劉孝賀，仇貴生，佟兆國，張懷江，閆文濤，岳強，孫麗娜

桃小食心蟲化學感受蛋白CSP16配體結合特性

劉孝賀1，仇貴生1，佟兆國2，張懷江1，閆文濤1，岳強1，孫麗娜1

1中國農業(yè)科學院果樹研究所，遼寧興城 125100；2西昌學院農業(yè)科學學院，四川西昌 615013

【】桃小食心蟲（）是我國北方果樹生產中的重要害蟲之一，本文通過體外表達桃小食心蟲化學感受蛋白CsasCSP16，明確其與寄主揮發(fā)物分子和性信息素分子的結合特性，并通過生物信息學預測CsasCSP16與揮發(fā)物分子結合的關鍵氨基酸位點，為揭示桃小食心蟲嗅覺的分子機理提供理論依據(jù)。通過原核表達系統(tǒng)獲得CsasCSP16蛋白，并使用Ni-NTA柱純化重組蛋白。采用熒光競爭結合的方法，以N-苯基-1-萘胺（N-pheny-1-naphthylamine，1-NPN）為熒光探針，從33種寄主揮發(fā)物和2種性信息素分子中篩選出與CsasCSP16結合親和性高的配體分子。通過對CsasCSP16進行同源建模獲得其三維結構模型，以CSPMbraA6（PDB ID：1N8U）為模板成功構建CsasCSP16的三維結構模型。使用Autodock Vina軟件將CsasCSP16與親和性高的配體分子進行對接，構建蛋白-配體復合物。然后使用GROMACS（2019.3）軟件對復合物進行動力學模擬，從動力學模擬的平衡狀態(tài)中選取100個構象，使用g_mmpbsa軟件計算CsasCSP16與氣味分子的結合能，并通過能量分解的方法預測關鍵氨基酸殘基。成功構建了CsasCSP16的克隆表達載體，通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)獲得高純度的重組蛋白。與35種配體分子的熒光競爭結合表明，CsasCSP16與水楊酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和-蒎烯有較強的結合活性，其Ki值分別為6.59、6.25、3.50、6.73和4.47 μmol·L-1。分子對接的結果表明，CsasCSP16與水楊酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和-蒎烯的Vina Score值分別為-6.1、-5.3、-5.8、-5.2和-6.6。動力學模擬結果表明，CsasCSP16與氣味分子復合物在50 ns內達到平衡狀態(tài)，通過g_mmpbsa計算復合物的結合能，CsasCSP16-水楊酸甲酯、CsasCSP16-6-甲基-5-庚烯-2-酮、CsasCSP16-十五烷和CsasCSP16-庚酸丁酯的結合自由能分別為-50.264、-65.551、-136.035和-93.805 kJ·mol-1；最后，通過分解每個氨基酸貢獻的結合自由能表明異亮氨酸49（Ile49）、纈氨酸71（Val71）、異亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）貢獻的結合能＞3 kJ·mol-1，因此推測這4種氨基酸在CsasCSP16結合氣味分子的過程中發(fā)揮關鍵作用。桃小食心蟲CsasCSP16能與寄主植物的多種氣味分子結合，推測其可能在桃小食心蟲對寄主植物的定位過程中發(fā)揮重要作用。異亮氨酸49（Ile49）、纈氨酸71（Val71）、異亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）可能是CsasCSP16與配體分子結合的關鍵氨基酸位點。

桃小食心蟲；化學感受蛋白；原核表達；熒光競爭結合；分子對接；動力學模擬

0 引言

【研究意義】桃小食心蟲（）屬鱗翅目（Lepidoptera）蛀果蛾科（Carposidae），雌蟲將卵產在蘋果、桃、梨、山楂等果實的萼洼處或者果面，幼蟲孵化后蛀入果實內部縱橫串食，造成“豆沙餡”似的蟲果，給果農造成嚴重的經濟損失[1]。目前對桃小食心蟲的防控主要依靠化學農藥，但是大量化學農藥的使用導致天敵被誤殺并引起環(huán)境問題。隨著對昆蟲嗅覺機制研究的逐漸深入，引誘劑和趨避劑的開發(fā)為害蟲防控提供了新的思路和策略。研究桃小食心蟲化學感受蛋白（chemosensory protein，CSP）與寄主揮發(fā)物的識別和結合分子機制，對明確該蟲產卵定位和取食選擇以及建立基于昆蟲行為學的生態(tài)防控具有重要理論意義?！厩叭搜芯窟M展】嗅覺在昆蟲生理活動中發(fā)揮關鍵作用，例如定位產卵場所、尋找寄主植物和避免天敵危害等[2-3]。氣味受體（odorant receptor，OR）或離子型受體（ionotropic receptor，IR）具有分辨和識別不同氣味信號的功能。然而，疏水性的氣味分子到達神經元樹突激活氣味受體或離子型受體之前，通常需要與氣味結合蛋白（odorant binding protein，OBP）或化學感受蛋白相結合以復合物的形式穿過親水性的淋巴液，到達嗅覺神經元附近刺激嗅覺受體，化學信號轉化為電信號[4]。盡管OBP或CSP在嗅覺形成過程中的具體功能尚未完全探明，但是，在基因組和轉錄組中發(fā)現(xiàn)大量的OBP和CSP基因可能發(fā)揮關鍵作用[5-8]。CSP通常由100—120個氨基酸殘基組成，結構緊湊，主要由6個-螺旋形成一個疏水性的空腔。不同種類昆蟲的CSP都含有4個保守的半胱氨酸殘基，會形成兩個二硫鍵用以保持CSP三維結構的穩(wěn)定[9-10]。與OBP相比，CSP除了具有嗅覺功能外，還具有其他生理功能。CSP被鑒定出分布在不同的組織中。CSP首先在黑腹果蠅（）中被發(fā)現(xiàn)，命名為OS-D和A10，但當時關于CSP的功能還不清楚[11]。目前，有關CSP功能的信息在許多昆蟲中得到驗證。（1）CSP參與昆蟲的再生和發(fā)育。在螳螂中，CSP10參與螳螂若蟲斷足的再生；蜜蜂的CSP5與受精卵和表皮的發(fā)育有關[12-13]。（2）使用亞致死濃度的菊酯類農藥處理小菜蛾（）的研究中發(fā)現(xiàn)，有3個CSP（CSP3、CSP4和CSP8）基因表達量上調，推測CSP參與昆蟲抗藥性的形成[14-15]。（3）蝗蟲由散居型變成聚居型時，體內的CSP基因表達量提高，CSP可能與蝗蟲的聚集狀態(tài)改變有關[16]。（4）一些CSP在昆蟲喙和眼中作為營養(yǎng)吸收和視覺色素的載體[17]。（5）有研究表明，CSP在性腺或生殖器官中結合化學信息素信號，并協(xié)助它們釋放到環(huán)境中[18-20]。最后，CSP結合氣味分子和信息素分子，參與昆蟲嗅覺的形成過程，CSP在蚊類的淋巴液中富集并且對化學信息素具有很高的親和性；在蜜蜂觸角中高表達的CSP3可以與信息素結合[21]。CSP如此廣泛的表達譜和結合譜說明其在昆蟲的生命活動中發(fā)揮重要的作用。因此，有關CSP的具體生理功能需要深入研究?！颈狙芯壳腥朦c】筆者所在課題組前期從桃小食心蟲的觸角轉錄組中鑒定29個OBP基因，并發(fā)現(xiàn)2個GOBP和3個PBP基因，研究結果表明酯類、醛類和萜類等氣味分子是潛在的吸引物質[22-23]。前期研究發(fā)現(xiàn)，CsasCSP16在雌、雄成蟲的觸角和翅中均有表達[24]。本研究采用原核表達和熒光競爭結合試驗，研究CsasCSP16與35種小分子化合物的結合特性。使用分子對接和動力學模擬技術，預測CsasCSP16與小分子結合的關鍵位點?！緮M解決的關鍵問題】研究桃小食心蟲CsasCSP16與相關化合物的結合特性，并通過三維建模和分子動力學模擬方法研究CsasCSP16與配體結合的分子機制，為桃小食心蟲的綠色防控技術提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2018年7月至2020年3月在中國農業(yè)科學院果樹研究所完成。

1.1 供試昆蟲

供試種群于2018年7月采自中國農業(yè)科學院果樹研究所（40.61°N，120.73°E）試驗園。采集被桃小食心蟲幼蟲蛀入帶有“淚滴”危害狀的金冠蘋果，帶回實驗室，于（25±1）℃、相對濕度70%±5%、光周期L﹕D=15 h﹕9 h條件下飼養(yǎng)[25]。

1.2 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

分別取桃小食心蟲雌、雄成蟲全蟲以及觸角（100對）、頭部（去觸角，20頭）、胸部（10個）、腹部（10個）、足（20頭×6對）、翅（20對）等組織，按照TRIzol（TaKaRa）試劑盒說明書提取總RNA，用RNase-free水溶解，在檢測其濃度和純度后，再根據(jù)Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（perfect real-time）試劑盒反轉錄合成cDNA第一鏈，-20℃保存?zhèn)溆没蛑苯舆M行下一步試驗。

1.3 重組蛋白的原核表達和純化

根據(jù)CsasCSP16的開放閱讀框序列[24]，于http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/網(wǎng)站預測信號肽，去除信號肽后，設計帶有酶切位點HI正向引物和RI的反向引物，分別為CGATGCGCCC CGAAGAGCACT和TGTTATGGCCTTGAC GGTGCG。純化的PCR產物克隆到pMD-19T 載體，測序成功的pMD-19T/質粒和表達載體pET-28a進行雙酶切，按照T4 DNA連接酶試劑盒說明書將目的片段連接到pET-28a表達載體上，轉化到BL21（DE3）大腸桿菌細胞中，并將陽性菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)。當LB培養(yǎng)基的OD600值達到0.6—0.8時，加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，37℃培養(yǎng)4 h誘導重組蛋白表達。通過離心（8 000×，4℃，20 min）收集菌體并進行超聲處理（100 W，超聲16 min），收集上清和沉淀，經SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白主要在包涵體中，用10 ml的無咪唑的8 mol·L-1尿素溶液重懸分散沉淀，在冰水浴下100 W超聲10 min，留20 μL進行電泳檢測，4℃，5 000 r/min離心15 min收集上清[26]。

使用Ni-NTA親和層析柱對表達在沉淀中的重組蛋白進行純化后，放入透析袋中，經過（6、4、3、2、1、0 mol·L-1）梯度尿素緩沖液進行透析復性，每種梯度透析2 h[27]。透析緩沖液配方：5%甘油，1% L型精氨酸，0.1 mol·L-1EDTA，尿素，使用1×PBS溶解。

1.4 熒光競爭結合試驗

N-苯基-1-萘胺（1-NPN）用作CSP結合親和性研究的探針，選擇35種小分子化合物，包括33種蘋果揮發(fā)物和2種桃小食心蟲信息素組分。使用色譜級甲醇將1-NPN和氣味物質配制成1 mmol·L-1的工作液，蛋白用50 mmol·L-1的Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）稀釋成2 μmol·L-1，設定激發(fā)波長為337 nm，掃描發(fā)射光波長范圍350—600 nm。在濃度為2 μmol·L-1的CsasCSP16蛋白溶液中，逐一加入終濃度為0—20 μmol·L-1的1-NPN，直至熒光強度達到飽和，根據(jù)Scatchard方程計算CsasCSP16與1-NPN的結合常數(shù)。然后測定氣味物質與CsasCSP16的結合能力。將氣味物質加入CsasCSP16與1-NPN的混合液體系中，氣味標樣濃度依次從2 μmol·L-1梯度遞增。每種氣味物質重復測試3次。使用公式Ki= [IC50]/（1+[1-NPN]/K1-NPN）計算結合常數(shù)，其中IC50為熒光強度降至一半時加入的配基濃度，[1-NPN]是游離的1-NPN濃度，K1-NPN為重組蛋白CsasCSP16與1-NPN的結合常數(shù)[27]。

1.5 同源建模和分子對接

使用Modeller（version-9.19）構建CsasCSP16的三維結構模型，選擇CsasCSP16的氨基酸序列作為探針在PDB蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索，根據(jù)晶體結構的R-因子、序列連續(xù)性和結構相似性選擇最佳模板。使用Align2D軟件比對CsasCSP16與模板序列。Modeller中的自動建模程序生成100個構象，首先用共軛梯度法（conjugate gradient，CG）優(yōu)化每個構象。其次使用DOPE（discrete optimized protein energy）值來衡量CsasCSP16構象的穩(wěn)定性，最后使用Profile-3D方法和在線工具Swiss-model（https://swissmodel.expasy. org/assess）生成拉氏圖評價三維模型的合理性。

運用openbabel（https://sourceforge.net/projects/ openbabel/）工具將氣味分子轉換為pdb格式，并使用Autodock tools對氣味分子去水加氫。使用Autodock vina 軟件構建CsasCSP16與配體分子的蛋白復合物[28]。運用Autodock tool 1.5.7軟件包對CsasCSP16蛋白去水加氫，并生成坐標文件保存為PDBQT格式。配體分子結構的鍵設定為任意旋轉，設定網(wǎng)格參數(shù)為40點×40點×40點，格點間距為0.0375 nm，采用CB-DOCK軟件預測CsasCSP16表明可能的結合口袋，選擇前5個結合口袋進行對接[29]。通過局部能量搜索和拉馬克遺傳算法相結合的方法尋找對接構象。選擇默認的Vina-score作為打分值。最終，采用vina-score評價對接結果。使用PyMOL-2.3.0（http:// www.pymol.org/）顯示對接結果。

1.6 分子動力學模擬

使用GROMACS（2019.3）進行能量最小化和分子動力學模擬[30]。蛋白的拓撲結構使用CHARMM36力場自動生成[31]。配體的拓撲結構使用CGenFF服務器（https://cgenff.umaryland.edu/）生成。進行動力學模擬每個系統(tǒng)在截斷八面體周期邊界條件下使用TIP3P水模型進行溶劑化，截止距離為10，其中包含簡單電荷模型（sample point charge，SPC）的水分子，并在體系中加入抗衡離子（Na+和Cl-）使體系保持電中性。首先采用最陡下降法對復合物進行50 000步能量優(yōu)化，消除能量重疊。然后分別進行100 ps的正則系綜（NVT）和100 ps的等溫等壓系綜（NPT）模擬，使體系溫度保持在300 K，壓強保持在1×10-5pa的平衡狀態(tài)，采用周期性邊界條件和PME（Particle Mesh Ewald）方法處理長程靜電作用。通過V-rescale和Parrinello Rahman控制系統(tǒng)的溫度和壓力。使用LINCS算法固定所有原子之間的相對距離。模擬過程中采用的步長為2 fs，每1 ps保存一次軌跡用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。CsasCSP16復合物動力學模擬的質量由主鏈原子的均方根位移（root mean square deviation，RMSD）評價。

1.7 CsasCSP16蛋白復合物結合自由能計算

從分子動力學模擬過程中得到的配體與受體蛋白的相對結合自由能通常比分子對接得分具有更高的試驗結果相關性[32]。運用MM-PBSA方法計算得到CsasCSP16與配體分子之間的相對結合自由能ΔGbind[33]。

ΔGbind=ΔH-TΔS≈ΔEMM+ΔGsol-TΔS （1）

ΔEMM=ΔEint-ΔEele+ΔEvdW（2）

ΔGsol=ΔGPB+ΔGSA（3）

相對結合自由能計算中熵的變化可以忽略，ΔEint為配體與蛋白間的相互作用，ΔEele為靜電作用力，ΔEvdW為范德華力，ΔGsol為溶劑化作用，ΔGPB為極性溶劑化作用，ΔGSA為非極性溶劑化作用。非極性化與極性化作用計算采用APBS軟件，溶劑的介電常數(shù)設為80，復合物的介電常數(shù)設為1。從分子動力學模擬40—50 ns軌跡中每隔100 ps取一個構象，獲得相對結合自由能值，配體分子與CsasCSP16蛋白的相對結合自由能表明配體與蛋白結合能力的強弱，也反映配體分子存在于活性口袋中保持穩(wěn)定性的能力，這種能力往往是決定CsasCSP16與配體分子是否結合的關鍵因素。

1.8 CsasCSP16蛋白質復合物關鍵氨基酸能量分解

基于殘基分解的方法，對配體分子與氨基酸殘基之間的相互作用進行分析，定性描述配體分子與CsasCSP16的結合機理[34]。復合物中每個殘基分解能可以進一步分解為主鏈、側鏈和總的分解能。每個配體分子-殘基對（ΔGCsasCSP16-residue）的相互作用表示為：

ΔGCsasCSP16-residue=ΔEint-TΔS+ΔEvdW+ΔEele+ΔGPB+ ΔGCAVITY（4）

使用g_mmpbsa計算出配體分子與每個CsasCSP16殘基之間的范德華力（ΔEvdW）和靜電作用力（ΔEele）。ΔGPB表示由PB模型計算得出的對溶劑化自由能的靜電貢獻。通過基于相應SASA的經驗模型獲得了對溶劑化自由能（ΔGCAVITY）的非極性貢獻。內部能量（ΔEint）為零，因為它基于單個軌跡并且忽略了熵項（TΔS）。PB非極性溶劑化能量目前不可分解。

2 結果

2.1 CsasCSP16重組蛋白的表達與純化

通過終濃度為1 mmol·L-1IPTG 誘導結果顯示，在14 kD左右出現(xiàn)一條蛋白條帶。SDS-PAGE電泳顯示CsasCSP16重組蛋白主要在包涵體中表達，因此對包涵體進行復性處理后過柱純化獲得了CsasCSP16重組蛋白。在SDS-PAGE條帶上的大小與預測的分子量大小一致（圖1）。

2.2 CsasCSP16與配基的結合

為了進一步確定CsasCSP16在嗅覺方面的潛在作用，選擇33種氣味的化合物和2種信息素作為配體，運用熒光競爭結合試驗驗證CsasCSP16的結合特性（表1）。熒光探針1-NPN與CsasCSP16有良好的結合特性，其解離常數(shù)（Kd）為9.408 μmol·L-1，表明1-NPN可用于后續(xù)的競爭結合試驗。根據(jù)熒光競爭結合曲線（圖2）計算出CsasCSP16與配體分子結合的IC50和Ki值。結果表明，CsasCSP16與水楊酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和-蒎烯有較強的結合活性，其Ki值分別為6.59、6.25、3.50、6.73和4.47 μmol·L-1。

A：CsasCSP16 cDNA核苷酸序列及其推導的氨基酸序列，信號肽序列用下劃線標注，保守的半胱氨酸殘基用圓圈標注，終止密碼子用星號表示 Nucleotide and deduced amino acid sequence of CsasCSP14 cDNA. Signal peptide is underlined, conserved cysteine residues are marked in circles, the stop codons are denoted by asterisks [25]。B：CsasCSP16在大腸桿菌中的表達Induciton of the CsasCSP16 in E. coli；1：蛋白分子量標簽 Protein molecular weight marker；4：未誘導對照組 Control group without induction；2、3和5：IPTG誘導的表達產物 Expressed products induced by IPTG。C：超聲破菌結果The result of sonication；1：蛋白分子量標簽 Protein molecular weight marker；2：重組菌的上清蛋白The soluble fraction of recombinant E. coli；3：包涵體 Inclusion body。D：CsasCSP16重組蛋白的純化Purification of the CsasCSP16 recombinant protein；1：蛋白分子量標簽 Protein molecular weight marker；2：上柱前蛋白 The proteins before purified by NTA-Ni affinity chromatography；3：流出液Outflow；4：30 mmol·L -1咪唑Imidazole at 30 mmol·L -1；5：300 mmol·L-1咪唑Imidazole at 300 mmol·L-1

2.3 CsasCSP16蛋白質三維模型構建

選擇一致性（69%）最高的CSPMbraA6（登錄號：1N8U）晶體結構為模板構建CsasCSP16蛋白質的三維模型（圖3）。拉氏圖評價結果表明有94.4%的氨基酸殘基在最適區(qū)域內，5.6%的氨基酸殘基在允許區(qū)域內（圖 4）。Profile-3D的方法得到Verify Score值為37.81，遠遠高于要求的最低Verify Score值。CsasCSP16與CSPMbraA6疊合非常好，RMSD值為0.159（圖3-B）。綜上，CsasCSP16的分子三維模型是合理的，可用于后續(xù)的研究工作。

將CsasCSP16與水楊酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和-蒎烯5種氣味分子進行分子對接，得到的Vina Score值分別為-6.1、-5.3、-5.8、-5.2和-6.6。分子對接的結果與試驗數(shù)據(jù)相吻合。由CB-DOCK預測的結合口袋得出，5種氣味分子與CsasCSP16的結合部位均在疏水性結合腔內部的同一位置（圖5）。

2.4 CsasCSP16與氣味分子的動力學模擬

為了使CsasCSP16與配體分子復合物的結構與晶體結構更接近，將CsasCSP16與配體復合物放置于TIP3P顯性溶劑中進行了50 ns的動力學模擬。以CsasCSP16與配體分子在加熱階段的構象作為參考結構，使用RMSD值評估復合物的穩(wěn)定性。結果如圖6所示，CsasCSP16與水楊酸甲酯形成的復合物在10 ns時已經收斂達到平衡，RMSD值在0.2 nm左右波動；CsasCSP16與6-甲基-5-庚烯-2-酮形成的復合物在30 ns時達到平衡狀態(tài)，RMSD值穩(wěn)定在0.3 nm左右波動；CsasCSP16與十五烷形成的復合物在30 ns時達到收斂平衡，RMSD值在0.4 nm左右波動，CsasCSP16與十五烷的RMSD值波動較大，這可能與十五烷在結合腔內結構變化較大有關；CsasCSP16與庚酸丁酯在20 ns處達到收斂平衡，RMSD值穩(wěn)定在0.25 nm左右。由于-蒎烯在形成拓撲文件時，結構罰分值超過50，故未能進行動力學模擬。以上結果說明復合物已經達到平衡狀態(tài)，動力學模擬的結果達到期望值。

A、B：CsasCSP16與1-NPN的結合Binding curves of CsasCSP16 to 1-NPN；C：CsasCSP16與配體的熒光競爭結合fluorescence competition of CsasCSP16 with ligands；D：CsasCSP16對不同氣味物質的結合親和力（以1/Ki表示）的比較Comparison of the binding affinities (indicated by 1/Ki) of CsasCSP16 with different components

深綠色區(qū)域內為氨基酸殘基的最佳區(qū)域，綠色區(qū)域內為氨基酸殘基較合適的區(qū)域，其他區(qū)域為氨基酸殘基勉強許可區(qū)和不合理區(qū)

圖5 CsasCSP16在預測的結合口袋與不同氣味分子結合模式

圖6 CsasCSP16與配體復合物主鏈Cα原子RMSD隨時間變化曲線

表2 CsasCSP16與配體分子的結合自由能和組分

2.5 結合自由能

采用MM-PBSA的方法計算CsasCSP16與配體的結合自由能[33]。CsasCSP16-水楊酸甲酯、CsasCSP16-6-甲基-5-庚烯-2-酮、CsasCSP16-十五烷和CsasCSP16-庚酸丁酯的結合自由能分別為-50.264、-65.551、-136.035和-93.805 kJ·mol-1，顯然CsasCSP16可以與4種配體分子形成穩(wěn)定的復合物。該結果與熒光競爭結合試驗一致。結合自由能可以反映出哪些能量分項影響配體的親和力。從表2中發(fā)現(xiàn)范德華力能量向提供了主要的驅動力，其次為靜電作用力和非極性溶劑化能。溶劑化自由能非極性部分能提供負能量，不利于CsasCSP16與配體的結合，這是由于非極性的溶劑與配體分子相互排斥造成的。殘基與配體的空間結構和相互作用力的類型可以揭示這些氨基酸殘基與配體的關鍵相互作用。從圖7看出，CsasCSP16與配體分子主要是以范德華力連接在一起，并且水楊酸甲酯與蘇氨酸68（Thr68）形成氫鍵。從CsasCSP16與配體氣味分子三維結構圖（圖8）可以看出，氣味分子大多被包圍在由疏水性氨基酸組成的結合腔。

2.6 能量分解

使用MM-PBSA方法得到單個氨基酸殘基水平（per-residue level）的結合自由能貢獻值，其數(shù)值結果為單個氨基酸殘基與配體分子相互作用的總和。單個殘基能量貢獻詳細情況如圖9和表3所示，在CsasCSP16與水楊酸甲酯形成的復合物中，有6個氨基酸殘基的能量貢獻＞1 kJ·mol-1。其中異亮氨酸49（Ile49）貢獻的能量高達6.2 kJ·mol-1。相反，酪氨酸28（Tyr28）、谷氨酰胺64（Gln64）和蘇氨酸68（Thr68）不利于水楊酸甲酯的結合，提供了負面的能量貢獻；在CsasCSP16與6-甲基-5-庚烯-2-酮形成的復合物中，有11個氨基酸殘基貢獻的能量＞1 kJ·mol-1，相反，精氨酸50（Arg50）提供負面的能量貢獻，這是由于Arg50屬于親水性氨基酸，不利于CsasCSP16與6-甲基-5-庚烯-2-酮形成復合物。CsasCSP16與十五烷形成的復合物中，有14個氨基酸的能量貢獻＞1 kJ·mol-1，精氨酸91（Asp91）和組氨酸94（His94）提供反向結合的能量。CsasCSP16與庚酸丁酯形成的復合物中有14個氨基酸殘基貢獻的能量＞1 kJ·mol-1，利于CsasCSP16與配體相結合的氨基酸屬于疏水性氨基酸，Ile49、纈氨酸71（Val71）、異亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）貢獻的能量＞3 kJ·mol-1，并且Ile49參與了CsasCSP16與4種氣味分子結合的過程，由此可以推斷Ile49、Val71、Ile72和Tyr90可能是CsasCSP16與配體結合的關鍵氨基酸殘基。

圖7 CsasCSP16與配體相互作用的關鍵氨基酸殘基（二維結構）

圖8 CsasCSP16 與配體相互作用的氨基酸殘基（三維結構）

表3 主要殘基對結合自由能的貢獻

X軸表示CsasCSP16氨基酸殘基的序號數(shù)，Y軸表示配體與CsasCSP16氨基酸殘基之間的相互作用能量大小。重要的殘基用相應的文字標記

3 討論

在昆蟲嗅覺感器中，化學感受蛋白結合疏水性的氣味分子，穿過親水性的淋巴液，傳遞給嗅覺神經元，將化學信號轉化為電信號。本研究通過包涵體復性及Ni-NTA技術純化得到了較高純度的CsasCSP16蛋白，具有與天然蛋白一致的活性。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，含有His標簽的融合蛋白與不帶His標簽的融合蛋白對氣味分子的結合特性無影響[17]。結合特性研究結果表明，CsasCSP16與水楊酸甲酯、6-甲基-5庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和-蒎烯顯示出較強的結合特性，推測CsasCSP16可能是桃小食心蟲識別這些氣味分子的靶標基因。在觸角中高表達的其他昆蟲的CSP與寄主揮發(fā)物分子也具有較高的結合活性。如苜蓿盲蝽（）AlinCSP4與法尼烯、-法尼醇、-紫羅蘭酮有特異性的結合活性，AlinCSP1與3-己烯醇、2-己烯醛和正戊醛具有特異性結合的高親和活性[35]。CsasCSP16不僅在觸角中有表達，在雌、雄成蟲翅中的表達量要高于其他組織，這與蜜蜂CSP3的表達譜比較一致，在翅中的功能有待于進一步研究[36]。ZHOU等研究發(fā)現(xiàn)，飛蝗（）翅上存在許多化學感覺器，推測在翅中高表達的化學感受蛋白與接收寄主揮發(fā)物的次生代謝物有關[37]。本研究通過熒光競爭結合試驗篩選出5個與CsasCSP16結合的氣味分子，為進一步開發(fā)高效的引誘劑提供了參考依據(jù)。

熒光競爭結合試驗可辨別CSP與不同氣味分子的結合能力強弱，為了精確地揭示CSP與氣味分子結合的具體作用機制，需要準確了解蛋白晶體結構。Tian等通過對蘋果蠹蛾（）性信息素結合蛋白（CpomPBP2）三維建模、分子對接預測了其與35種氣味分子的親和性，結果發(fā)現(xiàn)CpomPBP2與十二烷醇親和性最高，熒光競爭結合表明CpomPBP2與十二烷醇抑制常數(shù)（Ki）值最小[38]。Venthur等用分子對接和分子動力學模擬預測歐洲葡萄蛾（）性信息素結合蛋白（LbotPBP1）與11種性信息素分子和6種寄主揮發(fā)物的結合機制，發(fā)現(xiàn)十二碳烯是LbotPBP1的最好配體[39]。Fan等在研究禾谷縊管蚜（）RpadOBP3與EBF相互作用的機制時，在疏水結構域中發(fā)現(xiàn)了3個氨基酸殘基與EBF結合緊密，分別為色氨酸71（Trp71）、色氨酸68（Trp68）、苯丙氨酸26（Phe26）[40]。這對于進一步研究桃小食心蟲CSP與氣味物質的作用機制具有指導性意義。

本研究進一步開展了CsasCSP16與熒光競爭結合篩選得到的5種氣味分子的分子對接，發(fā)現(xiàn)水楊酸甲酯與CsasCSP16的蘇氨酸68（Thr68）殘基之間形成氫鍵。這與Sandler等對家蠶（）BmorPBP1與蠶蛾醇的研究結果一致，他們認為氫鍵在BmorPBP1專一性識別性信息素過程中發(fā)揮關鍵作用[41]。因此，CsasCSP16蛋白能夠特異性識別水楊酸甲酯。水楊酸甲酯是許多植物的揮發(fā)物，由病蟲害誘導產生，且可趨避害蟲。如經斜紋夜蛾（）危害的水稻產生大量的水楊酸甲酯，可顯著趨避褐飛虱（）[42]。CHEN等研究發(fā)現(xiàn)，白背飛虱（）CfurCSP5與水稻揮發(fā)物水楊酸甲酯也具有高親和性[43]。CsasCSP16與高親和性氣味分子結合能研究發(fā)現(xiàn)，CsasCSP16-水楊酸甲酯結合自由能最高，為-50.264 kJ·mol-1，該結果與熒光競爭結合試驗一致；CsasCSP16與氣味分子的相互作用力主要是范德華力和疏水作用力，異亮氨酸49（Ile49）、纈氨酸71（Val71）、異亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）貢獻的結合能＞3 kJ·mol-1，因此推測這4種氨基酸在CsasCSP16結合氣味分子的過程中發(fā)揮關鍵作用。在Chen等對白背飛虱CfurCSP5與水稻揮發(fā)物分子對接的研究中發(fā)現(xiàn)，CfurCSP5與具有高親和性的氣味分子結合過程中亮氨酸44（Leu44）、異亮氨酸64（Ile64）、絲氨酸98（Trp98）和苯丙氨酸101（Phe101）等疏水性氨基酸均參與其中[43]。同樣地，在對小菜蛾CSPMbraA6與配體的研究中發(fā)現(xiàn)，亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）和色氨酸（Trp）是與配體結合過程中的關鍵氨基酸[9]。因此，推測CsasCSP16與水楊酸甲酯結合最關鍵的氨基酸為異亮氨酸，水楊酸甲酯是否可以用作桃小食心蟲尋找寄主的趨避物質有待于進一步探索。

4 結論

桃小食心蟲CsasCSP16能與寄主植物的5種氣味分子結合，可能參與桃小食心蟲對寄主揮發(fā)物的識別。分子對接發(fā)現(xiàn)異亮氨酸49（Ile49）、纈氨酸71（Val71）、異亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）可能是CsasCSP16與配體分子結合的關鍵氨基酸殘基。

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Ligands Binding Characteristics of Chemosensory Protein CsasCSP16 of

LIU XiaoHe1, QIU GuiSheng1, TONG ZhaoGuo2, ZHANG HuaiJiang1, YAN WenTao1, YUE Qiang1, SUN LiNa1

1Research institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xingcheng 125100, Liaoning;2School of Agriculture Science, Xichang University, Xichang 615013, Sichuan

【】is one of the most destructive pests on orchards in north China. The objectives of this study are to get the recombinant CsasCSP16 protein, characterize the binding profiles of CsasCSP16 with some small molecular volatiles from host plants, and predict the key residue between CsasCSP16 and putative ligands. In overall this research possibly lays a theoretical and practical foundation for the understanding of olfactory mechanism in.【】The recombinant protein CsasCSP16 was induced to express by constructing prokaryotic expression system, and purified by using the Ni-NTA agarose affinity column. Then, the fluorescence competitive assay was applied, and N-phenyl-1-naphthylamine (1-NPN) was selected as the fluorescence probe to measure the binding profiles of CsasCSP16 recombinant with 33 host plant volatiles and 2 sex pheromone compounds. The Modeller software was used to build three-dimensional model. CSPMbraA6 (PDB ID: 1N8U) was used as the template for homology modeling of CsasCSP16 protein structure. The modeled structure of CsasCSP16 was docked with 35 selected ligands by Autodock vina. Then, the complexes from above step were introduced to GROMACS (2019.3) to conform the stability. Moreover, the binding energies of the complexes were calculated by g_mmpbsa and the key residues interaction between CsasCSP16 and host volatiles were predicted.【】The recombinant expression vector was successfully constructed, and the recombinant protein of CsasCSP16 with high purity was obtained by bacterial system. Further, competitive fluorescence binding assays with 35 candidate ligands showed that CsasCSP16 had high binding affinities against methyl salicylate, 6-methyl-5-hepten-2-one, pentadecane, butyl heptanoate and-pinene, and the recorded Ki values were 6.59, 6.25, 3.50, 6.73 and 4.47 μmol·L-1, respectively. Ligand docking results revealed that the Vina Scores of CsasCSP16-methyl salicylate, CsasCSP16-6-methyl-5-hepten-2-one, CsasCSP16-pentadecane, CsasCSP16-butyl heptanoate and CsasCSP16--pinene were -6.1, -5.3, -5.8, -5.2 and -6.6, respectively. Finally, the g_mmpbsa analysis demonstrated that the binding energies of CsasCSP16-methyl salicylate, CsasCSP16-6-methyl-5- hepten-2-one, CsasCSP16-pentadecane and CsasCSP16-butyl heptanoate were -50.264, -65.551, -136.035 and -93.805 kJ·mol-1, respectively. Ile49, Val71, Ile72 and Tyr90 contribute energy more than 3 kJ·mol-1, suggesting their key involvement in the function of CsasCSP16. 【】The CsasCSP16 has a certain binding capacity with several odors from host plant volatiles, suggesting that it may play an important role in the localization of host plants. Ile49, Val71, Ile72, and Tyr90 may be the key residues involved in the function of CsasCSP16.

; chemosensory protein (CSP); prokaryotic expression; competitive binding; molecular docking; dynamic simulation

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.007

2020-05-11；

2020-06-22

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0200300）、國家自然科學基金（31601643）

劉孝賀，E-mail：liuxiaoheaye@163.com。通信作者孫麗娜，E-mail：sunlina@caas.cn

（責任編輯 岳梅）