郝慧瑤，張榮金，張 芳，劉青娟，郝詠梅

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院,河北 石家莊 050000)

2型糖尿病和肥胖目前已成為世界流行病，二者間關(guān)系密切，中國超重與肥胖人群的糖尿病患病率分別為12.8%和18.5%[1]。2型糖尿病尤其是肥胖患者在高血糖的同時，常伴有脂代謝異常，長期高血脂在糖尿病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其產(chǎn)生的脂毒性作用備受關(guān)注。脂毒性中，以循環(huán)血液中游離脂肪酸(Free fatty acid，F(xiàn)FA)的升高最為重要，F(xiàn)FA短期升高可以刺激胰島β細(xì)胞大量分泌胰島素，但長期高水平FFA則會抑制胰島素分泌，從而導(dǎo)致胰島素抵抗[2]?，F(xiàn)已證實，胰島β細(xì)胞上存在胰島素信號通路，該通路障礙可使β細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗，表現(xiàn)為β細(xì)胞分泌功能障礙[3]。本研究旨在探討FFA在胰島β細(xì)胞損傷中的作用及相關(guān)機制。

1 實驗材料和方法

1.1材料 棕櫚酸購自美國Sigma公司；鼠抗p-Akt-473單克隆抗體(SC-81433)、鼠抗Akt單克隆抗體(SC-5298)購自美國Santa Cruz公司；噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測試劑盒購自美國Sigma公司；胰島素放射免疫試劑盒購自普爾偉業(yè)生物公司。小鼠胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞系(βTC3細(xì)胞系) 由丹麥哥本哈根諾和諾德公司研發(fā)中心惠贈，并由本科室保存。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)方法 在37 ℃含5% CO2條件下，用含10%胎牛血清、2% L-谷氨酰胺、1%青霉素/鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)βTC3細(xì)胞，細(xì)胞隔天換液1次，3～4 d傳代1次，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀況。待細(xì)胞貼壁75%，用無血清的培養(yǎng)基同步24 h后用于實驗。

1.3實驗方法 將細(xì)胞分為空白組、棕櫚酸0.2 mmol/L組、棕櫚酸0.4 mmol/L組、棕櫚酸0.8 mmol/L組。

1.3.1細(xì)胞增殖檢測 將5×104/mL呈指數(shù)生長的βTC3細(xì)胞接種于96孔板，每孔200 μL，空白組給予正常培養(yǎng)，棕櫚酸0.2 mmol/L組、棕櫚酸0.4 mmol/L組、棕櫚酸0.8 mmol/L組分別加入相應(yīng)濃度棕櫚酸培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，向各孔中加入MTT溶液10 μL[0.5%(wt/vol)in PBS]，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h后離心棄上清，再加入二甲基亞砜終止反應(yīng)，全自動酶標(biāo)儀檢測420 nm處光密度值(A值)。

1.3.2細(xì)胞凋亡檢測 細(xì)胞培養(yǎng)同1.3.1，培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞懸液，加入碘化丙啶(PI)染液，4 ℃避光放置30 min后制備單細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。應(yīng)用Expo32ADC軟件進(jìn)行分析，在二倍體細(xì)胞峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰判定為凋亡細(xì)胞峰，根據(jù)亞二倍體峰的分布組方圖計算細(xì)胞的凋亡率。

1.3.3Akt、p-Akt蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法檢測： 細(xì)胞培養(yǎng)同1.3.1，培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液(含PMSF 1 mmol/L)，于冰上裂解20 min，以14 000×g 4 ℃離心5 min。用BCA法測定蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液于95 ℃變性5 min，以10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，每孔上樣20 μg，80 V電壓電泳。電泳結(jié)束，切下含目的蛋白條帶的膠條，80 V轉(zhuǎn)膜1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉于搖床室溫封閉1 h，在TBST中搖動洗膜3×8 min，分別加入兔抗Akt和p-Akt抗體，抗體均1∶500稀釋，4 ℃過夜。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，以 β-actin作為內(nèi)參照。Western blot條帶信號強度應(yīng)用LabWork 45圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，測定各條帶的吸光度值(IOD)。

1.3.4胰島素分泌水平檢測 細(xì)胞培養(yǎng)同1.3.1，培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞，用含1.6 mmol/L葡萄糖的KRHB緩沖液洗滌細(xì)胞2次，然后分別在含2.8 mmol/L和22.4 mmol/L葡萄糖的KRHB液中，37 ℃孵育1 h，收集上清，采用放射免疫法測定胰島素水平，具體步驟按照胰島素放射免疫試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，多個實驗組和空白組的比較采用Dunnett法，組間多重比較采用SNK檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組βTC3細(xì)胞增殖和凋亡情況 棕櫚酸各組βTC3細(xì)胞的增殖率均明顯低于空白組(P均<0.05)，且隨棕櫚酸干預(yù)濃度的增高，細(xì)胞的增殖率逐漸降低，呈明顯的劑量依賴性，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，見圖1；棕櫚酸各組βTC3細(xì)胞的凋亡率均明顯高于空白組(P均<0.05)，且隨棕櫚酸干預(yù)濃度的增高，細(xì)胞的凋亡率逐漸升高，呈明顯的劑量依賴性，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，見圖2。

1為空白組，2為棕櫚酸0.2 mmol/L組，3為棕櫚酸0.4 mmol/L組，4為棕櫚酸0.8 mmol/L組

1為空白組，2為棕櫚酸0.2 mmol/L組，3為棕櫚酸0.4 mmol/L組，4為棕櫚酸0.8 mmol/L組

2.2各組βTC3細(xì)胞中p-Akt、Akt表達(dá)水平 各組之間Akt表達(dá)情況比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；棕櫚酸各組βTC3細(xì)胞中p-Akt表達(dá)水平均明顯低于空白組(P均<0.05)，且隨棕櫚酸干預(yù)濃度的增高，p-Akt表達(dá)水平逐漸降低，呈明顯的劑量依賴性，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3。

1為空白組，2為棕櫚酸0.2 mmol/L組，3為棕櫚酸0.4 mmol/L組，4為棕櫚酸0.8 mmol/L組

2.3各組βTC3細(xì)胞中胰島素分泌情況 2.8 mmol/L葡萄糖刺激后，棕櫚酸各組βTC3細(xì)胞中胰島素分泌水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，且隨棕櫚酸干預(yù)濃度的增高，胰島素分泌水平逐漸增高，呈明顯的劑量依賴性，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。22.4 mmol/L葡萄糖刺激后，棕櫚酸各組βTC3細(xì)胞中胰島素分泌水平均明顯低于空白組(P均<0.05)，且隨棕櫚酸干預(yù)濃度的增高，胰島素分泌水平逐漸降低，呈明顯的劑量依賴性，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖4。

圖4 不同濃度高糖刺激各組βTC3細(xì)胞中胰島素分泌情況

3 討 論

2型糖尿病是糖尿病中最常見的一種類型，約占糖尿病的95%，其主要的病理生理特征為胰島素作用異常和/或分泌障礙，病程早期以胰島素抵抗為主并伴有胰島素相對分泌缺乏，病程晚期以胰島素分泌缺陷為主仍伴胰島素抵抗。2型糖尿病具體的發(fā)病機制尚未完全闡明，功能性胰島β細(xì)胞數(shù)量的減少起著重要的作用，其中胰島β細(xì)胞凋亡是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的一個重要因素[4-5]。此外，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展亦與肥胖密切相關(guān)[1]。肥胖可引起循環(huán)中FFA水平升高和脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)紊亂，這是導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)病率增高的主要因素。

肥胖尤其是腹型肥胖可產(chǎn)生大量FFA、瘦素、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子α等多種細(xì)胞因子，而這些細(xì)胞因子參與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展[6]。 其中FFA是參與大多數(shù)生物體能量代謝的營養(yǎng)物質(zhì)，主要由脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸分解而來。有研究證據(jù)表明，F(xiàn)FA水平增高會增加患2型糖尿病和肥胖的風(fēng)險[1，6]，且在發(fā)病初期，其會導(dǎo)致胰島素抵抗，但此時機體可通過促進(jìn)β細(xì)胞代償性增加，促進(jìn)胰島素分泌，以彌補胰島素的不敏感性。隨著病情發(fā)展，血漿FFA濃度的持續(xù)慢性升高可進(jìn)一步導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，脂毒性導(dǎo)致β細(xì)胞功能和生存能力下降，從而誘發(fā)2型糖尿病[7-8]。脂毒性引起胰島β細(xì)胞凋亡相關(guān)機制一直是糖尿病研究領(lǐng)域的熱點。FFA根據(jù)碳?xì)洇骆滐柡团c不飽和的不同可分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。其中飽和脂肪酸棕櫚酸可以降低胰島β細(xì)胞的增殖能力，可通過釋放細(xì)胞色素C和激活caspase-3，誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞發(fā)生凋亡[9-12]；且胰島β細(xì)胞暴露于慢性升高的棕櫚酸環(huán)境中，胰島β細(xì)胞分泌胰島素的功能會明顯下降[13-14]。本實驗選取棕櫚酸刺激培養(yǎng)βTC3細(xì)胞，結(jié)果表明βTC3細(xì)胞增殖率較空白組明顯降低，βTC3細(xì)胞凋亡率較空白組明顯增高，且均隨著棕櫚酸干預(yù)濃度的增高呈劑量依賴性降低或增高。可見抑制胰島β細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡是棕櫚酸抑制胰島β細(xì)胞分泌胰島素的重要原因之一，與上述既往研究結(jié)果相符。

絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt是磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)信號通路中的下游靶點，在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用。PI3K是胰島素信號途徑的必要條件，當(dāng)胰島素與靶細(xì)胞膜上的胰島素受體結(jié)合后，胰島素受體被磷酸化激活[15]，而活化的胰島素受體又與細(xì)胞內(nèi)胰島素受體底物結(jié)合并使其激活[16]。激活的胰島素受體底物結(jié)合并激活PI3K，后者進(jìn)一步激活A(yù)kt，Akt活化后可激活葡萄糖轉(zhuǎn)運體，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運進(jìn)而降低血糖[17]。PI3K/Akt通路中的任何環(huán)節(jié)異常均可導(dǎo)致胰島素信號障礙，從而誘發(fā)胰島素抵抗。胰島β細(xì)胞上存在胰島素受體，其也可以通過上述信號途徑促使胰島β細(xì)胞分泌胰島素[18]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸各組βTC3細(xì)胞中p-Akt表達(dá)水平均明顯降低，且隨棕櫚酸干預(yù)濃度的增高呈劑量依賴性降低，提示棕櫚酸可抑制胰島β細(xì)胞上PI3K/Akt通路的激活，且隨棕櫚酸濃度的增高抑制作用增強。此外，2.8 mmol/L葡萄糖刺激后，棕櫚酸各組βTC3細(xì)胞中胰島素分泌水平均明顯增高，且隨棕櫚酸干預(yù)濃度的增高呈明顯的劑量依賴性增高，提示棕櫚酸可促進(jìn)低糖刺激的βTC3細(xì)胞分泌胰島素；22.4 mmol/L葡萄糖刺激后，棕櫚酸各組βTC3細(xì)胞中胰島素分泌水平均明顯降低，且隨棕櫚酸干預(yù)濃度的增高呈明顯的劑量依賴性降低，提示棕櫚酸可抑制高糖刺激的βTC3細(xì)胞分泌胰島素，可見在高糖環(huán)境下，棕櫚酸介導(dǎo)了胰島β細(xì)胞的分泌功能障礙。

綜上所述，棕櫚酸可抑制βTC3細(xì)胞增殖，促進(jìn)βTC3細(xì)胞凋亡，并可抑制高糖刺激后βTC3細(xì)胞分泌胰島素，這些可能是由棕櫚酸刺激導(dǎo)致PI3K/Akt通路受抑制介導(dǎo)的。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。