王濤，韓玉，潘力，王冰，孫茂文，王翌，羅玉子，仇華吉，孫元

針對非洲豬瘟病毒MGF360-13L基因的TaqMan熒光定量PCR的建立

王濤，韓玉，潘力，王冰，孫茂文，王翌，羅玉子，仇華吉，孫元

中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，哈爾濱 150069

【】建立一種以MGF360-13L基因為靶標的實時熒光定量PCR檢測非洲豬瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）的方法，為非洲豬瘟（African swine fever, ASF）的診斷、基因缺失毒株鑒別、病毒分離鑒定、基因功能研究提供技術支持。首先，以ASFV中國流行毒株（GenBank: MK333180.1）的基因序列為靶標設計并篩選了1對特異性引物和探針，建立其熒光定量PCR檢測方法。設計引物13L-F/13L-R，擴增，并將其克隆至pOK12載體，挑取陽性克隆并測序驗證，構建重組質粒標準品。將重組質粒標準品連續(xù)10倍梯度稀釋，以稀釋后的各梯度質粒標準品為模板，配制反應體系和設置反應條件后進行熒光定量PCR檢測，建立標準曲線，并對其敏感性和重復性進行評價；其次，以連續(xù)10倍梯度稀釋的重組質粒標準品為模板，利用引物13L-F/13L-R進行常規(guī)PCR檢測，以比較熒光定量PCR的敏感性。最后，運用本檢測方法和本研究組已建立的針對ASFV的熒光定量PCR檢測方法同時對黑龍江某豬場發(fā)生ASF時采集的30份臨床樣品進行檢測，以比較兩種檢測方法的符合率。另外，應用該方法對感染原代巨噬細胞的ASFV野毒株和MGF基因缺失毒株進行鑒別檢測。利用引物13L-F/13L-R可擴增出一條800 bp左右的特異性目的條帶，而陰性對照無條帶，成功構建出標準品。本研究建立的實時熒光定量PCR檢測方法在質粒標準品為1.56×101-1.56×108拷貝/μL時，呈現(xiàn)出良好的線性關系，線性回歸方程為：=-3.295 lg() + 45.995，線性相關系數(shù)2為0.997，對ASFV核酸最低檢測限為15.6拷貝/μL。在特異性檢驗中，除ASFV核酸外，豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬圓環(huán)病毒1型、豬圓環(huán)病毒2型等病毒核酸均未出現(xiàn)擴增曲線，表明該方法的特異性良好。與最低檢測限為1.56×104拷貝/μL病毒核酸的常規(guī)PCR檢測方法相比，本研究建立的TaqMan熒光定量PCR檢測方法高出其約3個數(shù)量級，具有較高的敏感性。在臨床樣品檢測中，兩種檢測方法經過McNemar檢驗，= 0.5＞0.05，表明兩種檢測方法的結果無統(tǒng)計學差異；經過Kappa檢驗，Kappa = 0.867＞0.75，＜0.001，提示兩種檢測方法符合率較好，能夠有效區(qū)分ASFV野毒株和基因缺失毒株。建立的TaqMan熒光定量PCR特異、敏感、重復性好，不僅豐富了ASFV現(xiàn)有檢測靶標，也為后續(xù)功能、缺失毒株的鑒定及相應基因缺失疫苗株的鑒別診斷提供技術支持。

非洲豬瘟病毒；；熒光定量PCR；鑒別診斷

0 引言

【研究意義】非洲豬瘟（African swine fever, ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）感染豬引起的一種接觸傳染性、廣泛出血性、烈性傳染病，最急性和急性型感染死亡率可高達100%，是養(yǎng)豬業(yè)的頭號殺手[1-3]。該病已呈現(xiàn)出跳躍式傳播，自2007年再次傳入歐洲后，迅速擴散至俄羅斯、烏克蘭、拉脫維亞、波蘭等十多個東歐國家[4]。2018年8月傳入中國后[5-6]，不到一年時間擴散至蒙古、朝鮮、以及越南、柬埔寨、老撾、緬甸等多個東南亞國家。已初步呈現(xiàn)出全球流行趨勢，對全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展造成了重大威脅[7-8]。截至目前，我國已累計暴發(fā)ASF疫情176起，撲殺豬只超過數(shù)百萬頭，保守估計造成直接經濟損失數(shù)百億元。由于無商品化疫苗可用，加之ASFV污染面積較廣，我國ASF的防控和根除形勢異常嚴峻[9-12]。因此，建立可鑒別不同ASFV毒株的熒光定量PCR方法對于該病的早期檢測，以及深入研究ASFV致病機制和將來疫苗株與野毒株感染的鑒別檢測都至關重要?！厩叭搜芯窟M展】ASFV是目前所知的唯一蟲媒DNA病毒[2]，也是非洲豬瘟相關病毒科的唯一成員，成熟的病毒粒子結構復雜，主要感染豬單核巨噬細胞[1-3]。ASFV基因組為170—194 kb的雙鏈線性DNA，可編碼近200個蛋白，末端含有5個多基因家族，其中和對ASFV的復制、免疫逃逸及致病性有重要作用。有研究表明，和可增強ASFV在軟蜱細胞內的復制，也可抑制Ⅰ型干擾素的產生[13]。ASFV Malawi Lil-20/1株缺失和可降低病毒毒力[14-15]，缺失ASFV Georgia 2007株和()的6個基因（和）可使病毒顯著致弱，并可對親本強毒株的致死性攻擊提供完全保護[13]。我國分離的ASFV SY18株，缺失可以顯著降低病毒毒力，與國外報道一致；在此基礎上進一步缺失后表現(xiàn)出了較好的安全性和保護效果[16]。中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所構建的與多基因缺失病毒，能對中國流行的ASFV強毒株攻擊提供100%的免疫保護，可作為安全、有效的ASF候選疫苗株[17]。由此可見，缺失ASFV毒株具有較好的研發(fā)和應用前景[13, 16-17]。現(xiàn)階段，ASF的防控只能依靠加強生物安全措施、早期檢測和嚴格的撲殺。針對ASF的檢測技術主要有間接免疫熒光試驗、紅細胞吸附試驗、病毒分離、聚合酶鏈式反應（PCR）和實時熒光定量PCR等[18-19]。【本研究切入點】目前，ASF的PCR及熒光定量PCR檢測主要是針對ASFV B646L（p72）基因，診斷靶標相對單一[20]。因此，本研究以ASFV中國流行毒株為對象，選擇多基因家族中相對保守又具研究和應用前景的MGF360-13L基因為靶標，建立ASFVTaqMan實時熒光定量PCR檢測方法?！緮M解決的關鍵問題】為后續(xù)MGF360-13L基因功能研究、缺失病毒的鑒定及相關基因缺失疫苗株的鑒別提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞

ASFV分離株ASFV HLJ/18株（GenBank登錄號：MK333180.1）由中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬烈性傳染病創(chuàng)新團隊（本研究組）保存，ASFV MGF基因缺失毒株（ASFV-DMGF）由本研究組構建及鑒定（暫未發(fā)表數(shù)據(jù)）；無特定病原體（SPF）豬肺泡巨噬細胞（PAM）由本研究組分離并保存。

特異性和敏感性質控樣本的建立：豬瘟病毒（CSFV）石門株（GenBank登錄號：AF092448.2）和偽狂犬病病毒（PRV）TJ株（GenBank登錄號：KJ789182.1）均由本研究組增殖與保存；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）陽性抗凝血各一份由本研究組鑒定與保存。取感染CSFV、PRV、ASFV的細胞培養(yǎng)物或者PRRSV、TGEV、PCV1、PCV2感染豬抗凝血各200 μL，提取核酸并對RNA病毒核酸進行反轉錄，于-20℃凍存，用于本研究的特異性和穩(wěn)定性評價。本研究涉及的ASFV活病毒操作及相關陽性樣品的處理均是在中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所生物安全3級實驗室進行，符合ASF相關生物安全的要求。

1.2 主要儀器與試劑

DNA凝膠回收試劑盒、AxyPrepTMBody Fluid viral DNA/RNA提取試劑盒均購自康寧生命科學（吳江）有限公司；Premix PrimeSTAR HS、Premix Ex Taq?熒光定量試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；DH5α感受態(tài)、pOK12載體、質粒小提試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。熒光定量PCR儀（QuantStudio3&5）購自美國Thermo公司；紫外凝膠成像儀（AlphaImager HP）購自美國ProteinSimple公司；超微量分光光度計（NanoPhotmeter?）購自德國Implen公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit一步同源重組試劑盒購自Vazyme公司。Antibiotic- Antimycotic和RPMI 1640含L-谷氨酰胺培養(yǎng)基購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 引物和探針

根據(jù)GenBank中收錄的ASFV全基因組（登錄號：MK333180.1），選擇序列設計擴增引物，13L-F：5′-ggtacccgggagctcgaattcCCTCTTCAAAGGCA TTACCA-3′；13L-R：5′-gtctgcagaagcttcgaattcCATTTT GAAATATTGTGGCCTA-3′（小寫字母為左右同源臂序列）；擴增片段大小800 bp。以序列為靶標，根據(jù)熒光定量PCR引物設計原則，利用Oligo7根據(jù)保守片段設計引物和探針并進行結構分析，經驗證篩選出擴增曲線良好，電泳結果顯示目的條帶清晰的引物，序列為：F：5′-TCCTCTAGAGTTT CTTTGG-3′，R：5′-TCGTGTGGCATTAATAATAG-3′，擴增片段為159 bp；雙標記探針信息如下：5′-（FAM）CAACTCTCGGATGTGCTTCGTATTG（TAMRA）-3′；以上引物和探針均由寶生物工程（大連）有限公司合成與驗證。

1.4 陽性質粒標準品的構建

以本研究組保存的ASFV核酸為模板，利用引物對13L-F/13L-R擴增，反應體系為50 μL：Premix PrimeSTARHS 25 μL、ddH2O 21 μL、上、下游引物各1 μL、模板2 μL；反應條件為：預變性95℃ 5 min，變性95℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，擴增30個循環(huán)；將PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳；回收目的條帶，利用限制性核酸內切酶RI切割pOK12載體，利用一步同源重組試劑盒將目的基因連接至pOK12載體上，并轉化至DH5α感受態(tài)中，挑取陽性克隆提取質粒并進行測序驗證。

1.5 熒光定量PCR標準曲線的建立及其特異性和敏感性

采用超微量分光光度計測定標準品濃度，根據(jù)公式：（6.02×1023拷貝/mol）×DNA量（g）/[DNA長度（堿基數(shù)）×660 g/(mol·堿基)] = 拷貝數(shù)，計算標準品拷貝數(shù)。利用ddH2O將標準品連續(xù)10倍梯度稀釋至10-10，將其作為模板按照已優(yōu)化的條件進行熒光定量PCR檢測。反應體系為25 μL：Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5 μL、ddH2O 8.25 μL、上、下游引物各0.5 μL、探針1.0 μL、模板2 μL、ROX 0.25 μL；反應條件為：預變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s，退火55℃ 10 s，延伸72℃ 20 s，40個循環(huán)，其他條件為儀器默認設置。

另取CSFV、PRV、PRRSV、TGEV、PCV1、PCV2和ASFV的核酸按已優(yōu)化的方法同時進行TaqMan熒光定量PCR檢測，以評價其特異性。此外，將構建的質粒標準品梯度稀釋后，利用本方法以及引物對13L-F/13L-R進行常規(guī)PCR進行檢測，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以比較所建立的ASFVTaqMan熒光定量PCR檢測方法的靈敏度。

1.6 臨床樣品檢測

對發(fā)生ASF豬場采集的30份抗凝血滅活后每份取200 μL按照AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA提取試劑盒說明書操作提取DNA。利用本研究組已建立的方法[20]及本方法同時對樣品進行檢測，利用SPSS 13.0軟件進行一致性和配對卡方檢驗，比較兩種檢測方法結果之間的符合率。另對這30份樣品進行了3次重復檢測，對檢測結果進行統(tǒng)計學分析，以評價該檢測方法的穩(wěn)定性與重復性。

1.7 ASFV MGF基因缺失毒株與野毒株感染PAM細胞檢測鑒定

復蘇的PAM細胞使用含L-谷氨酰胺、2%雙抗和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于6孔板中，以3 MOI的ASFV HLJ/18與ASFV-?MGF分別進行感染并做未接毒對照，48 h后收取病毒并保存。按照1.6方法提取DNA，每個樣品進行3次重復，利用本方法進行檢測。

2 結果

2.1 標準品的制備

利用引物13L-F/13L-R以ASFV基因組為模板進行PCR擴增，可以得到一條大小為800 bp的目的條帶（圖1）。利用一步克隆試劑盒將目的片段克隆至pOK12載體上，構建標準品，經測序驗證后，提取標準品質粒并測得濃度為504 ng·μL-1，經計算每微升拷貝數(shù)為1.56×1011。

2.2 ASFV MGF360-13L TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立

2.2.1 標準曲線的建立 對1.56×101—1.56×108拷貝/μL質粒標準品進行熒光定量PCR檢測，以Ct值為縱坐標，標準品拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，利用QuantStudioTMDesign & Analysis Software v1.4.3分析軟件繪制其標準曲線（圖2）。建立的ASFV熒光定量PCR線性回歸方程為：= -3.295lg() + 45.995，2為0.997，擴增效率為98.12%，標準曲線為系統(tǒng)自動生成。

M: 2000 bp 分子量標準；1：MGF360-13L基因；2：陰性對照

2.2.2 ASFV熒光定量PCR的特異性和敏感性 以本研究建立的TaqMan熒光定量PCR對CSFV、PRV、PRRSV、TGEV、PCV1、PCV2和ASFV的核酸（cDNA/DNA）進行檢測，除ASFV的DNA外，其余病毒核酸及陰性對照孔均未出現(xiàn)擴增曲線，未檢測到Ct值（圖3）。結果表明，本研究建立的ASFVTaqMan熒光定量PCR檢測方法擴增效果良好，特異性強。

2.2.3 ASFV熒光定量PCR的重復性 選擇10倍梯度稀釋的質粒標準品的4個稀釋度（1.56×109—1.56×106拷貝/μL）為模板，按照相同的條件進行3次組內和組間重復試驗。結果顯示（表1），組內變異系數(shù)（CV）均小于1%，組間變異系數(shù)（CV）均小于2%，表明本檢測方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性。

2.2.4 ASFV熒光定量PCR的靈敏度 將10倍梯度稀釋的標準品，進行常規(guī)PCR擴增，并將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，反應條件和體系參照1.4。結果表明，使用Premix PrimeSTAR HS進行的常規(guī)PCR最低能夠檢測到約1.56×104拷貝/μL的病毒核酸（圖4）。因此，本研究建立的TaqMan熒光定量PCR檢測方法相比常規(guī)PCR檢測方法在敏感性上高出約2—3個數(shù)量級。結果在1.56×1010拷貝/μL至1.56×101拷貝/μL各濃度可檢出Ct值，而更低拷貝數(shù)時未檢出Ct值。表明本方法最低可檢測到15.6拷貝/μL的病毒核酸。

圖2 ASFV MGF360-13L熒光定量PCR標準曲線

圖3 ASFV MGF360-13L熒光定量PCR特異性檢測

表1 MGF360-13L標準品TaqMan熒光定量PCR的批間、批內重復性

2.3 臨床樣品檢測及符合率比較

用本研究建立的方法從30份臨床樣品中檢出陽性樣品14份，檢出率為46.7%，未出現(xiàn)假陽性。McNemar檢驗的結果，=0.5＞0.05，表明兩種方法的檢測結果無統(tǒng)計學差異；Kappa檢驗結果顯示，Kappa=0.867＞0.75，＜0.001，提示兩種檢測方法符合率較好。利用本方法進行的3次重復試驗，陽性樣品檢出均為14個，無假陽性；組內和組間變異系數(shù)均小于2.5%，表明本檢測方法具有良好的穩(wěn)定性和重復性。

2.4 ASFV疫苗毒與野毒感染檢測

利用本方法檢測感染ASFV野毒的PAM細胞，平均Ct值為23.5，對照組和感染ASFV-DMGF的PAM細胞無擴增曲線和Ct值（圖5）；表明該方法可以有效地區(qū)分ASFV野毒與缺失病毒感染。

M: 2000 bp 分子量標準M：DL2000 DNA Marker；1-10：質粒標準品1.56×1010-1.56×101拷貝/μL 1.56×1010-1.56×101 copies/μL standard plasmid；11：陰性對照 Negative control；12：陽性對照 Positive control

圖 5 ASFV MGF基因缺失毒株與野毒株感染PAM細胞檢測擴增曲線

3 討論

ASFV結構復雜、基因組龐大，絕大部分基因功能未知嚴重制約了ASF疫苗和相關研究的開展[21]。已有研究表明，MGF家族的6個基因（和）為ASFV的重要毒力因子。國內相關研究也已證實，該部分基因也是我國ASFV流行毒株的毒力基因，該部分基因缺失的毒株將有較大的研究和應用前景[16-17]。有研究報道，將ASFV和替換為增強綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）構建的熒光報告病毒不影響病毒在細胞中的復制，同時具備和親本毒株相似的致病性，可應用于研究ASFV的致病機制及其與宿主之間的相互作用[22]。也有研究表明，MGF360-13L可抑制cGAS-STING信號通路[23]，但具體機制仍不清楚。序列比對結果顯示，在中國及東歐多個國家流行的11個毒株中同源性高達100%?；谝陨戏治?，本研究選擇為靶基因，建立其TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。

ASF對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴重且無安全有效疫苗及治療藥物可用，因此亟需開展綜合防控技術及疫苗研發(fā)[24]。由于ASF的臨床癥狀與多種病毒及細菌性疾病感染極為相似。因此，其確診必須借助實驗室檢測[25]。實時熒光定量PCR具有極高的靈敏性和特異性，廣泛應用于包括ASFV在內的多種病原檢測[26]。經實驗條件的優(yōu)化，本研究建立的TaqMan熒光定量PCR檢測方法可實現(xiàn)對最低15.6拷貝/μL ASFV核酸的檢測，具有較高的靈敏性；同時，與CSFV、PRV、PRRSV、TGEV、PCV1和PCV2等多種病原不存在交叉反應，具有潛在應用價值。本研究建立的TaqMan熒光定量PCR檢測方法相比使用高保真酶Premix PrimeSTAR HS擴增800 bp目的片段的常規(guī)PCR在敏感性上高出約2—3個數(shù)量級，與廣泛應用的針對ASFV的熒光定量檢測方法相比，具有較高的符合率，因此也可應用該方法對可疑樣品進行二次確認。ASFV作為一個結構復雜、基因組龐大、危害嚴重的DNA病毒，除p72基因外，目前已建立的ASF熒光定量檢測靶標主要有早期基因[27]、[28]和[29]等，本研究不僅豐富了ASFV現(xiàn)有檢測靶標，也能夠為區(qū)分ASFV MGF基因缺失毒株與野毒提供技術支持。ASF傳入我國的2年多時間內已經造成了巨大經濟損失，對養(yǎng)豬業(yè)及相關行業(yè)產生了巨大沖擊[2,30]。由于ASFV在我國的污染面積大，加之養(yǎng)豬業(yè)生物安全水平較低，因此ASF的防控和根除將是一場持久戰(zhàn)。十分有必要對ASFV展開系統(tǒng)全面的基礎和應用研究，為我國防控和根除該病提供理論和技術支持[31]，本研究也將為后續(xù)功能探索以及缺失病毒純度鑒定等提供技術支持。

4 結論

本研究選擇目前我國流行的非洲豬瘟病毒多基因家族中相對保守、功能重要又兼具研究前景的MGF360- 13L基因為靶標，建立其TaqMan熒光定量PCR檢測方法。該方法特異性強、靈敏度高、重復性好，與已有的經典檢測方法符合率高，不僅豐富了ASFV現(xiàn)有檢測靶標，也能夠鑒別ASFV MGF基因缺失毒株與野毒株感染。

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Development of a TaqMan Real-Time PCR Targeting the MGF360-13L Gene of African Swine Fever Virus

WANG Tao, HAN Yu, PAN Li, WANG Bing, SUN MaoWen, WANG Yi, LUO YuZi, QIU HuaJi, SUN Yuan

Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin 150069

【】The objective of this study is to develop a TaqMan real-time PCR for detection of African swine fever virus (ASFV)gene, providing technical support for diagnosis, virus purification, differential diagnosis ofdeletion ASFV strains, and gene function research of ASFV.【】In this study, the TaqMan real-time PCR primers and probes were designed based on the ASFV(GenBank: MK333180.1), and the TaqMan real-time quantitative PCR assay of ASFV was established. A pair of specific primers, 13L-F/13L-R was designed to construct ASFV standard plasmid. The standard curve was generated for quantitative analysis using the ten-fold dilution of the ASFV standard plasmid, and the sensitivity and repeatability of the system were also evaluated. The ten-fold dilution of the ASFV standard was also detected by PCR to determine the sensitivity of the method. Thirty clinical samples collected from an outbreak ASF pig farm in Heilongjiang province were simultaneously tested by this TaqMan real-time PCR, and another one previously established in our laboratory to compare the coincidence rate of these two detection methods. Differential diagnosis of parent ASFV andgene deletion strain after infection with PAM cell【】A specific band of about 800 bp was amplified using primer 13L-F/13L-R, and no band was found in the negative control, and the standard plasmid was successfully constructed. The standard curve had a good linear relationship between real-time PCR cycle threshold (Ct) and template copies. The linear regression equation was:= -3.295 lg() + 45.995 with correlation coefficient of 0.997, and the minimum detection limit was 15.6 copies/μl of ASFV nucleic acid. There was no cross-reaction with classical swine fever virus, pseudorabies virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine transmissible gastroenteritis virus, porcine circovirus type 1, and porcine circovirus type 2. In the clinical sample test, the results of the two methods in McNemar test,= 0.5＞0.05, indicating that there was no statistical difference between the two methods and in Kappa test, Kappa = 0.867＞0.75,＜0.001, suggesting it was a good agreement and could effectively identify parent ASFV orgene deletion ASFV infection. 【】The TaqMan real-time PCR for detection of ASFVestablished in this study had highly specific, sensitive, reproducible, and high coincidence rate. It not only enriched the detection method of ASFV, but also provided technical support for researching the gene function of, identification of thegene-deleted ASFV, and differential diagnosis of related gene deletion vaccine strains.

African swine fever virus;; TaqMan real-time PCR; detection

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.018

2019-12-31；

2021-01-11

國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFD0502300）

王濤，E-mail：wangtaocaas@163.com。通信作者仇華吉，Tel：0451-51051708；E-mail：qiuhuaji@caas.cn。通信作者孫元，Tel：0451-51051709；E-mail：sunyuan@caas.cn

（責任編輯 林鑒非）