jìn)T細(xì)胞應(yīng)答和體液反應(yīng)。細(xì)菌鞭毛蛋白是一種TLR5激動(dòng)劑，具有佐劑特性，Qi Y等[12]將細(xì)菌鞭毛蛋白與狂犬病毒樣顆粒聯(lián)合使用時(shí)，鞭毛蛋白和不耐熱細(xì)菌腸毒素均能促進(jìn)病毒特異性中和抗體和CD4+、CD8+T細(xì)胞的產(chǎn)生。將大腸桿菌不耐熱腸毒素作為亞單位豬流感疫苗的佐劑，TLR9能夠識(shí)別細(xì)菌DNA中的CpG基序，并誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫，CpG寡脫氧核苷酸（ODNs）與TLR9相互作用，通過誘導(dǎo)IL-12和IFN-γ刺激Th1應(yīng)答[13]。細(xì)菌菌影（BGs）是由革蘭氏陰性菌的細(xì)菌空殼制備的非活細(xì)胞，是基于TLR激動(dòng)劑的另一種佐劑，不含保留細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物和表面抗原。Xia S等[14]用含有BG佐劑的嵌合載體疫苗rAdV-SFV-E2治療的豬對(duì)CSF病毒的攻擊具有完全保護(hù)，不含BG的疫苗對(duì)豬的保護(hù)作用有限，但是用添加BG佐劑的疫苗免疫豬，豬會(huì)產(chǎn)生短暫的過敏反應(yīng)。

雖然TLR激動(dòng)劑在獸藥疫苗技術(shù)中廣受研究者的關(guān)注，但其在應(yīng)用上也面臨著巨大的挑戰(zhàn)。通過病原體識(shí)別受體（PRRs）過度激活先天免疫系統(tǒng)可導(dǎo)致敗血性休克，與FIA相比，F(xiàn)CA中熱殺滅分枝桿菌的存在能促進(jìn)更高的抗體反應(yīng)，但用重組細(xì)菌鞭毛蛋白與O/W乳劑聯(lián)合應(yīng)用于抗惡性卡他熱疫苗，可在牛中誘導(dǎo)免疫抑制機(jī)制，與未接種鞭毛蛋白疫苗相比，死亡率更高[15]。因此，在安全性和有效性之間找到正確的平衡是今后佐劑研究面臨的挑戰(zhàn)。

4 免疫反應(yīng)化合物

4.1 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子是TLR激動(dòng)劑介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因子，在動(dòng)物疫苗中使用細(xì)胞因子作為疫苗佐劑正在進(jìn)行更深入的研究，這些小蛋白在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、誘導(dǎo)和指導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用。例如，IL-2、IL-12和IFN-γ可促進(jìn)Th1細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；IL-4、IL-5和IL-10可促進(jìn)Th2細(xì)胞的發(fā)育和抗體的產(chǎn)生，防御細(xì)胞外病原體；IFN-γ還可通過誘導(dǎo)APCs上主要組織相容性復(fù)合體（MHC-II）分子的表達(dá)，增強(qiáng)抗原的攝取和遞呈[16]。Fan Y等[17]用IFN-γ作為佐劑制備CSF減毒疫苗免疫豬，與單獨(dú)接種減毒疫苗組進(jìn)行比較，可顯著提高抗CSF病毒IgG抗體水平，并增加MHC-I和MHC-II的表達(dá)。

細(xì)胞因子還用在家禽、牛和魚類的各種病毒性疾病的疫苗生產(chǎn)中，Huo S等[18]在新城疫疫苗中加入了IL-18和在傳染性法氏囊病DNA疫苗中加入了IL-7。IL-18可用作?？谔阋逥NA疫苗的佐劑，誘導(dǎo)牛細(xì)胞介導(dǎo)的抗體應(yīng)答。Chang C等[19]發(fā)現(xiàn)用含有鮭魚貧血病毒蛋白和魚I型干擾素的DNA疫苗免疫大西洋鮭魚，與未使用細(xì)胞因子的DNA疫苗相比，可誘導(dǎo)更高水平的抗體及B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的流入和匯集。

4.2 皂苷

皂苷是由親脂性三萜衍生物上附著的一種或多種親水糖苷基組成的兩親性化合物，這些天然物質(zhì)在許多醫(yī)藥行業(yè)中都有應(yīng)用，皂苷具有刺激免疫反應(yīng)的能力，因此可以作為動(dòng)物疫苗佐劑。應(yīng)用最廣的皂苷佐劑是Quil-A，它是一種水溶性皂苷的非均相混合物，從南美洲本土的一種樹中提取，由于毒性較強(qiáng)，Quil-A不適合用于人類疫苗，卻被廣泛用于獸用疫苗。研究證明，在口蹄疫和豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的疫苗中，添加Quil-A的疫苗跟未添加Quil-A的疫苗相比，免疫原性顯著增強(qiáng)[20]。QS-21是皂苷的純化部分，作為佐劑正用于許多人類癌癥和傳染性疫苗的臨床試驗(yàn)中，一種商業(yè)化的貓白血病疫苗中也使用了QS-21。

Quil-A和QS-21通過刺激Th1和細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生IgG1和IgG2a抗體。在研究皂苷的結(jié)構(gòu)成分與其免疫功能之間的相互聯(lián)系方面已做了大量工作，皂苷的糖基可以與APCs上的凝集素結(jié)合，促進(jìn)抗原吞噬和刺激APCs分泌細(xì)胞因子，激活體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。對(duì)于家畜應(yīng)用而言，在自然界中尋找毒性較小的皂苷類化合物在經(jīng)濟(jì)上更可行。

4.3 聚合物

聚合物除了在疫苗中作為運(yùn)載工具保護(hù)抗原，并在注射后提供可控釋放外，有些還可以作為免疫增強(qiáng)劑，本文主要列舉一些具有免疫活性可作為獸用疫苗佐劑的天然和合成高分子物質(zhì)。殼聚糖在疫苗中主要作為抗原顆粒載體出現(xiàn)，對(duì)其免疫特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖分子可以與巨噬細(xì)胞上的甘露糖受體結(jié)合激活炎性小體，啟動(dòng)補(bǔ)體途徑。Pan L等[21]用含殼聚糖佐劑的口蹄疫疫苗滴鼻免疫牛，可防止口蹄疫病毒的直接接觸感染。

聚丙烯酸聚合物（Carbomers）如Carbopol，它的佐劑特性首次在小鼠接種試驗(yàn)中得到驗(yàn)證，目前作為佐劑應(yīng)用于抗馬流感病毒、抗豬圓環(huán)病毒2型疫苗與肺炎支原體疫苗等滅活疫苗和基于載體的獲批疫苗中。Mair KH等[22]發(fā)現(xiàn)Carbopol可有效促進(jìn)豬接種改良PRRS病毒活疫苗后IFN-γ的產(chǎn)生和T細(xì)胞的分化。此外，Carbopol能夠捕獲并緩慢釋放刺激免疫細(xì)胞的抗原分子。

聚磷腈是一類主要由磷和氮原子交替組成的無機(jī)—有機(jī)聚合物，代替抗原庫效應(yīng)，聚磷腈聚合物傾向于與抗原分子形成非共價(jià)鍵，有助于抗原遞送到APCs，使得在注射部位促炎細(xì)胞因子和趨化因子的分泌增加。雖然聚磷腈在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中結(jié)果較好，但要在畜牧動(dòng)物中大量使用數(shù)據(jù)仍有限。Dar A等[23]發(fā)現(xiàn)，與O/W乳劑疫苗相比，聚磷腈佐劑胸膜肺炎放線桿菌疫苗能提高豬IgG抗體滴度和IFN-γ的產(chǎn)量，并且在豬的注射部位不會(huì)引起炎癥。

由于聚合物比乳化劑更安全，并能誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，這對(duì)宿主抵御病毒病原體非常重要。因此，聚合物在獸用疫苗預(yù)防病毒感染中是非常有潛力的候選佐劑。

4.4 組合佐劑

在一種疫苗中同時(shí)使用2種或2種以上的佐劑可增強(qiáng)免疫效果，將幾種佐劑聯(lián)合使用已經(jīng)處于人類和動(dòng)物傳染病疫苗臨床試驗(yàn)的不同階段，Ren J等[24]評(píng)估了細(xì)菌CpG基序與O/W或W/O/W乳劑結(jié)合作為禽流感和FMD疫苗佐劑系統(tǒng)的效果，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)使用這些佐劑相比，組合佐劑可以誘導(dǎo)更高水平的中和抗體，乳劑可持續(xù)釋放抗原和CpG ODNs，從而激活I(lǐng)FN-γ分泌淋巴細(xì)胞。皂苷和乳劑的組合使用能提高口蹄疫疫苗的效力，用含有QS-21的W/O/W乳劑疫苗免疫奶牛，QS-21可加速抗FMDV中和抗體的產(chǎn)生。用皂苷和乳劑的組合佐劑制備口蹄疫疫苗免疫小鼠，Song X等[25]發(fā)現(xiàn)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生更高滴度的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗體。

雖然增強(qiáng)免疫效果的組合佐劑已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室得到驗(yàn)證，但還需要進(jìn)一步研究來確認(rèn)其在大型動(dòng)物中的安全性和有效性。此外，必須徹底評(píng)估不同佐劑對(duì)生產(chǎn)成本的影響，才能將其應(yīng)用于商業(yè)化動(dòng)物疫苗中。

5 結(jié)語

本文詳細(xì)闡述了礦物鹽、乳劑、Toll樣受體激動(dòng)劑、免疫反應(yīng)化合物及聚合物等幾種商業(yè)化佐劑的主要成分、作用機(jī)理、應(yīng)用范圍及適宜動(dòng)物等。許多天然和合成物質(zhì)都有提高動(dòng)物疫苗免疫效力的作用，可以作為佐劑使用。其中鋁化合物、乳劑、皂苷和卡波姆已經(jīng)在部分特許產(chǎn)品中商業(yè)化使用，而其他像細(xì)胞因子和聚磷腈等仍在實(shí)驗(yàn)室階段。因此，在動(dòng)物疫苗佐劑的選擇中應(yīng)考慮以下幾個(gè)因素：對(duì)目標(biāo)動(dòng)物的有效性、誘導(dǎo)一種快速并持久的保護(hù)性免疫、對(duì)動(dòng)物的安全性、是否符合食品安全法規(guī)、擴(kuò)大生產(chǎn)的可行性、成本效益等。由此看來，尋找合適的佐劑或其組合以滿足以上因素是未來動(dòng)物疫苗開發(fā)中面臨的重要挑戰(zhàn)。