王姣 李嵐 余昌胤△

(1.首鋼水鋼總醫(yī)院腦科中心，貴州 六盤水 55300；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

1 hUSCs的神經(jīng)生物學(xué)特性

1.1hUSCs的來(lái)源及特征 尿液獲取hUSCs具備非侵入性、無(wú)限性，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)尿液中可提取出USCs，但實(shí)驗(yàn)中各方面原因?qū)е滤@得的USCs計(jì)數(shù)約有差異。有研究發(fā)現(xiàn)人體24 h內(nèi)泌尿系統(tǒng)中大約有6×104個(gè)細(xì)胞的更替[1]。Bharadwaj等[2]從上尿路尿液標(biāo)本中獲得的USC，發(fā)現(xiàn)每個(gè)USCs克隆30 d內(nèi)在第5代(P5)時(shí)產(chǎn)生約4×108個(gè)細(xì)胞，其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示上尿路的尿液1 mL尿含有約1.4+0.7個(gè)USCs克隆。Lang等[1]通過(guò)對(duì)保存24 h的尿液標(biāo)本所獲得的USCs與新鮮尿液標(biāo)本所獲USCs進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)在每100 ml尿液樣本中，保存24 h的尿液中有3～4個(gè)USCs克隆、12 h的尿液中有4～5個(gè)克隆、新鮮尿液中有6～7個(gè)克隆。實(shí)驗(yàn)中Lang等人從新鮮和24 h保存的尿液標(biāo)本(保存在含有0.5%血清和10%血清的USC培養(yǎng)基中)收集了30個(gè)USC克隆(每組10個(gè))進(jìn)行端粒酶活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)半數(shù)(5/10)保存細(xì)胞克隆具有較高的端粒酶活性，而(4/10)新鮮USCs具有端粒酶活性，均為正常核型。也有研究表明[3]，75%以上的中老年個(gè)體端粒酶活性(USC-TA+)表達(dá)，并保留長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度，但在50歲或50歲以上的hUSCs的USCs-TA+下降到50%～60%。近年來(lái)，隨著基于干細(xì)胞研究的快速發(fā)展，干細(xì)胞的多項(xiàng)分化特性，目前多項(xiàng)研究[4-6]證實(shí)在特定的培養(yǎng)基中可培養(yǎng)出連續(xù)傳代且核型穩(wěn)定的hUSCs，并在融合率80%左右的第4代hUSCs分別加入成脂、成骨、成神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)液后，誘導(dǎo)12 d、14 d、21 d后經(jīng)染色鑒定后可證實(shí)hUSCs可成功分化為成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞。

1.2hUSCs的神經(jīng)分化條件 2008年張?jiān)淌赱7]首次成功地分離培養(yǎng)出三種不同形態(tài)的表現(xiàn)為完全分化、分化、祖細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞，證實(shí)了只有紡錘體外觀的小細(xì)胞類型被命名為人尿源性干細(xì)胞(hUSCs)，將提取出的hUSCs通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)志物(SSEA 4、CD 105、CD 73、CD 90和CD 44)呈陽(yáng)性，說(shuō)明hUSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞相似特性。hUSCs一旦被分離后，可在體外連續(xù)擴(kuò)增，并在不同的實(shí)驗(yàn)條件下加入不同的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)后通過(guò)特異性誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞類型，通過(guò)在補(bǔ)充堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)USCs，獲得神經(jīng)元細(xì)胞[8]。研究表明層粘連蛋白和PDGF-bb參與神經(jīng)元的生長(zhǎng)和分化[9]，神經(jīng)元祖細(xì)胞在PDGF-BB刺激后，可使miR-9(microRNA-9)表達(dá)增加，而PDGF-bb介導(dǎo)的mir-9/MCPIP1通過(guò)抑制miR-9靶點(diǎn)MCPIP1(monocyte chemotactic protein-induced protein 1 )調(diào)節(jié)神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖、分化和遷移[10]，表明調(diào)節(jié)miR-9/mcp 1軸的治療策略的制定可以被認(rèn)為是一個(gè)涉及促使神經(jīng)發(fā)生受損的各種神經(jīng)退行性疾病的治療潛在的靶點(diǎn)。故Kim JY[9]等將hUSCs在神經(jīng)元分化培養(yǎng)基中分別及共同加入層粘連蛋白和PDGF-bb誘導(dǎo)神經(jīng)元分化，培養(yǎng)14 d后，hUSCs表現(xiàn)為神經(jīng)元樣形態(tài)改變，包括錐體細(xì)胞體、軸突樣結(jié)構(gòu)和樹(shù)突，在上述所有3種誘導(dǎo)條件下均能觀察到神經(jīng)元樣細(xì)胞，其中神經(jīng)元分化培養(yǎng)基(DM)+層粘連蛋白+PDGF-bb處理組神經(jīng)元細(xì)胞最多。提示層粘連蛋白和PDGF-bb可刺激hUSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化。Chun等[10]研究指出hUSCs體外培養(yǎng)時(shí)在I型膠原和缺氧條件下可刺激細(xì)胞增殖，保留干細(xì)胞特性，但分化受到抑制。

1.3hUSCs自身表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性蛋白 Jung Yeon Kim等[9]應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR分析及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí)hUSCs可表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記蛋白巣蛋白(Neuroepithelial stem cell protein，Nestin)、微管相關(guān)蛋白2(Microtubule-associated protein 2，MAP-2)、微管蛋白β(β-Tubulin-Ⅲ)、神經(jīng)絲蛋白(Neurofilamentprotein，NF-M)和神經(jīng)元特異性核蛋白(Neuron specific nuclear protein，NeuN)，并用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)到hUSCs表達(dá)Nestin、MAP-2、β-Tubulin-Ⅲ和NF-M等神經(jīng)元標(biāo)記蛋白。而且，在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)后檢測(cè)到SOX2和Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，且在RT-PCR基因表達(dá)分析表明，神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)記Nestin和SOX2顯著增加[5-6]，而成熟神經(jīng)元標(biāo)記β-Tubulin-Ⅲ未被上調(diào)[5]，提示hUSCs可分化為神經(jīng)祖細(xì)胞。約40%的誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)多種神經(jīng)標(biāo)記物，如Nestin、S100、NF 200和GFAP，在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出神經(jīng)源性的延伸和突起[5]。龔飛翔[6]通過(guò)q-PCR檢測(cè)比較hUSCs經(jīng)神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d和12 d后的神經(jīng)標(biāo)志物的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)12 d后SOX2(神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)志物)和GFAP(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)的表達(dá)上調(diào)，而NSE和MAP-2(成熟神經(jīng)元標(biāo)志物)的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示hUSCs經(jīng)神經(jīng)誘導(dǎo)前未見(jiàn)明顯Nestin和SOX2陽(yáng)性細(xì)胞，誘導(dǎo)后7 d和12 d其表達(dá)量明顯增加，且在12 d時(shí)仍在繼續(xù)增加。上述研究均提示hUSCs具有分化為與神經(jīng)元相似的神經(jīng)生物學(xué)特性。

1.4hUSCs神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用 多項(xiàng)體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，各種細(xì)胞生長(zhǎng)因子及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在神經(jīng)細(xì)胞存活、增殖及分化調(diào)節(jié)中具有至關(guān)重要的作用，這些生長(zhǎng)因子主要包括：表皮生長(zhǎng)因子家族(Epidermal growth factor，EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(Leucocyte inhibitory factor，IGF)、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor，NGF)，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)等；這些細(xì)胞因子可誘導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)元定向分化。堿性成纖維生長(zhǎng)因子( Basic fibrolast growth factor, bFGF) 是廣泛存在于干細(xì)胞中的一種多肽物質(zhì)，是酪氨酸激酶的胞外配體，具有傳遞發(fā)育信號(hào)和修復(fù)組織的作用，同時(shí)可調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞增殖分化過(guò)程，Perez-Ilzarb等[11]通過(guò)探討比較人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)的體外擴(kuò)增培養(yǎng)條件時(shí)發(fā)現(xiàn)高濃度的bFGF可明顯促進(jìn)hMSCs增殖，而低濃度bFGF則可誘導(dǎo)hMSCs向神經(jīng)細(xì)胞的定向分化。故實(shí)驗(yàn)中在無(wú)血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入bFGF、EGF可有效地使hUSCs穩(wěn)定增殖且不影響神經(jīng)元標(biāo)志物的表達(dá)。hUSCs在良好的微環(huán)境下可分泌細(xì)胞因子，最近，有研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)因子(VEGF、IGF-1、FGF-1、PDGF、HGF和NGF)從海藻酸鈉微球中局部釋放出來(lái)[12]，誘導(dǎo)hUSCs的功能分化，增強(qiáng)血管再生及神經(jīng)支配，并刺激體內(nèi)駐留細(xì)胞的生長(zhǎng)。表明hUSCs與其他干細(xì)胞一樣具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。

1.5hUSCs外泌體 外泌體(Exo)屬于細(xì)胞外囊泡(EV)的一種，是由細(xì)胞膜內(nèi)陷形成胞內(nèi)小泡，小泡膜經(jīng)過(guò)胞漿內(nèi)各種酶類的修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)、融合，最后通過(guò)胞吐的方式排到胞外。外泌體包含有mRNA、miRNA及蛋白質(zhì)等多種小分子的小囊泡。幾乎所有細(xì)胞均可產(chǎn)生外泌體，有研究證實(shí)[13]Exo還包含有HGF、BDNF、VEGF、ICF、NGF，且ICF、HGF含量較高，推測(cè)這兩鐘細(xì)胞因子可能對(duì)神經(jīng)損傷有保護(hù)作用，并且其保護(hù)作用可能是通過(guò)凝脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路實(shí)現(xiàn)的。Jiang等[14]通過(guò)超濾組合純化方法分離來(lái)自尿源干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的外泌體(USCs-Exo)，并在透射電子顯微鏡(TEM)下可以看到USCs-Exo是約100 nm的球形囊泡，可調(diào)電阻脈沖傳感(TRPS)分析顯示USCs-Exo的大小約為50-100 nm，與TEM一致。Western印跡顯示USCs-Exo中表達(dá)CD9，CD63和CD81等外泌體標(biāo)記物，該研究進(jìn)一步進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)證實(shí)了USCs-Exo含有促進(jìn)血管生成及細(xì)胞存活的細(xì)胞因子包括足細(xì)胞存活因子(BMP-7)和血管生成相關(guān)蛋白(VEGF，TGF-β1和血管生成素)。上述研究提示外泌體可能是神經(jīng)保護(hù)作用或治療中的關(guān)鍵組件。

2 hUSCs對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的應(yīng)用

hUSCs是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型干細(xì)胞，有研究證實(shí)hUSCs在替換衰老、受損細(xì)胞方面以及促進(jìn)器官組織再生方面均發(fā)揮著重要作用。而且以前有研究證實(shí)MSCs免疫原標(biāo)記HLA-DR(II類MHC)在極少(<3%)的細(xì)胞中表達(dá)，說(shuō)明免疫排斥反應(yīng)較低[15]，且應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)HLA-DR(II類MHC)表達(dá)增強(qiáng)[16]。hUSC與MSCs具有相似特性，其移植后也可能無(wú)排斥而具有良好的安全性，提示hUSC可作為細(xì)胞移植治療的潛在細(xì)胞。

Guan等[5]首次探討hUSC應(yīng)用于神經(jīng)元再生的治療，實(shí)驗(yàn)通過(guò)與ASCs比較，證明hUSC與ASCs具有相識(shí)的生物學(xué)特性，可在體外分化為神經(jīng)細(xì)胞，該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)染第4代USCs，然后將GFP標(biāo)記的hUSC(GFP-hUSC陽(yáng)性細(xì)胞)種植在BeaverNano水凝膠支架上，在腦損傷后的8周齡SD大鼠病變部位注射含有1×106GFP-hUSC的100ml水凝膠，移植3周后，可見(jiàn)GFP陽(yáng)性細(xì)胞聚集在病灶周圍區(qū)域，而在海馬區(qū)也發(fā)現(xiàn)GFP陽(yáng)性細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)移植的GFP陽(yáng)性細(xì)胞也能表達(dá)β-Tubulin-Ⅲ、GFAP和Nestin等神經(jīng)分化標(biāo)記物，說(shuō)明hUSC大鼠腦內(nèi)具有生存、遷移及神經(jīng)分化能力。龔飛翔[6]將hUSCs通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染標(biāo)記GFP后移植到腦損傷模型大鼠腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)移植1W、3W后均可見(jiàn)GFP-hUSCs陽(yáng)性細(xì)胞從腦損傷區(qū)遷移至海馬區(qū)，并且在海馬區(qū)分別在移植1W后檢測(cè)到Nestin陽(yáng)性細(xì)胞及移植3W后檢測(cè)到β-Tubulin-Ⅲ、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，證實(shí)了hUSCs腦內(nèi)移植后的存活、遷移以及分化能力，表明hUSC是具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后功能修復(fù)的潛在細(xì)胞。

3 展 望

hUSCs是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的從尿液中分離提取的一種新型干細(xì)胞。目前，研究發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)性腦卒中模型中移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可減少神經(jīng)元損傷和梗塞體積，增加血管生成和神經(jīng)發(fā)生，改善神經(jīng)功能。由于其在臨床前模型中的有益作用，已開(kāi)始使用MSCs進(jìn)行對(duì)照隨機(jī)臨床試驗(yàn)以治療腦卒中，最長(zhǎng)觀察5年沒(méi)有發(fā)現(xiàn)臨床相關(guān)的副作用[17]。由于干細(xì)胞及祖細(xì)胞均能分泌因子(外泌體)促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)，DOEPPNER團(tuán)隊(duì)[18]將MSC-EV和MSC移植到短暫局灶性腦缺血模型小鼠，研究結(jié)果顯示，MSC-EV與MSC均能有效地改善神經(jīng)損傷，并誘導(dǎo)與增強(qiáng)的血管神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的長(zhǎng)期神經(jīng)保護(hù)作用，且兩者效果相似，因此他們認(rèn)為EV是MSCs促進(jìn)卒中后恢復(fù)的關(guān)鍵組成部分。hUSCs無(wú)侵入性、易獲取，具有干細(xì)胞的生物學(xué)特性，目前僅有為數(shù)不多的研究將hUSCs用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，但在腦缺血、神經(jīng)系統(tǒng)變性及退行性疾病等相關(guān)研究值得進(jìn)一步深入探討。