陳玉華，盧 松

(1.湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435000；2.黃石市中醫(yī)醫(yī)院康復(fù)科，湖北 黃石 435003）

風(fēng)濕安泰片是由馬錢子(制)、羌活、麻黃、紅花、紅參、金銀花、黃柏、淫羊藿等25 味藥材組成的純中藥制劑,具有舒筋活血、祛風(fēng)鎮(zhèn)痛作用,臨床上用于治療腰腿疼痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等［1-2］,方中馬錢子(制) 屬于毒性藥材,主要有效成分為馬錢子堿、士的寧,毒性較大,安全范圍較窄［3］。2020 年版《中國(guó)藥典》 一部規(guī)定,風(fēng)濕安泰片中羌活、麻黃、金銀花、黃柏、淫羊藿、紅參的有效成分分別為異歐前胡素、麻黃堿和偽麻黃堿、綠原酸、小檗堿、柚皮苷和淫羊藿苷、人參皂苷(Rg1、Rb1、Re),但其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)［4］質(zhì)量控制水平落后,未對(duì)其有效成分進(jìn)行含量測(cè)定。目前,風(fēng)濕安泰片中指標(biāo)成分含量測(cè)定有少量報(bào)道［5-7］,但尚未涉及3 種以上。

UPLC-MS/MS 具有高靈敏度、高專屬性的特點(diǎn),可簡(jiǎn)化復(fù)雜混合物的分離純化過程［8］,近年來被廣泛應(yīng)用于中成藥中多成分的定量測(cè)定［9-17］。因此,本實(shí)驗(yàn)采用該方法同時(shí)測(cè)定風(fēng)濕安泰片中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、士的寧、馬錢子堿、綠原酸、鹽酸小檗堿、柚皮苷、淫羊藿苷、異歐前胡素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re的含量,以期為評(píng)價(jià)該制劑的質(zhì)量特征提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 超高壓液相色譜系統(tǒng),配置6460 QQQ 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent 公司)；KS-9983-2 雙頻臺(tái)式超聲波清洗機(jī)(45 kHz、500 W,鄭州萬博儀器設(shè)備有限公司)；XD205DU電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試劑與藥物 鹽酸麻黃堿 (批號(hào)171241-201809,純 度 100%)、鹽酸偽麻黃堿 (批 號(hào)171237-201510,純 度99.8%)、士的寧 (批 號(hào)100240-200701,純度100%)、馬錢子堿 (批號(hào)110706-200505,純 度95.9%)、綠原酸 (批 號(hào)110753-202018,純度96.8%)、鹽酸小檗堿(批號(hào)110713-201814,純 度86.7%)、柚皮苷 (批 號(hào)110722-201815,純度91.7%)、淫羊藿苷 (批號(hào)110737-201516,純度94.2%)、異歐前胡素(批號(hào)110827-201812,純度99.6%)、人參皂苷Rg1 (批號(hào)110703-201933,純度93.4%)、人參皂苷Rb1(批號(hào)110704-202028,純度93.1%)、和人參皂苷Re (批號(hào)110754-202028,純度93.9%) 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。風(fēng)濕安泰片(通化茂祥制藥有限公司,批號(hào)180401、180402；山西仁源堂藥業(yè)有限公司,批號(hào)20 191102；河南輔仁堂制藥有限公司,批號(hào)191101、190604；通藥制藥集團(tuán)股份有限公司,批號(hào)191114)。甲醇、乙腈、乙酸為色譜純(德國(guó)Merck 公司)；超純水由Milli-Q 超純水儀制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、士的寧、馬錢子堿、綠原酸、鹽酸小檗堿、柚皮苷、淫羊藿苷、異歐前胡素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re 對(duì)照品各10 mg,置于10 mL 量瓶中,70%甲醇稀釋至刻度,制得1 mg/mL 貯備液。分別精密量取0.02、0.02、0.5、0.5、2.0、1.0、2.0、1.0、0.2、0.1、0.1、0.2 mL,置于同一50 mL 量瓶中,70%甲醇稀釋至刻度,搖勻,制得各成分質(zhì)量濃度分別為0.42、0.47、13.14、12.04、39.08、21.09、40.02、4.28、2.00、20.35、2.27、4.12 μg/mL 的貯備液,各精密量取1 mL 至50 mL 量瓶中,70%甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.2 供試品溶液制備 取片劑10 片,研成細(xì)粉,精密稱取0.4 g,置于50 mL 量瓶中,70%甲醇超聲處理20 min 溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 UPLC 條 件Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相0.1% 乙酸(A) -甲醇(B),梯度洗脫(0～7 min,5%B；7～15 min,5%～70% B；15～22 min,70%～100% B；22～23 min,100%～5%B；23～30 min,5%B；30～35 min,5% B)；體積流量0.2 mL/min；柱 溫40 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.4 MS 條件 電噴霧離子源,正離子模式(ESI+),多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),溫度350 ℃；霧化器壓力40 psi (1 psi=0.133 kPa)；干燥氣體積流量12 L/min,溫度250 ℃。分別對(duì)每種成分進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,選擇響應(yīng)值最大的碎片離子作為定量離子對(duì),第二大者作為定性離子對(duì),離子對(duì)檢測(cè)參數(shù)見表1。

表1 離子對(duì)檢測(cè)參數(shù)Tab.1 Detection parameters for ion pairs

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品溶液,在“2.3” “2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,各成分總離子流圖見圖1。由此可知,麻黃堿、偽麻黃堿雖然有相同定量離子對(duì),但通過調(diào)整流動(dòng)相比例能使兩者有效分離,并且對(duì)照品定位可對(duì)其進(jìn)行有效定性與定量；各成分響應(yīng)值雖然有所差異,但均對(duì)測(cè)定無干擾。

圖1 各成分總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of various constituents

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1” 項(xiàng)下貯備液1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02 mL,置 于10 mL量瓶中,70% 甲醇制成系列質(zhì)量濃度,在“2.3” “2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X) 進(jìn)行回歸,并分別以S/N=3、S/N=10 為檢測(cè)限(LOD)、定量限(LOQ),結(jié)果見表2,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液1 μL,在“2.3” “2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6次,測(cè)得麻黃堿、偽麻黃堿、士的寧、馬錢子堿、綠原酸、小檗堿、柚皮苷、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、淫羊藿苷、人參皂苷Rb1、異歐前胡素峰面積RSD 分別為0.9%、1.1%、0.7%、0.6%、1.0%、1.1%、0.8%、0.6%、0.7%、0.5%、0.2%、1.0%,表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批片劑(批號(hào)180401),按“2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.3” “2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得麻黃堿、偽麻黃堿、士的寧、馬錢子堿、綠原酸、小檗堿、柚皮苷、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、淫羊藿苷、人參皂苷Rb1、異歐前胡素含量RSD 分別為0.4%、0.5%、0.8%、0.4%、0.5%、0.3%、0.9%、1.0%、0.7%、0.9%、1.0%、0.2%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批片劑(批號(hào)180401),按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,于0、1、2、4、8、16、24 h 在“2.3” “2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得麻黃堿、偽麻黃堿、士的寧、馬錢子堿、綠原酸、小檗堿、柚皮苷、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、淫羊藿苷、人參皂苷Rb1、異歐前胡素峰面積RSD 分別為1.1%、1.0%、0.9%、1.2%、0.6%、1.2%、1.2%、1.1%、1.5%、0.8%、0.8%、1.2%,表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的片劑(批號(hào)180401) 10 片,研成細(xì)粉,精密稱取9 份,每份0.2 g,置于50 mL 量瓶中,精密加入“2.1”項(xiàng)下貯備液0.8、1.0、1.2 mL,每個(gè)水平平行3 份,70%甲醇超聲處理20 min 并稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,在“2.3” “2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果,麻黃堿、偽麻黃堿、士的寧、馬錢子堿、綠原酸、小檗堿、柚皮苷、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、淫羊藿苷、人參皂苷Rb1、異歐前胡素平均加樣回收率分別為93.51%、101.6%、99.6%、97.1%、96.5%、101.2%、102.3%、95.3%,103.2%、100.2%、98.7%、99.3%,RSD 分別為0.9%、1.9%、1.7%、0.8%、0.8%、1.1%、1.2%、1.1%、0.9%、1.2%、1.1%、1.2%。

2.11 樣品含量測(cè)定 取4 個(gè)生產(chǎn)廠家6 批片劑,按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,每批平行2份,在“2.3” “2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,外標(biāo)法計(jì)算含量,結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（n=2）Tab.3 Results of content determination of various constituents （n=2）

3 討論

鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿屬于同分異構(gòu)體,具有相同的定量離子對(duì),需要通過對(duì)照品定位進(jìn)行定性。當(dāng)有機(jī)相比例為5% 時(shí),兩者能有效分離,而且甲醇分離度優(yōu)于乙腈。

本實(shí)驗(yàn)以水-甲醇、水(含0.1%甲酸) -甲醇、水(含0.1% 乙酸) -甲醇、水(含10 mmol/L 甲酸銨) -甲醇為流動(dòng)相,考察各成分分離度及響應(yīng)值,發(fā)現(xiàn)水相中加入乙酸后更容易使化合物離子化,從而提高各成分響應(yīng)值,而鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿在水(含0.1% 乙酸) -甲醇中的分離度最好。然后,考察了提取溶劑(水、50% 甲醇、70% 甲 醇、甲 醇)、提取時(shí)間(10、20、30、40 min),發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取出的成分最多；超聲處理20 min 后各成分提取完全。最終確定,供試品溶液制備方法為70%甲醇超聲提取20 min。

在6 批風(fēng)濕安泰安片中,各成分含量差異較大,以綠原酸最明顯(301.21～645.56 μg/g),其次是士的寧 (84.44～256.05 μg/g)、馬錢子堿(93.78～278.35 μg/g),差異最小的為人參皂苷Rb1 (1.04～5.54 μg/g)。雖然結(jié)果均在設(shè)計(jì)的曲線范圍內(nèi),但相關(guān)生產(chǎn)廠家也應(yīng)加以關(guān)注。