李旭，董煒靈，宋阿琳，李艷玲，盧玉秋，王恩召，劉雄舵，王萌，范分良

秸稈添加量對土壤生物固氮速率和固氮菌群落特征的影響

李旭，董煒靈，宋阿琳，李艷玲，盧玉秋，王恩召，劉雄舵，王萌，范分良

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物營養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081

【】研究不同秸稈添加量對土壤固氮速率及固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為我國秸稈還田及化肥減施增效提供支持。采用室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)，除對照（C0: 0）外共設(shè)5個(gè)秸稈添加梯度（C1：0.2mg·g-1；C2：1.0mg·g-1；C3：2.0mg·g-1；C4：4.0mg·g-1；C5：10.0mg·g-1），采用15N2標(biāo)記的方法，在黑暗條件下培養(yǎng)28d后收集土壤樣品，進(jìn)而對生物固氮速率進(jìn)行定量，利用Illumina PE250高通量測序和熒光定量PCR技術(shù)分析固氮功能基因的豐度及群落特征。隨著秸稈添加量的增加，土壤硝態(tài)氮含量顯著下降，銨態(tài)氮含量無顯著變化，土壤pH有下降趨勢。同時(shí)，生物固氮速率顯著增加，C3、C4及C5處理在培養(yǎng)期間（28d）潛在固氮速率為87—96kgN·hm-2·a-1，相比于對照提高了38.1%—52.4%。各處理固氮微生物基因拷貝數(shù)變化范圍為5.48×107—9.20×107copies/（g soil），其中，相比于C0，C4及C5處理固氮微生物基因拷貝數(shù)均顯著提高（＜0.05）。隨著秸稈添加量的增加，C4、C5水平的香農(nóng)-威爾指數(shù)顯著低于其他4個(gè)處理（＜0.05），其他4個(gè)處理多樣性無顯著差異。主成分分析（PCoA）結(jié)果顯示土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)主要因秸稈添加量差異而聚集為不同組別。固氮微生物在門水平上分為變形桿菌（Proteobacteria），藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria），厚壁菌（Firmicutes）和放線菌（Actinobacteria）和螺旋體菌（Spirochaetes）。隨著秸稈添加量的增加，藍(lán)細(xì)菌相對豐度有先增加再降低的趨勢；在屬水平上，不同優(yōu)勢菌屬對秸稈添加量的響應(yīng)存在明顯差異，慢生根瘤菌（）為數(shù)量最豐富菌屬，隨著秸稈添加量的增加，C5相較于C0、C1、C2、C3水平相對豐度差異顯著（＜0.05），顯著增加了12.07%—14.13%。與生物固氮速率呈正相關(guān)的賀氏偽枝藻屬（）隨著秸稈添加量的增加其相對豐度逐漸增加，但當(dāng)秸稈添加量達(dá)C5水平其相對豐度反而降低（＜0.05）。同時(shí)，最小偏二乘路徑分析（PLS-PM），冗余分析(RDA)及相關(guān)性分析表明生物固氮速率和土壤固氮微生物群落受秸稈添加量和NO3--N含量影響較大。土壤生物固氮速率隨著秸稈添加量的增加而增加，秸稈對固氮的促進(jìn)作用主要源于秸稈添加降低了土壤NO3--N含量，進(jìn)而促進(jìn)慢生根瘤菌（）、賀氏偽枝藻屬（）和固氮螺菌屬（）等固氮菌屬微生物的生長。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算，相比于不添加秸稈，添加秸稈4.0mg·g-1后，土壤生物固氮速率約增加26kg N·hm-2·a-1，可顯著降低我國氮肥需求。

固氮微生物；秸稈還田；固氮速率；15N2定量；

0 引言

【研究意義】生物固氮通過少數(shù)固氮原核微生物體內(nèi)的固氮酶系統(tǒng)，將大氣中的N2催化轉(zhuǎn)化為植物可利用的形式，每年可為農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)提供氮素輸入40—70 Tg N，是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中氮素的重要來源之一[1-4]。生物固氮分為共生固氮和非共生固氮。據(jù)報(bào)道，作物生物量中約有24%的氮素來自非共生固氮[5-6]。近年來，過度施用氮肥導(dǎo)致的一系列環(huán)境問題和不斷增加的經(jīng)濟(jì)成本都要求我們盡可能提高生物固氮的潛力[7-9]。秸稈還田后可補(bǔ)充大量有機(jī)碳源和能量，改善土壤理化性質(zhì)并提高土壤細(xì)菌和非共生固氮微生物的數(shù)量和活性[10-11]，從而促進(jìn)生物固氮[12-13]。因此，充分利用秸稈資源，發(fā)揮非共生固氮微生物的固氮潛力對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)氮素輸入及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】非共生固氮微生物的群落組成及其固氮酶活性受到土壤水分和溫度，土壤質(zhì)地及pH，微量元素，養(yǎng)分有效性（N、P）和碳源可利用性等多種土壤和環(huán)境因子的綜合影響[14-18]。由這些因素引起的固氮微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)的變化，可較好地反應(yīng)其生物固氮的能力[15,19-20]。一些研究表明土壤中固氮酶活性與可利用的植物殘茬量和分解率成正相關(guān)[21-23]，作物秸稈還田后可以改變固氮群落結(jié)構(gòu)的組成，增加基因豐度并促進(jìn)生物固氮[14,20,24-27]，但在一些研究中這種關(guān)系還不明確[28-29]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)固氮速率顯示出對固氮微生物多樣性增加的飽和趨勢[15]。有研究表明，在作物秸稈投入的情況下，非共生固氮微生物的固氮潛力可在2—4周的短時(shí)間內(nèi)達(dá)到1—12 kg N·hm-2[21,30]；另一項(xiàng)測量澳大利亞非共生固氮潛力的研究表明，非共生固氮對作物生長的貢獻(xiàn)可能小于10 kg N·hm-2·a-1，但在土壤氮含量較低且碳源充足的情況下，固氮效率可能會(huì)更高，在理想（溫暖，潮濕）條件下新鮮秸稈投入，或可使固氮潛力高達(dá)30—38 kg N·hm-2·a-1[11,31]。目前關(guān)于秸稈投入對非共生固氮影響的研究說法不一，可能是由兩方面原因造成：秸稈還田量不同，已有的研究秸稈還田多為全量添加或非限制性的[11-21]，例如Roper在早期田間試驗(yàn)中，秸稈還田量為4.5 t·hm-2，測得固氮速率約為1.1 kg N·hm-2·a-1，關(guān)于不同秸稈添加量與固氮微生物固氮速率的定量研究少之又少；關(guān)于非共生固氮微生物的固氮能力的研究，絕大多研究采用乙炔還原法（ARA）間接測定，但可能會(huì)造成固氮速率的錯(cuò)誤估計(jì)，由于測定條件的影響，乙炔還原法（ARA）中C2H2﹕N2的比值可能明顯偏離理論轉(zhuǎn)換因子，須使用15N2方法對其進(jìn)行校正[32]，15N2方法作為定量生物固氮潛力的唯一直接方法，有著良好的靈敏度和精確度[33]。以往的研究表明，變形桿菌（Proteobacteria）和藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）是土壤中豐富的固氮微生物[34]；同時(shí)參與分解玉米秸稈和固氮過程的包括根瘤菌（）、中華根瘤菌（）及部分未培養(yǎng)的固氮微生物[35]。受限于多數(shù)固氮菌難以培養(yǎng)及早期克隆測序不能全面了解固氮菌群落特征，秸稈投入如何影響固氮菌群落特征仍需進(jìn)一步探索?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】上述研究表明，土壤固氮微生物對秸稈投入數(shù)量的響應(yīng)有差異，同時(shí)測定方法也存在局限。近年來，隨著我國“減肥增效”政策的推進(jìn)，秸稈還田引起人們的廣泛關(guān)注，在促進(jìn)生物固氮能力方面，我們對于秸稈還田后如何影響固氮微生物群落及其固氮酶活性仍缺乏清晰地認(rèn)識，同時(shí)由于多數(shù)固氮微生物難以培養(yǎng)，使用15N2同化方法，高通量測序等方法對秸稈還田促進(jìn)生物固氮能力進(jìn)行研究勢在必行?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用15N2方法，揭示秸稈添加量與土壤固氮速率和固氮菌群落特征的關(guān)系，以期為秸稈還田促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試土樣取樣自河南省洛陽市孟津縣旱地耕層土（0—20 cm）（北緯N34°52′55.74″，東經(jīng)E112.24′14.98″），土壤類型為潮土，其基礎(chǔ)理化性質(zhì)為：土壤pH為6.89，土壤有機(jī)質(zhì)36.95 g·kg-1，銨態(tài)氮含量8.80 mg·kg-1，硝態(tài)氮含量11.00 mg·kg-1，速效磷28.47 mg·kg-1，有效鉀210 mg·kg-1，土壤過2 mm篩，去除植物殘根和石塊等雜質(zhì)，混勻備用。

土壤預(yù)培養(yǎng)（25℃，黑暗條件）7 d后，準(zhǔn)確稱取5.0 g干土等重的鮮土于20 mL滅菌螺口玻璃瓶中，除對照（C0：0）外分別添加粉碎玉米秸稈（C1：0.2 mg·g-1；C2：1.0 mg·g-1；C3：2.0 mg·g-1；C4：4.0 mg·g-1；C5：10.0 mg·g-1），混合均勻后，加入1.20 mL無菌水平衡水分至60%田間持水量，隨后加橡膠塞用鋁蓋旋緊并檢查氣密性。15N2處理使用真空泵將玻璃瓶抽成真空，用純O2反復(fù)置換3次以保證瓶中不含N2，隨后瓶內(nèi)氣體被置換為15N2﹕O2（v/v= 4﹕1），每7天按照上述方法重新置換氣體，為避免可能的污染和對固氮速率的高估[36]，15N2氣體使用前均采用OHYAMA等[37]的方法進(jìn)行清洗后使用。采用實(shí)驗(yàn)室空氣作為對照，每7天敞口曝氣30 min，所有處理黑暗條件下25℃培養(yǎng)28 d。

1.2 樣品采集及指標(biāo)測定

在培養(yǎng)第28天對樣品進(jìn)行破壞性取樣，土壤取出后混合均勻，一部分4℃保存，用于理化性質(zhì)及固氮速率測定，待測完無機(jī)氮后，風(fēng)干磨細(xì)用于其他土壤理化指標(biāo)的測定，其中NO3--N和NH4+-N使用0.01mol·L-1CaCl2浸提，后續(xù)比色測定；土壤速效磷用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提，鉬銻抗比色法測定；土壤速效鉀用1mol·L-1醋酸銨浸提，原子吸收儀測定；土壤pH用快速pH測定儀測定；土壤有機(jī)質(zhì)采用K2Cr2O7氧化外加熱法；稱取少量15N2處理土壤，置于烘箱70℃烘干72 h，隨后研磨過100目篩后送樣，使用元素分析儀串聯(lián)同位素質(zhì)譜儀（IsoPrime100）測定土壤樣品中的15N豐度。然后，通過比較15N2處理的土壤相對于對照原子豐度的差異，計(jì)算生物固氮（biological N2fixation），計(jì)算公式如下：

BNF（μg·g-1DW）= total Nsample（μg·g-1DW）×atom%15Nexcess

式中，BNF（μg·g-1DW）為生物固氮量；atom%15Nexcess=atom%15Nsample-atom%15Ncontrol；total Nsample為總氮含量。另一部分存于-80℃，用于土壤DNA提取。

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序

使用FastDNA SPIN Kit for Soil 試劑盒（MP Biomedicals，USA）提取土壤總DNA，隨后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)DNA提取質(zhì)量，用NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）檢測其濃度和純度，保存至-20℃?zhèn)溆谩?/p>

將提取的DNA原液稀釋至約10 ng·μL-1作為PCR擴(kuò)增模板，采用two-step PCR法進(jìn)行擴(kuò)增。第一輪擴(kuò)增引物為帶有16 bp頭部序列的polF（TGC GAY CCS AAR GCB GAC TC），polR（ATS GCC ATC ATY TCR CCG GA），擴(kuò)增體系為25 μL，包含：2.5 μL 10×buffer，2 μL dNTP，0.25 μL rTaq（Takara）、10 μmol·L-1的前后引物各1 μL、1 μL模板DNA和17.25 μL ddH2O，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。第一輪PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min后，95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)40次，循環(huán)結(jié)束后72℃保持10 min，4℃條件下結(jié)束。將同一樣本的3次重復(fù)的DNA擴(kuò)增混勻后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。第二輪擴(kuò)增使用第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板DNA，前引物為長度為16 bp的不同barcode引物，后引物為polR（ATS GCC ATC ATY TCR CCG GA），擴(kuò)增體系為50 μL，包括：5 μL 10×buffer，4 μL dNTP，0.5 μL rTaq（Takara）、10 μmol·L-1的前后引物各2 μL、2 μL模板DNA和34.5 μL ddH2O，每個(gè)樣品3次重復(fù)，擴(kuò)增程序循環(huán)次數(shù)為10次，其他設(shè)定同第一輪。擴(kuò)增引物及策略參照GABY等[38-39]的方法。

將同一樣本的3次重復(fù)的DNA擴(kuò)增混勻后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用PicoGreen試劑盒測定所得PCR產(chǎn)物濃度，等摩爾量混勻后，采用DNA純化試劑盒（TIANGEN Biotech，Beijing，China）進(jìn)行純化回收，按照每個(gè)樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合?；旌虾蟮臉悠吠ㄟ^Illumina Hiseq2500 PE250平臺（Novogene公司）進(jìn)行序列測定，測序數(shù)據(jù)已上傳至GSA數(shù)據(jù)庫（GSA編號：CRA002883）。

1.4 絕對定量PCR（qPCR）

qPCR采用ABI 7900實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行檢測，選用的熒光試劑是SYBR Premix Ex TaqTMⅡ。qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法如下：以對照組土樣提取DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物是ploF（TGC GAY CCS AAR GCB GAC TC）和polR（ATS GCC ATC ATY TCR CCG GA），體系如上所述，檢查PCR產(chǎn)物并使用DNA純化試劑盒（TIANGEN Biotech，Beijing，China）純化回收產(chǎn)物；使用pMDTM18-T Vector Cloning Kit（TaKaRa Bio Inc.）試劑盒將回收純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18載體連接；最后使用MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0（TaKaRa Bio Inc.）質(zhì)粒純化試劑盒對菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取與純化，使用NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）檢測其濃度和純度，計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)并逐步稀釋到108—101拷貝數(shù)備用[40-41]。qPCR擴(kuò)增引物是ploF（TGC GAY CCS AAR GCB GAC TC）和polR（ATS GCC ATC ATY TCR CCG GA），擴(kuò)增體系為15 μL，包含7.5 μL 2×SYBR Premix Ex Taq II、0.3 μL 50×ROX Reference Dye、10 μmol·L-1的前后引物各0.6 μL、2 μL DNA模板和4.0 μL ddH2O，每個(gè)樣品3次重復(fù)。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃解鏈5 s，62℃退火30 s，72℃延伸60 s，83℃采集信號10 s，40個(gè)循環(huán)。

1.5 生物信息學(xué)分析

高通量測序數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)質(zhì)控，進(jìn)行序列拼接、過濾并去除嵌合體后得到高質(zhì)量序列。隨后以97%相似性水平進(jìn)行分類操作單元（OTU）聚類，使用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類注釋及后續(xù)分析[42]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 21軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan法進(jìn)行多重比較（＜0.05）。土壤理化性質(zhì)與固氮群落指標(biāo)及其功能菌屬spearman相關(guān)關(guān)系采用R中的“psych”包分析；群落結(jié)構(gòu)差異及環(huán)境因子對群落結(jié)構(gòu)影響的主坐標(biāo)（PCoA）和冗余分析（RDA）由R中的“vegan”包完成；偏最小二乘路徑分析建模（PLS-PM）由R中的“plspm”分析完成。作圖軟件為Microsoft Excel及R中“pheatmap”及“ggplot2”包。

2 結(jié)果

2.1 不同秸稈添加量對土壤理化性質(zhì)及生物固氮的影響

由表1可知，秸稈添加培養(yǎng)后，隨著秸稈添加量增加，土壤pH及NO3--N含量均呈下降趨勢，與C0相比，土壤NO3--N含量顯著下降，土壤的NH4+-N含量各處理之間無顯著差異。利用15N2同化方法對固氮速率定量以衡量固氮酶活性，不同秸稈添加量處理的固氮微生物的固氮速率，相比于不添加秸稈處理（C0），處理C2、C3、C4及C5土壤潛在固氮能力顯著增加（＜0.005）。隨著秸稈添加量的增加，C3、C4及C5處理之間固氮速率無顯著性差異，在培養(yǎng)期間（28 d）潛在生物固氮可達(dá)到2.71—3.05 μg N·g-1DW，約為0.10—0.11 mg N·kg-1DW·d-1，相比C0固氮速率提高了35.5%—52.5%。

表1 不同處理的土壤理化性質(zhì)及生物固氮

表格中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=4；同一列不同字母表示處理之間差異顯著（＜0.05）

Data are means±SE, n=4; Means with no letter in common are significantly different among treatments at＜0.05 level; 秸稈添加量Straw addition C0: 0, C1: 0.2 mg·g-1, C2: 1.0 mg·g-1, C3: 2.0 mg·g-1, C4: 4.0 mg·g-1, C5: 10.0 mg·g-1

2.2 固氮微生物群落多樣性及群落組成

圖1-A為基于97%相似度的OTU數(shù)據(jù)，采用加權(quán)（Weighted Unifrac）算法分別對不同秸稈添加量的微生物群落結(jié)構(gòu)的主成分分析結(jié)果。其中，第一主成分和第二主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為10.97%和8.96%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為19.93%；在第一軸上，C0、C1與C4、C5在第一軸上能夠很好地分開，解釋量為10.97%。

圖1-B為15N2處理對應(yīng)不同秸稈添加量土壤中的固氮微生物基因拷貝數(shù)，各處理固氮微生物基因拷貝數(shù)為5.48×107—9.20×107copies/(g soil)。其中，相比于C0，C4及C5處理固氮微生物基因拷貝數(shù)均顯著提高，顯著提高了固氮微生物數(shù)量和活性（＜0.05）。當(dāng)秸稈添加量達(dá)到4.0 mg·g-1后，再增加秸稈添加量對土壤固氮微生物基因拷貝數(shù)無顯著影響。圖1-C為固氮微生物群落結(jié)構(gòu)香農(nóng)-威爾指數(shù)多樣性分析結(jié)果，香農(nóng)-威爾指數(shù)越高，微生物群落多樣性越豐富，反之亦然。其中，C4、C5水平的香農(nóng)-威爾指數(shù)顯著低于其他4個(gè)處理（＜0.05），其他4個(gè)處理多樣性無顯著差異。

圖1-D為不同秸稈添加量下門水平下固氮微生物群落結(jié)構(gòu)相對豐度，不同處理固氮微生物群落組成主要為變形桿菌（Proteobacteria）、藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）、厚壁菌（Firmicutes）、放線菌（Actinobacteria）和螺旋體細(xì)菌（Spirochaetes）。隨著秸稈添加量的增加，C2、C3、C4和C5相比C0水平藍(lán)細(xì)菌的相對豐度顯著增加（＜0.05），但當(dāng)秸稈添加量達(dá)到10.0mg·g-1時(shí)，其相對豐度反而有所降低。對于變形桿菌，C3和C4水平相較于C0、C1、C5水平其相對豐度顯著減少（＜0.05）。對于厚壁菌，C4相較于C0、C1、C2水平的相對豐度下降極為顯著（＜0.01），C5水平相對于C0、C1、C2和C3水平其相對豐度下降極為顯著（＜0.01）。對于放線菌，C5相較于C0、C1、C2和C3水平顯著減少（＜0.05）。對于螺旋體門細(xì)菌，C2、C3、C4和C5相較于C0水平下相對豐度顯著增加（＜0.05）。

圖1-E為屬水平下不同秸稈添加量下固氮微生物群落結(jié)構(gòu)相對豐度，包含22個(gè)優(yōu)勢功能菌屬（相對豐度大于1%），其中包括多種α-型、β-型、γ-型變形菌（Proteobacteria），以及一種藍(lán)細(xì)菌，如賀氏偽枝藻屬（）。慢生根瘤菌（）為最豐富菌屬，隨著秸稈添加量的增加，C5相較于C0、C1、C2、C3水平相對豐度差異顯著（＜0.05），顯著增加了12.07%—14.13%。賀氏偽枝藻屬（）隨著秸稈添加量的增加其相對豐度逐漸增加，但當(dāng)秸稈添加量達(dá)C5水平其相對豐度反而降低（＜0.05）。屬和屬的相對豐度隨著秸稈添加量逐漸增加，但當(dāng)秸稈添加量達(dá)C4和C5水平其相對豐度相較于C3反而顯著降低（＜0.05）。隨著秸稈添加量增加，相對豐度成增加趨勢的屬有sp.和屬。此外，中華根瘤菌（）和固氮螺菌（），在秸稈添加水平達(dá)到C5水平其相對豐度才顯著增加（＜0.05）。隨著秸稈添加量的增加，相對豐度呈下降趨勢的屬有弧菌屬（）、硫紅螺旋菌屬（）、弗蘭克菌屬（）、太陽桿菌屬（）及屬。

不同字母表示不同秸稈添加量處理差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05），*表示P＜0.05

2.3 相關(guān)性分析

表2為環(huán)境因子與土壤固氮微生物群落的Spearman相關(guān)性分析。相關(guān)性分析表明，基因拷貝數(shù)與秸稈添加量（=0.708，＜0.005）呈顯著正相關(guān)，但與pH（=-0.623，＜0.005）和NO3--N含量（=-0.737，＜0.005）呈顯著負(fù)相關(guān)，其中，NO3--N含量與基因拷貝數(shù)相關(guān)性最強(qiáng)。固氮速率與秸稈添加（= 0.804，＜0.005）和TN（=0.598，＜0.005）呈顯著正相關(guān)，與NO3--N含量（=-0.828，＜0.005）呈顯著負(fù)相關(guān)，其中，NO3--N含量與固氮速率相關(guān)性最強(qiáng)。

圖2-A為群落組成結(jié)構(gòu)同環(huán)境因子的冗余分析（RDA）結(jié)果表明，所檢測的環(huán)境因子對土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)差異解釋量為35.54%，RDA1和RDA2解釋量分別為28.38%和3.67%，生物固氮量（BNF）及土壤環(huán)境因子中的NO3--N含量和pH的影響作用達(dá)到顯著。如圖2-B所示，使用PLS-PM方法來研究不同秸稈添加量（straw addition）、培養(yǎng)后土壤pH及有效氮濃度（NO3-、NH4+）、基因豐度（），固氮微生物群落結(jié)構(gòu)（communitystructure PCoA）和生物固氮（BNF）之間的關(guān)系。其中，路徑系數(shù)表示變量之間線性關(guān)系（直接效應(yīng)）的方向和強(qiáng)度，間接效應(yīng)為預(yù)測變量和響應(yīng)變量之間路徑系數(shù)相乘，潛在變量之間總效應(yīng)是二者的加和，擬合優(yōu)度（GoF）表示模型的質(zhì)量。分析表明，隨著秸稈添加量的增加，秸稈添加與NO3-含量和pH呈顯著負(fù)相關(guān)，其中，與NO3-含量負(fù)相關(guān)系數(shù)最大（-0.93）。NO3-含量與群落結(jié)構(gòu)顯著正相關(guān)（0.65），與基因豐度呈負(fù)相關(guān)（-0.69），表明秸稈添加后，固氮微生物對土壤NO3-的利用導(dǎo)致了群落結(jié)構(gòu)的顯著變。此外，群落結(jié)構(gòu)與BNF顯著負(fù)相關(guān)（-0.87），表明在群落結(jié)構(gòu)改變后，對BNF造成顯著影響。盡管pH在秸稈添加后顯著變化且與BNF有著直接的顯著相關(guān)性，但與間接效應(yīng)相抵消后，pH對BNF總效應(yīng)僅為0.43。通過觀察各變量之間的總效應(yīng)，可以發(fā)現(xiàn)秸稈添加（0.67）、NO3-（-0.89）及微生物群落結(jié)構(gòu)（-0.87）對生物固氮速率影響較大；秸稈添加（-0.85）及NO3-（-0.70）對微生物群落結(jié)構(gòu)影響較大。

***，**，*分別表示P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05。圖3同 ***, **, * mean P＜0.001, P＜0.01, P＜0.05 respectively. The same as Fig.3

表2 環(huán)境因子與土壤固氮微生物豐度、多樣性和固氮速率的相關(guān)性分析

粗體數(shù)字表示相關(guān)性顯著，＜0.005

The bold numbers represent significant correlations with＜0.005

圖3為固氮微生物優(yōu)勢功能菌屬與土壤理化性狀及生物固氮速率的Spearman相關(guān)性分析。分析表明，屬水平上大多數(shù)優(yōu)勢土壤固氮微生物相對豐度與土壤硝態(tài)氮及生物固氮量顯著相關(guān)。其中，土壤中的優(yōu)勢功能菌屬（＞1%）、、sp.、和等屬與生物固氮速率呈顯著正相關(guān)，此外，等屬也與生物固氮速率呈顯著正相關(guān)，但其相對豐度為較低水平；而、、和sp.等屬與生物固氮速率呈顯著負(fù)相關(guān)。NO3--N對菌屬相對豐度影響與BNF的趨勢相反，且有著較強(qiáng)的相關(guān)性，土壤pH的趨勢和NO3--N類似，如和sp.相對豐度與BNF呈顯著正相關(guān)，而與NO3--N和pH呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖3 土壤固氮微生物功能菌屬與土壤理化性狀及固氮速率的Spearman相關(guān)性分析

3 討論

許多研究表明，秸稈添加后補(bǔ)充的大量有機(jī)碳源和能量會(huì)導(dǎo)致土壤中微生物群落利用無機(jī)態(tài)氮，提高土壤中細(xì)菌和非共生固氮微生物的數(shù)量和活性[10-11]，從而促進(jìn)生物固氮[12-13]。有機(jī)物料添加有利于促進(jìn)基因豐度及固氮功能的維持[43-45]，但其對固氮微生物的影響可能也與有機(jī)物料的數(shù)量有關(guān)[46]。在本研究中，與C0相比，除C1（0.2 mg·g-1）處理固氮速率增加不顯著外，其余處理固氮速率均顯著提高，但隨著秸稈添加量增加到C3（2.0 mg·g-1）水平后，固氮速率不再顯著增加。秸稈中含有纖維素和半纖維素，土壤中只有少數(shù)幾種固氮微生物（）能夠直接利用秸稈進(jìn)行固氮[47]，大多數(shù)固氮微生物依賴于其他微生物將其分解為較小的產(chǎn)物。過量秸稈的添加并不代表其滿足微生物生長所需的可利用碳源，進(jìn)而導(dǎo)致固氮速率不再顯著增加。相關(guān)性分析表明固氮速率與NO3--N含量呈顯著負(fù)相關(guān)（表2），與秸稈添加量呈顯著正相關(guān)。此外，固氮速率與TN含量呈顯著正相關(guān)可能歸因于秸稈添加輸入的大量有機(jī)氮源。

碳源的數(shù)量是導(dǎo)致微生物群落競爭的重要因子，很大程度上決定了微生物活性和群落結(jié)構(gòu)組成[48]。本研究中，當(dāng)秸稈添加量達(dá)到C4水平后，增加秸稈添加量對基因豐度無顯著影響（圖1-B）。相關(guān)性分析表明，基因豐度與秸稈添加量呈顯著正相關(guān)，與NO3--N含量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.001）。以往的研究發(fā)現(xiàn)固氮速率顯示出對固氮微生物多樣性增加的飽和趨勢[15]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢，當(dāng)秸稈添加量達(dá)到C3水平后，香農(nóng)-威爾指數(shù)顯著下降，表明隨著秸稈的過量添加，碳源可利用性的限制導(dǎo)致了固氮微生物的群落競爭，群落多樣性顯著下降。

以往的研究表明參與玉米秸稈分解的微生物主要包括變形桿菌、厚壁菌及放線菌，如、和等[35]。、及Cyanobacteria是土壤中較為常見的固氮微生物[38]。在本研究中，固氮微生物主要包含多種α-型、β-型、γ-型變形菌（Proteobacteria），以及藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）。在屬水平上主要由、、、、和等屬組成。其中，可參與秸稈分解且為最豐富菌屬，不僅可與豆科植物共生固氮，作為根際細(xì)菌也可促進(jìn)非豆科植物生長[49]，隨著秸稈添加量的增加，其相對豐度顯著增加了12.07%—14.13%（圖1-E）。、和等屬的相對豐度隨著秸稈添加量逐漸增加，但當(dāng)秸稈添加量一定水平后其相對豐度反而顯著降低（＜0.05）。隨著秸稈添加量的增加，、、和等屬相對豐度呈下降趨勢。作為優(yōu)勢菌屬，與生物固氮速率呈顯著正相關(guān)（＜0.05），但其與固氮速率的相關(guān)性不如，這可能與其作為兼性固氮菌，會(huì)優(yōu)先支持自身營養(yǎng)生長而不是用于固氮有關(guān)；同時(shí)，秸稈添加有增加相對豐度的趨勢，其與生物固氮速率呈顯著正相關(guān)（＜0.01），進(jìn)一步表明碳源的數(shù)量對固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。此外，sp.、和等屬與BNF均呈顯著正相關(guān)。上述結(jié)果表明，碳源的數(shù)量是影響土壤固氮微生物群落特征的關(guān)鍵因素。

除了上述分析，本研究還采用了PLS-PM分析和RDA分析方法，結(jié)果均表明土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的差異與NO3--N含量緊密相關(guān)。之前的研究表明，當(dāng)銨態(tài)氮含量較低的情況下投入有機(jī)物料，硝態(tài)氮的利用更加顯著，進(jìn)而導(dǎo)致土壤NO3--N含量下降[50]。結(jié)合Spearman相關(guān)性分析結(jié)果，說明隨著秸稈量的增加，導(dǎo)致土壤中硝態(tài)氮的降低，與生物固氮速率呈顯著正相關(guān)且與硝態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)的功能菌屬諸如和sp.等菌屬的相對豐度顯著增加，從而促進(jìn)了固氮微生物對N2的固定。固氮微生物群落多樣性在秸稈添加量達(dá)到C3水平后顯著下降（圖1-C），生物固氮速率在秸稈添加量達(dá)到C3水平后無顯著差異（表1），雖然表明碳源可利用性對生物固氮的制約，但添加秸稈后在培養(yǎng)期間（28 d）潛在固氮總量可達(dá)到2.71—3.05 μg N·g-1DW，約為0.10—0.11 mg N·kg-1DW·d-1，相比C0固氮速率提高了35.5%—52.5%。以上結(jié)果說明了適量添加秸稈后可顯著提高生物固氮潛力并改變固氮菌群落結(jié)構(gòu)特征。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011年，我國通過秸稈還田投入有機(jī)碳儲量平均為0.89 Mg C·hm-2 [51]，秸稈資源對促進(jìn)生物固氮潛力有十分積極的意義。本研究表明，C0處理固氮速率為0.07 mg N·kg-1DW·d-1，若以平均土壤容重1.2 g·cm-3來計(jì)算，固氮速率約為63 kg N·hm-2·a-1；C3、C4和C5處理固氮速率約為87—96 kg N·hm-2·a-1。與以往研究不同的是，本研究通過15N2方法進(jìn)行定量，肯定了非共生固氮在水分和溫度適宜的條件下對氮素投入的重要作用；土壤固氮微生物多樣性在秸稈添加量達(dá)到C3（2.0 mg·g-1）水平后顯著下降，與固氮速率顯著正相關(guān)的部分優(yōu)勢功能菌屬相對豐度在秸稈添加量達(dá)到C4（4.0 mg·g-1）水平后顯著下降。為盡可能提高土壤生物固氮潛力，綜合考慮固氮微生物多樣性、基因拷貝數(shù)及生物固氮速率等條件，在本研究基礎(chǔ)上得出最佳秸稈添加水平應(yīng)為4.0 mg·g-1，其潛在固氮總量約為87 kg N·hm-2·a-1，相比對照提高了38.1%。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，土壤固氮微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)對碳源數(shù)量具有明顯響應(yīng)，可明顯提高土壤固氮潛力，對秸稈還田數(shù)量調(diào)節(jié)土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)及促進(jìn)生物固氮具有重要指導(dǎo)意義。然而，由于固氮微生物對環(huán)境變化十分敏感，田間條件下秸稈還田對固氮微生物群落及生物固氮的調(diào)控作用尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

不同秸稈添加量對土壤固氮菌群落特征具有明顯影響，添加秸稈后，土壤固氮微生物基因拷貝數(shù)呈增加趨勢，土壤固氮微生物多樣性在秸稈添加量達(dá)到2.0 mg·g-1后顯著下降，與固氮速率顯著正相關(guān)的部分優(yōu)勢功能菌屬相對豐度在秸稈添加量達(dá)到4.0 mg·g-1后顯著下降。相比于不添加秸稈，添加秸稈4.0 mg·g-1后，可增加土壤生物固氮速率約為26 kg N·hm-2·a-1。固氮微生物群落結(jié)構(gòu)因秸稈添加量不同而聚集為不同組別。因此，秸稈添加對固氮微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用主要受碳源的數(shù)量影響。此外，固氮微生物群落結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢功能菌屬相對豐度與固氮速率及NO3--N含量緊密相關(guān)，表明秸稈添加后因其較高的C/N比，使得固氮微生物增加對無機(jī)態(tài)氮（NO3--N）的利用，顯著提高固氮微生物的數(shù)量和活性，從而促進(jìn)生物固氮。此外，秸稈添加后造成土壤NO3--N含量的差異可能是驅(qū)動(dòng)土壤固氮微生物群落組成的重要環(huán)境因子。

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Effects of Straw Addition on Soil Biological N2-Fixation Rate and Diazotroph Community Properties

LI Xu, DONG WeiLing, SONG ALin, LI YanLing, LU YuQiu, WANG EnZhao, LIU XiongDuo, WANG Meng, FAN FenLiang

Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Plant Nutrition and Fertilizer, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100081

【】The purpose of this study was to analyze the effects of different straw additions on soil N2-fixation rate and diazotroph community structure, which was crucial for the management of crop residue and mineral fertilizer application in China.【】Using indoor incubation experiment, in addition to the control (C0: 0), a total of 5 straw addition gradients (C1: 0.2 mg·g-1; C2: 1.0 mg·g-1; C3: 2.0 mg·g-1; C4: 4.0 mg·g-1; C5: 10.0 mg·g-1), using the15N2labeling method, and soil samples were collected after 28 days of incubation in dark conditions. As a direct measure of N2-fixation,15N2gas labeling method could quantify the rate of biological N2-fixation, and destined for characterization ofgene marker and diazotroph community by using the Illumina PE250 sequencing and PCR techniques. 【】With the increase of straw addition, the content of NO3--N in soil decreased significantly, while the content of NH4+-N did not change significantly. The pH of soil decreased and the rate of biological N2-fixation increased significantly. C3, C4 and C5 treatments could reach 2.71-3.05 μg N·g-1DW during the incubation period (28 d), which was about 87-96 kg N·hm-2·a-1, compared with C0, the rate of biological N2-fixation increased by 38.1%-52.4%. The copy number ofgene ranged from 5.48×107to 9.20×107copies/(g soil) under all treatments. Compared with C0, the copy number ofgene was significantly increased under C4 and C5 treatments, and the number and activity of diazotroph were significantly increased (＜0.05). However, when the amount of straw added reached 4.0 mg·g-1, increasing the amount of straw had no significant effect on the copy number ofgene of soil diazotroph. With the increase of straw addition, Shannon-Weill index of C4 and C5 levels was significantly lower than that of the other four treatments (＜0.05), and the diversity of the other four treatments had no significant difference. The result of PCoA showed that diazotroph community structure was clustered into different groups depending upon the difference of straw addition. Diazotroph were divided into Proteobacteria,Cyanobacteria, Firmicutes, Actinobacteria and Spirochaetesat the phylum level. As the amount of straw added increases, the relative abundance oftends to increase first and then decrease. At the genus level, there were significant differences in the number of carbon sources among different species.was the most abundant genus. With the increase of straw addition, the relative abundance of C5 was significantly different from that of C0, C1, C2 and C3 (＜0.05), increasing by 12.07%-14.13%. The relative abundance of, which was positively correlated with the rate of biological N2-fixation, gradually increases with the increase of straw addition, but decreased when straw addition reaches C5 level (＜0.05). Meanwhile, PLS-PM analysis, RDA and correlation analysis revealed that the rate of biological N2-fixation and soil diazotroph community were greatly affected by straw addition and soil NO3--N concentration. 【】The rate of soil biological N2-fixation increases with the amount of straw added. The effect of straw on N2-fixation was mainly due to the reduction of NO3--N content in the soil by straw addition, which in turn promoted the diazotroph such as,andgrow. According to the calculation results of this experiment, compared with no straw, after the straw was added (4.0 mg·g-1), the rate of biological N2-fixation could be increased by 26 kg N·hm-2·a-1, which significantly reduced the fertilizer demand.

soil diazotroph; straw returning; the rate of biological N2-fixation;15N2labeling method;

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.010

2020-06-21；

2020-12-16

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0800707，2016YFD0200109）、國家自然科學(xué)基金（41571297）、中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（1610132019011，1610132019021）

李旭，E-mail：82101185083@caas.cn。通信作者范分良，E-mail：fanfenliang@caas.cn

（責(zé)任編輯 李云霞）