陳青青，任蓉蓉，張青青，楊 曄，2，3，4*

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230012；3.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；4.中藥復(fù)方安徽省重點實驗室，安徽合肥 230012）

桔?；蛞云錇橹魉幍姆絼┰谂R床上常用于治療慢性支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病［1］,主要活性成分為桔梗皂苷D,也是藥材及制劑質(zhì)量控制的指標物質(zhì)。但該成分脂溶性差,口服后難以透過腸細胞膜吸收入血［2］。

腸道是藥物口服吸收利用的主要場所,小分子可被其直接吸收,而某些物質(zhì)則需要通過特定通道或受體才能被人體吸收,其中細胞旁路轉(zhuǎn)運是桔梗皂苷D 透過腸黏膜吸收的主要途徑［3］。緊密連接是細胞旁路物質(zhì)轉(zhuǎn)運途徑的“看門人”,具有選擇性滲透作用；閉鎖蛋白、閉合蛋白、閉合小環(huán)蛋白等是構(gòu)成緊密連接結(jié)構(gòu)的主要部分,其表達水平和分布可影響緊密連接的開放或閉合,改變細胞單層通透性,影響藥物細胞旁路途徑被動轉(zhuǎn)運［4］。

中醫(yī)臨床上,桔梗大多通過湯劑形式給藥,并以水為溶劑,在煎煮過程中能將藥物有效成分充分溶入湯液,吸收快,生物利用度高［5］。現(xiàn)代研究將湯劑的良好療效大多歸因于配伍藥物的相互促進吸收,但同一提取物中各成分之間也可能會相互影響［6］。因此,本實驗通過在體腸灌注模型研究桔梗中含量較高的多糖對桔梗皂苷D 在體腸吸收特性的影響,并對緊密連接表達水平作出評價,以期闡明中藥湯劑活性成分腸吸收的作用機制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 桔梗多糖(批號DST191105-178,純 度 ≥98%)、桔梗皂苷D (批號DST191103-015,純度≥98%) 對照品(成都德思特生物技術(shù)有限公司)。Claudin-1 兔抗鼠多克隆抗體(武漢華美生物工程有限公司)；Occludin、ZO-1 兔抗鼠多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Cy3-山羊抗兔IgG (美國Abbkine 公司)；DAPI (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。乙腈、甲醇為色譜純(瑞典Oceanpak 公司)；其余試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 儀器 HL-2 型恒流泵(嘉鵬科技有限公司)；HH-S2 型恒溫水浴鍋(江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠)；TG16-WS 型臺式高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；DM2000 型熒光顯微鏡(德國Leica 公司)；LC-20AOXR 型液相色譜儀(日本島津公司)；Milli-Q 型超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.3 動物 雄性SD 大鼠,體質(zhì)量(200±20) g,購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心,動物生產(chǎn)許可證號SCXK (皖) 2017-001。實驗開始前,大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 人工腸液Kreb-Ringer 試劑(K-R 液)稱取NaCl 8 g、KCl 0.28 g、NaHCO31 g、NaH2PO40.05 g、MgCl20.1 g,溶于500 mL 超純水中,作為A 液；稱取CaCl20.2 g、葡萄糖1 g,溶于500 mL超純水中,作為B 液,密封冷藏,用時將A、B 液等比例混合,即得。

2.1.2 空白腸灌流液 將K-R 液置于37 ℃水浴鍋中孵育至恒溫,進行大鼠在體腸循環(huán)實驗,收集循環(huán)液,即得。

2.1.3 腸灌流液 精密稱取適量桔梗皂苷D 對照品,K-R 液溶解定容至20 μg/mL,作為對照組腸灌流液；精密稱取3 種質(zhì)量的桔梗多糖,溶于對照組腸灌流液中,分別調(diào)節(jié)其質(zhì)量濃度至1、2、4 mg/mL,作為低、中、高劑量多糖組腸灌流液。

2.2 方法學考察

2.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相乙腈-水(25 ∶75)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長206 nm；進樣量20 μL。

2.2.2 樣品處理 取腸灌流液2 mL,12 000 r/min離心5 min,上清液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾,濾液在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。

2.2.3 專屬性試驗 取空白腸灌流液、對照組腸灌流液、中劑量多糖組腸灌流液,按“2.2.2” 項下方法處理,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定,結(jié)果見圖1。由此可知,桔梗皂苷D 保留時間約為11.8 min,空白灌流液、桔梗多糖均不干擾測定(分離度大于1.5),表明該方法專屬性良好。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取桔梗皂苷D 對照品適量,空白腸灌流液溶解并定容至100 μg/mL,再依次稀釋至50、30、25、20、15、10 μg/mL,按“2.2.2” 項下方法處理,取上清液,在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標(Y),桔梗皂苷D 質(zhì)量濃度為橫坐標(X) 進行回歸,得方程為Y=2 724.6X-24 531(R2=0.999 0),在10～50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗 空白腸灌流液配制低、中、高質(zhì)量濃度(15、30、45 μg/mL) 對照品溶液,每個質(zhì)量濃度平行3 份,按“2.2.2” 項下方法處理,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得桔梗皂苷D 峰面積RSD 分別為0.45%、0.82%、0.60%,表明該方法重復(fù)性良好。

圖1 桔梗皂苷D HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of platycodin D

2.2.6 精密度試驗 空白腸灌流液配制低、中、高質(zhì)量濃度(15、30、45 μg/mL) 對照品溶液,按“2.2.2” 項下方法處理,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定,同一天內(nèi)重復(fù)6 次,測得日內(nèi)精密度RSD 分別為2.18%、1.96%、0.53%；每天1 次,連續(xù)3 d,測得日間精密度RSD 分別為2.99%、1.81%、0.65%,表明該方法精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 空白腸灌流液配制低、中、高質(zhì)量濃度(15、30、45 μg/mL) 對照品溶液,每個質(zhì)量濃度平行3 份,置于37 ℃恒溫水浴鍋中,于0、2 h 取樣,再于室溫下6、12、24 h 取樣,按“2.2.2” 項下方法處理,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得桔梗皂苷D 峰面積RSD 分別為3.45%、1.36%、0.68%,表明桔梗皂苷D 在37 ℃水浴、室溫下穩(wěn)定性良好,符合生物樣品測定要求。

2.2.8 加樣回收率試驗 空白腸灌流液配制低、中、高質(zhì)量濃度(15、30、45 μg/mL) 對照品溶液,每個質(zhì)量濃度平行3 份,按“2.2.2” 項下方法處理,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定,以測得質(zhì)量濃度與實際質(zhì)量濃度之比為回收率。結(jié)果,低、中、高質(zhì)量濃度下桔梗皂苷D 加樣回收率分別為(102.50±3.48)%、(100.13±2.36)%、(100.34 ± 3.48)%,RSD 分別為 3.39%、2.36%、3.47%。

2.3 在體腸吸收實驗 參考文獻［7-8］ 報道。

2.3.1 造模 大鼠隨機分為對照組及桔梗多糖低、中、高劑量組,每組5 只。實驗前大鼠禁食12 h,自由飲水,腹腔注射20%烏拉坦(5 mL/kg) 麻醉后固定,沿腹中線剪開腹腔,選取10 cm 左右腸段,兩端切口,插管結(jié)扎,用浸有生理鹽水的紗布將傷口覆蓋保濕(其間不停地滴加預(yù)熱至37 ℃的生理鹽水),紅外燈照射取暖以維持體溫,用預(yù)熱至37 ℃的生理鹽水排凈腸內(nèi)容物后,換成K-R 液平衡腸道內(nèi)環(huán)境15 min,排空氣法將腸內(nèi)液體全部排出,加入25 mL “2.1” 項下腸灌流液進行在體腸循環(huán)灌注,體積流量0.2 mL/min。當灌流液充滿整個循環(huán)通路時,記為初始時刻,此時取灌流液1 mL 并補加相同體積空白K-R 液,循環(huán)90 min 后排凈管路液體,讀取剩余灌流液體積并取樣。灌流結(jié)束后處死大鼠,剪下灌流腸段,手術(shù)絲線附著法測定其內(nèi)徑和長度,并置于中性福爾馬林溶液中固定,對組織進行石蠟包埋、切片。

2.3.2 腸吸收參數(shù)計算

2.4 免疫熒光染色檢測緊密連接蛋白表達 參考文獻［10］ 報道。腸組織石蠟切片常規(guī)脫蠟后梯度乙醇脫水,PBS 緩沖液漂洗,95 ℃10 mmol/L枸櫞酸鈉溶液中修復(fù)20 min,冷卻至室溫,室溫下過氧化物酶阻斷劑孵育10 min,PBS 緩沖液漂洗,37 ℃下山羊血清孵育20 min,傾去血清(無需洗滌),滴加兔抗Claudin-1、Occludin、ZO-1 抗 體(均按1 ∶200 比例稀釋),4 ℃下孵育過夜,PBST緩沖液漂洗,滴加二抗Cy3-山羊抗兔IgG (按1 ∶300比例稀釋),37 ℃下避光孵育1 h,PBST 緩沖液漂洗,滴加DAPI 染細胞核,室溫下避光孵育5 min,PBST 緩沖液漂洗,50%甘油封片,在熒光顯微鏡下觀察。再以PBS 緩沖液代替一抗,作為陰性對照。每張切片隨機選取6 個視野(×100),采用Image-J 圖像分析系統(tǒng)進行光密度分析,記錄光密度。

2.5 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 23.0 軟件進行處理,計量資料以() 表示,組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 桔梗多糖對桔梗皂苷D 在體腸吸收的影響圖2 顯示,桔梗多糖組Ka、Papp值高于對照組(P＜0.05,P＜0.01),并呈劑量依賴性。表1 顯示,桔梗多糖組fa值高于對照組(P＜0.01),并呈劑量依賴性。

圖2 桔梗多糖對桔梗皂苷D 在體腸吸收的影響Fig.2 Effects of P.grandiflorum polysaccharides on the in vivo intestinal absorption of platycodin D

3.2 桔梗多糖對緊密連接蛋白表達的影響 圖3顯示,Claudin-1、Occludin 主要表達于細胞膜及細胞之間的連接處,胞質(zhì)中也有少量存在,沿腸上皮細胞均勻分布；ZO-1 均勻分布于小腸絨毛,多表達于胞核中,呈蜂窩或者點狀聚集；與對照組比較,桔梗多糖組Claudin-1、Occludin、ZO-1 表達下調(diào)(P＜0.05,P＜0.01),并呈劑量依賴性。

表1 各組桔梗皂苷D fa 值比較（， n=5）Tab.1 Comparison of fa values for platycodin D among various groups （， n=5）

表1 各組桔梗皂苷D fa 值比較（， n=5）Tab.1 Comparison of fa values for platycodin D among various groups （， n=5）

注:與對照組比較,**P＜0.01。

3 討論

中醫(yī)臨床處方中桔梗常用劑量為9～12 g［11］,不同產(chǎn)地藥材中桔梗皂苷D、桔梗多糖質(zhì)量分數(shù)范圍分別為1.43～2.97、182～517 mg/g［12］。參考大鼠給藥劑量換算方法,本實驗設(shè)定在體腸循環(huán)灌注體積為25 mL,桔梗皂苷D 質(zhì)量濃度為20 μg/mL,桔梗多糖低、中、高劑量分別為1、2、4 mg/mL,多糖與皂苷含量比例以兩者在含桔梗臨床處方中的比例為依據(jù)。

桔梗皂苷D 水溶性較好,但膜滲透性較差,屬于生物藥劑學分類系統(tǒng)中的Ⅲ類藥物,生物利用度不理想。大鼠腸灌流模型中某一化合物Papp＜0.18×10-3cm/min 時,表示其難以吸收［13］,而對照組中桔梗皂苷D 的Papp為3.43×10-5cm/min,是口服難吸收藥物,與文獻［3］ 報道一致,而桔梗多糖的加入使該成分腸吸收水平、人體預(yù)測口服吸收系數(shù)均顯著升高,并呈劑量依賴性。

天然藥物作為其他活性成分的吸收促進劑,通常與抑制P-糖蛋白的外排作用或松馳細胞間的緊密連接等有關(guān)［14］。研究證實,桔梗皂苷D 不是P-糖蛋白底物,其轉(zhuǎn)運不受后者影響［3］。本實驗發(fā)現(xiàn),不同劑量桔梗多糖均可顯著降低Claudin-1、Occludin、ZO-1 表達,并隨著劑量增大作用更明顯,推測該成分可能通過直接或間接調(diào)控緊密連接蛋白表達來影響桔梗皂苷D 吸收。

桔梗多糖可促進巨噬細胞及T 淋巴細胞增殖,顯著誘導TNF-α、IL-6、IL-2 等細胞因子產(chǎn)生［15］,其表達對調(diào)控緊密連接起到關(guān)鍵作用,進而影響腸上皮細胞通透性［16］,故推測該成分的促吸收機制可能與免疫活性的激活相關(guān)。此外,中藥成分可通過腸道菌群代謝或生物轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生新的生物活性分子,促進藥物吸收［17］。湯劑中被忽視的一些輔助成分或“無效” 成分(如多糖、甾醇、鞣質(zhì)等)可能是一些轉(zhuǎn)運體或代謝酶的底物,是否也會對活性物質(zhì)的藥動學過程產(chǎn)生影響尚不明確［18］,需在其腸吸收機制中繼續(xù)考察。

圖3 桔梗多糖對Claudin-1、Occludin、ZO-1 表達的影響Fig.3 Effects of P.grandiflorum polysaccharides on expressions of Claudin-1，Occludin and ZO-1

綜上所述,桔梗多糖可改善桔梗皂苷D 在體腸吸收,可能與細胞間緊密連接的改變有關(guān),可為今后研究湯劑中活性成分的腸吸收機制奠定基礎(chǔ)。