劉 念 綜述,張國(guó)軍，姚群峰 審校

湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，湖北武漢430065

惡性腫瘤是對(duì)人類健康威脅最大的一類疾病，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)。惡性腫瘤的早期診斷對(duì)于臨床精準(zhǔn)治療和預(yù)后轉(zhuǎn)歸有重要意義。液體活檢是一種方便、快速、無(wú)創(chuàng)、可多次取樣的檢測(cè)方法，可以動(dòng)態(tài)反映腫瘤基因表達(dá)模式的變化,在腫瘤早期診斷及臨床治療中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。液體活檢主要是通過(guò)檢測(cè)血液等體液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、游離DNA、循環(huán)腫瘤DNA、小分子RNA、外泌體等生物分子，分析評(píng)估患者體內(nèi)腫瘤發(fā)生、發(fā)展、變化等相關(guān)情況，用于腫瘤診斷及輔助治療等。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體及其內(nèi)容物(蛋白質(zhì)、核酸、糖結(jié)合物和脂質(zhì)等)蘊(yùn)含豐富的生物學(xué)信息，特別是外泌體miRNA與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系已引起人們的高度關(guān)注，外泌體miRNA有望成為惡性腫瘤早期診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物[1-2]。

1 外泌體miRNA

外泌體是一種細(xì)胞來(lái)源的納米級(jí)的細(xì)胞外囊泡，可以通過(guò)掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡等方式觀察其形態(tài)，用納米粒子跟蹤分析測(cè)量其大小和水平。外泌體可以由許多類型的細(xì)胞主動(dòng)分泌，例如紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等[3]。在血液、尿液、胸腔積液、唾液、支氣管肺泡灌洗液和羊水等體液中都存在大量外泌體[4]。來(lái)源不同的外泌體內(nèi)含物成分不盡相同，但大都含有核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等，在細(xì)胞間信號(hào)通訊中發(fā)揮重要作用。miRNA是一類長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的小單鏈RNA，它可以通過(guò)與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)或開(kāi)放閱讀框區(qū)域結(jié)合而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在細(xì)胞增殖、分化、遷移及疾病發(fā)生和發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[5-6]。miRNA不僅存在于血液、唾液、尿液中，外泌體中也含有miRNA。外泌體miRNA因其被磷脂雙分子層保護(hù)免受RNase的降解，有利于外泌體miRNA的分離提取和儲(chǔ)存。當(dāng)外泌體循環(huán)時(shí)，外泌體中的miRNA可以被鄰近或遠(yuǎn)處的細(xì)胞吸收并調(diào)節(jié)受體細(xì)胞發(fā)揮相應(yīng)的作用，通過(guò)循環(huán)囊泡傳遞細(xì)胞間信息被認(rèn)為是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第3條途徑[7]。外泌體miRNA與許多腫瘤(包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽管癌和前列腺癌等)的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切。

2 外泌體miRNA在腫瘤分子診斷中的臨床意義

外泌體miRNA具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，它在腫瘤早期篩查、早期診斷、臨床治療和預(yù)后等方面的潛在應(yīng)用價(jià)值引起人們的高度關(guān)注。對(duì)于相同的細(xì)胞或組織，病理狀態(tài)下的外泌體水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常生理狀態(tài)下的外泌體水平，腫瘤細(xì)胞來(lái)源外泌體的種類和水平與正常細(xì)胞也存在明顯差異，體液中的外泌體miRNA在腫瘤源性細(xì)胞中也有各自的特異性表達(dá)。外泌體miRNA與肝細(xì)胞癌(HCC)[8]、胰腺癌[9]、乳腺癌[10]等惡性腫瘤的相關(guān)性研究都顯示外泌體miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、臨床分型及早期診斷等密切相關(guān)，具有十分重要的臨床意義，被認(rèn)為是一種具有廣闊前景的腫瘤生物標(biāo)志物。

2.1外泌體miRNA與肺癌 外泌體miRNA可以用于肺癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估。JIN等[11]分別檢測(cè)分析了Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者和健康個(gè)體的血漿外泌體miRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示，肺腺癌特異性表達(dá)miR-30e-3p、miR-30a-3、miR-181-5p和miR-361-5p，而肺鱗癌特異性表達(dá)miR-10b-5p、miR-320b和miR-15b-5p。相比健康個(gè)體，肺癌患者外泌體miR-181b-5p、 miR-10b-5p、miR-361b-5p和miR-320b 的表達(dá)存在明顯差異(P<0.05)。此外，腫瘤細(xì)胞外泌體miRNA還與NSCLC病理分型密切相關(guān)。LIU等[12]通過(guò)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測(cè)分析了10例肺癌患者和10例健康對(duì)照者的84種血漿外泌體miRNA，根據(jù)其報(bào)道和qPCR檢測(cè)顯示異常表達(dá)的外泌體miRNA中選擇了9種候選miRNA，以進(jìn)一步評(píng)估其在196例NSCLC患者中的預(yù)后作用，通過(guò)對(duì)患者進(jìn)行隨訪和研究分析顯示，外泌體miR-23b-3p、miR-10b-5p和miR-21-5p水平升高與總體生存不良有關(guān)(P<0.05)，與臨床預(yù)后變量模型比較時(shí)，上述3種外泌體miRNA明顯提高了生存預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，結(jié)果表明這些外泌體miRNA可以用作肺癌預(yù)后生物標(biāo)志物。劉玉山等[13]同時(shí)對(duì)NSCLC、肺炎和健康體檢者中外泌體miRNA-184的表達(dá)情況進(jìn)行比較，NSCLC患者血清外泌體miRNA-184表達(dá)水平明顯高于肺炎患者和健康體檢者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高水平miRNA-184對(duì)于NSCLC的臨床診斷效能較高。

2.2外泌體miRNA與肝癌 SOHN等[8]研究了血清外泌體miRNA作為HCC生物標(biāo)志物的可行性，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)和HCC患者的血清外泌體miRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，HCC患者血清外泌體miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224水平明顯高于CHB和LC患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HCC患者血清外泌體miR-101、miR-106b、miR-122和miR-195水平低于CHB患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。BASU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA的傳遞是HCC細(xì)胞間信息交流的一種重要方式，miR-122是肝臟特異性miRNA，它通過(guò)外泌體在Huh7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞這兩種肝癌細(xì)胞間傳輸，這兩種具有不同miR-122表達(dá)譜的肝癌細(xì)胞之間存在相互作用。

2.3外泌體miRNA與消化道腫瘤 MIN等[15]從已報(bào)道的結(jié)直腸癌標(biāo)志物中選擇了4種外泌體miRNA，包括let-7b-3p、miR-139-3、miR-145-3p和miR-150-3p，分別進(jìn)行受試者工作特征曲線分析并計(jì)算曲線下面積(AUC)，研究其表達(dá)水平差異，AUC值分別為0.792、0.686、0.692、0.679，AUC值均大于0.5,證明其可以對(duì)早期結(jié)直腸癌患者和具有各種胃腸道癥狀的非癌變對(duì)照者進(jìn)行較好地區(qū)分，對(duì)于診斷結(jié)直腸癌有一定價(jià)值。與選用單個(gè)外泌體miRNA生物標(biāo)志物相比，選擇多種miRNA的組合可獲得更高的對(duì)早期結(jié)直腸癌患者的診斷特異度[16]，let-7b-3p和miR-145-3p組合的AUC為0.901，miR-139-3p、miR-145-3p和let-7b-3p組合的AUC為0.927。MADHAVAN等[17]研究報(bào)道了胰腺癌患者血清外泌體miRNA水平，相比健康對(duì)照組和非惡性疾病患者，83%的胰腺癌患者血清外泌體miR-1246、miR-4306和miR-4644水平明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示胰腺腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體miRNA水平上升有助于胰腺癌的臨床診斷。

2.4外泌體miRNA與其他腫瘤 MENG等[18]測(cè)定了上皮來(lái)源的卵巢癌患者血清外泌體miRNA，發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血清外泌體miR-375、miR-200a、miR-200b和miR-200c表達(dá)水平明顯高于健康女性，且miR-200a、miR-200b和miR-200c的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度相關(guān)。血清外泌體miRNA和血清標(biāo)志物糖類抗原125聯(lián)合應(yīng)用可明顯提高卵巢癌診斷的特異度和準(zhǔn)確度。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)來(lái)源的外泌體miRNA的表達(dá)譜與正常組織細(xì)胞存在較大差異。MANTEROLA等[19]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-320和miR574-3p組合可以將GBM患者與健康個(gè)體區(qū)分，聯(lián)合應(yīng)用可作為診斷GBM的生物標(biāo)志物。此外，GBM不同的亞型也表現(xiàn)出不同的外泌體miRNA表達(dá)譜，外泌體及其miRNA被認(rèn)為是GBM分子分型的調(diào)節(jié)者。在前列腺癌患者中外泌體miR-182和miR-183呈高表達(dá)[20]，而外泌體miR-375和miR-1290可用于前列腺癌患者的預(yù)后評(píng)估[21]。

3 外泌體miRNA分離富集與檢測(cè)

3.1外泌體分離富集 不同的標(biāo)本類型和研究目的應(yīng)選擇不同的外泌體分離富集方法，超速離心是使用最廣泛的外泌體提取方法，但存在所需樣品量大、處理時(shí)間長(zhǎng)和雜質(zhì)較多等缺點(diǎn)[22]；商業(yè)化試劑盒法所需時(shí)間較短且可在低離心力下分離，但對(duì)外泌體缺乏特異性；聚乙二醇(PEG)共沉淀方法是在4 ℃用PEG孵育樣品過(guò)夜，然后低速離心分離，可快速分離富集外泌體，但存在外泌體純度和回收率低的問(wèn)題。通過(guò)免疫磁珠法獲得外泌體后，直接用裂解液處理可得到其中的miRNA，該方法提取的外泌體特異度和純度均較高，且不影響外泌體的結(jié)構(gòu)，但其不適合在大量樣本中獲取外泌體，且價(jià)格昂貴，難以保存。

3.2外泌體miRNA檢測(cè) 目前，外泌體miRNA檢測(cè)最常用的方法還是反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)，RT-qPCR靈敏度較高，特異度較好，方法成熟，被認(rèn)為是miRNA檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。微陣列芯片法可以實(shí)現(xiàn)miRNA的高通量測(cè)定，更適合用于比較不同的細(xì)胞狀態(tài)之間miRNA的表達(dá)水平，但其檢測(cè)范圍較小[23]。此外，近年來(lái)基于電化學(xué)的納米生物傳感技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于miRNA的檢測(cè)。LIU等[24]使用肽核酸和球形核酸協(xié)同的“三明治”結(jié)構(gòu)的電化學(xué)傳感器檢測(cè)外泌體miRNA，具有高靈敏度和高特異度，能準(zhǔn)確進(jìn)行免疫標(biāo)記且不依賴酶的miRNA檢測(cè)。MAJD等[25]利用二硫化鉬來(lái)修飾場(chǎng)效應(yīng)晶體管(FET)，構(gòu)建的FET生物傳感器可實(shí)現(xiàn)免疫標(biāo)記超敏感檢測(cè)miRNA-155。RAMSHANI 等[26]將基于表面聲波外泌體裂解微流體芯片與濃縮傳感微芯片集成在一起，構(gòu)建微流控平臺(tái)來(lái)檢測(cè)miRNA，這種新的集成系統(tǒng)不需要預(yù)處理或分析物轉(zhuǎn)移，并且縮短了測(cè)定時(shí)間，此類微芯片系統(tǒng)通過(guò)利用高性能材料構(gòu)建納米生物傳感平臺(tái)，并通過(guò)多重信號(hào)放大，可以實(shí)現(xiàn)外泌體miRNA快速、靈敏和特異性檢測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 展 望

綜上所述，外泌體miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、臨床分型及早期診斷等均有十分緊密的關(guān)系，而且在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中外泌體會(huì)不斷釋放到外周環(huán)境中去，因此，可以通過(guò)檢測(cè)體液中外泌體miRNA用于腫瘤的早期診斷、臨床治療和預(yù)后判斷。相比其他腫瘤早期診斷指標(biāo)及檢測(cè)方法，外泌體miRNA作為腫瘤生物標(biāo)志物有以下優(yōu)勢(shì)：(1)體液樣品比較容易獲得，液體活檢取材方便，能夠減少取材風(fēng)險(xiǎn)；(2)由于外泌體膜能保護(hù)miRNA免受RNA酶的影響，因此外泌體miRNA比血漿miRNA更穩(wěn)定；(3)與血漿miRNA相比，外泌體包含更高水平的miRNA，如let-7、miR-1、miR-181和miR-375等，更易于檢測(cè)。目前，有關(guān)外泌體miRNA在腫瘤的診斷與治療中的應(yīng)用還有待更進(jìn)一步的深入研究。一方面是還需要開(kāi)展大樣本量的基礎(chǔ)研究，提高目標(biāo)miRNA與不同類型腫瘤之間的特異度，特別是需要構(gòu)建不同的外泌體miRNA組合與特定腫瘤的相關(guān)性表達(dá)譜[27-28]；其次還需要深入研究不同種類的miRNA與腫瘤不同發(fā)展轉(zhuǎn)化階段的相關(guān)性，篩選出真正的具有早期診斷意義的miRNA；此外，還需要進(jìn)一步完善外泌體miRNA的檢測(cè)方法，特別是需要發(fā)展建立操作簡(jiǎn)便、快速靈敏、重現(xiàn)性好的、新的外泌體miRNA檢測(cè)方法，這將有助于推動(dòng)外泌體miRNA的臨床應(yīng)用[29]。