郭怡敬，于 歡，龔千鋒，鐘凌云*，諶瑞林，朱衛(wèi)豐

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004；2.江西江中中藥飲片有限公司，江西 九江 332000）

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 的干燥根,性涼,味甘、辛,歸脾胃經(jīng),具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽(yáng)止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒等功效［1］,主要化學(xué)成分為異黃酮、葛根皂苷等?，F(xiàn)代研究表明,葛根對(duì)維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)定、改善肝腎功能、提高代謝與免疫功能、抗氧化等均有一定作用［2-3］。

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)理論為指導(dǎo),臨床應(yīng)用為基礎(chǔ),經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑［4-5］。由于藥材質(zhì)地、性味、功效均有差異,為了保障臨床用藥準(zhǔn)確安全、療效一致,傳統(tǒng)湯劑制備工藝應(yīng)做出適當(dāng)調(diào)整［6］。但葛根作為常用解表藥,目前尚無(wú)其標(biāo)準(zhǔn)湯劑具體制備工藝,故本實(shí)驗(yàn)在5、10、15 倍加水量下于不同時(shí)間點(diǎn)［7］繪制含量-時(shí)間動(dòng)態(tài)分布趨勢(shì)圖,采用多指標(biāo)層次分析法(AHP)［8］結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化葛根標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝,以期為后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695 型高效液相色譜儀,配置Empower 色譜工作站 (美國(guó)Waters 公司)；AE240 電子分析天平［十萬(wàn)分之一,梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司］；水相、有機(jī)相過(guò)濾膜(上海市新亞凈化器件廠)；不銹鋼蒸煮鍋(浙江蘇泊爾股份有限公司)；細(xì)篩(上海新正機(jī)械儀器制造有限公司)。

1.2 試劑與藥物 3′-羥基葛根素 (批號(hào)CHB170224,純 度≥98%)、葛根素 (批 號(hào)CHB170227,純度≥98%)、3′-甲氧基葛根素(批號(hào)CHB180124,純度≥98%)、葛根素芹菜糖苷(批號(hào)CHB170228,純度≥98%)、大豆苷(批號(hào)CHB180713,純 度≥98%)、染料木苷 (批 號(hào)CHB170223,純 度≥98%)、芒柄花苷 (批 號(hào)CHB171026,純度≥98%) 對(duì)照品(成都克洛瑪生物技術(shù)有限公司)。葛根飲片由岳西縣沈橋中藥材專業(yè)合作社提供,經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千鋒教授鑒定為正品,符合2020 年版《中國(guó)藥典》 一部要求。甲酸為色譜純［批號(hào)A117-50,賽默飛世爾科技(中國(guó)) 有限公司］；乙腈為色譜純(批號(hào)AC-1026-4000,美國(guó)ACS 恩科化學(xué))；乙醇為分析純(批號(hào)18092202,西隴科學(xué)股份有限公司)；水為超純水［經(jīng)Milli-Q 系統(tǒng)(美國(guó)Millipore 公司) 凈化］、娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 各成分含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)［9］ 報(bào)道。Titank-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A) -水(含0.1%甲酸)(B),梯度洗脫(0～12 min,8%～10% B；12～30 min,10%～12% B；30～60 min,12%～30%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取葛根素、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、芒柄花苷、染料木苷9.24、4.14、3.12、4.39、4.48、2.21、3.12 mg,置于5 mL 量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,各精密吸取2 mL,置于25 mL 量瓶中,甲醇定容至刻度,搖勻,即得,置于4 ℃冰箱中保存。

2.1.3 供試品溶液制備 精密吸取葛根水煎液2 mL,置于10 mL 量瓶中,30%乙醇定容至刻度,搖勻,即得,置于4 ℃冰箱中保存。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量,甲醇制成6 種質(zhì)量濃度,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,結(jié)果見表1,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次,測(cè)得葛根素、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、芒柄花苷峰面積RSD 分別為 0.89%、0.59%、0.57%、0.52%、0.54%、1.48%、0.75%,表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑,按“2.1.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得葛根素、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、芒柄花苷峰面積RSD 分別為1.13%、2.35%、2.98%、2.40%、0.64%、2.45%、0.91%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液,于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得葛根素、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、芒柄花苷峰面 積 RSD 分別為 1.91%、0.61%、2.04%、0.21%、0.19%、1.98%、1.23%,表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1 mL,共6 份,按各成分含量100%水平精密加入對(duì)照品溶液,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果,葛根素、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、芒柄花苷平均加樣回收率分別為98.9%、103.3%、95.9%、95.7%、100.7%、96.0%、96.9%,RSD 分別為 0.28%、0.17%、0.19%、0.10%、0.03%、0.06%、0.02%。

2.2 單因素試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［7］ 報(bào)道。精密稱取葛根飲片100 g,共3 份,分別加入5、10、15倍量水浸 泡5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 min 后各取藥液5 mL,同時(shí)補(bǔ)加同溫介質(zhì)5 mL,精密吸取1 mL,置于10 mL 棕色量瓶中,30%乙醇定容,搖勻,0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,中火煎煮,藥液沸騰后保持微沸狀態(tài),在煎煮5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min 后各取藥液5 mL,同時(shí)補(bǔ)加同溫介質(zhì)5 mL,精密吸取1 mL,置于10 mL 棕色量瓶中,30%乙醇定容,搖勻,0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,繪制主要化學(xué)成分含量-時(shí)間動(dòng)態(tài)分布趨勢(shì)圖,結(jié)果見圖2。

2.2.1 加水量 中藥在浸泡過(guò)程中會(huì)吸水,其含量受質(zhì)地影響,不同類型飲片加水量也應(yīng)有所差異［4］。中藥煎藥室管理規(guī)范要求,水量一般沒過(guò)藥材2～5 cm,根及根莖類、果實(shí)種子類飲片加水量為飲片量的7 倍,并根據(jù)實(shí)際狀態(tài)適時(shí)調(diào)整［9］,而日本漢方制劑工藝中一般加入全生藥量20 倍量的水［10］。文獻(xiàn)［11］ 報(bào)道,53 味中藥飲片平均吸蓄量為1.6 mL/g,其中根莖類為1.8 mL/g。本實(shí)驗(yàn)考察了加水量5、10、15 倍,發(fā)現(xiàn)5、10 倍下各成分含量高于15 倍下,故選擇5、7、9 倍作進(jìn)一步研究。

2.2.2 浸泡時(shí)間 中藥飲片在煎煮前浸泡時(shí),可使其表面濕潤(rùn)變軟,植物細(xì)胞膨脹,從而有利于有效成分溶出,同時(shí)組織內(nèi)產(chǎn)生滲透壓而擴(kuò)散到組織細(xì)胞外部水中,可避免在加熱煎煮時(shí)藥材組織內(nèi)蛋白質(zhì)固化、淀粉糊化而影響活性物質(zhì)煎出［12］。研究表明,浸泡時(shí)間對(duì)藥材中有效成分含量有明顯影響,可影響臨床效果［13-14］。圖2 顯示,浸泡20 min后各成分溶出趨于平緩,葛根飲片已無(wú)干心,故選擇20、30、40 min 作進(jìn)一步研究。

2.2.3 煎煮時(shí)間 葛根為發(fā)散風(fēng)熱藥,故相關(guān)湯劑煎煮時(shí)間應(yīng)根據(jù)其功能主治和藥物功效來(lái)確定。一般藥物煮沸后再煎煮20～30 min；解表類、清熱類、芳香類藥物不宜久煎,煮沸后再煎煮15～20 min即可,但也有學(xué)者認(rèn)為,辛溫解表劑、扶正解表劑應(yīng)適當(dāng)久煎,而辛涼解表劑煎煮時(shí)間宜短,不能一概而論［6］。圖2 顯示,加熱15 min 內(nèi)各成分含量顯著上升,15～35 min 持續(xù)增加,35 min后開始波折下降,整體趨勢(shì)雖上升,但藥液也明顯濃縮而導(dǎo)致水分損失,濃度變高。煎煮時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)使中藥中部分成分發(fā)生水解,導(dǎo)致其含量降低［15］,臨床上煎煮一般為二煎,時(shí)間略短于一煎,而現(xiàn)代研究中往往煎煮時(shí)間相同［16］。最終,本實(shí)驗(yàn)選擇15、25、35 min 作進(jìn)一步研究。

2.3 層次分析法 葛根素是葛根質(zhì)量控制的指標(biāo)成分,而3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷含量較低,染料木苷、芒柄花苷含量最低,故將上述7 種成分分為4 個(gè)層次,構(gòu)建優(yōu)先判斷矩陣,得到相對(duì)評(píng)分,結(jié)果見表2,發(fā)現(xiàn)CR＜0.1,表明矩陣符合一致性檢驗(yàn),權(quán)重系數(shù)合理有效。綜合評(píng)分Y計(jì)算公式為Y=3′-羥基葛根素含量×0.077 2/最大值+葛根素含量×0.429 6/最大值+3′-甲氧基葛根素含量×0.144 6/最大值+葛根素芹菜糖苷含量×0.144 6/最大值+大豆苷含量×0.144 6/最大值+染料木苷含量×0.029 7/最大值+芒柄花苷含量×0.029 7/最大值。

圖2 各成分含量-時(shí)間動(dòng)態(tài)分布趨勢(shì)Fig.2 Content-time dynamic distribution trends for various constituents

表2 各成分權(quán)重系數(shù)Tab.2 Weight coefficients for various constituents

2.4 響應(yīng)面法 以加水量(A)、浸泡時(shí)間(B)、煎煮時(shí)間(C) 為影響因素,3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、芒柄花苷含量的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo),響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝,結(jié)果見表3,模型擬合分析見表4。

采用Design-Expert8.0.6 軟件進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合,得到方程分別為Y=0.720+0.120A+8.993×10-3B+0.094C(R2=0.644 2)、Y=0.740+0.120A+8.993×10-3B+0.094C+0.053AB+0.024AC+0.035BC-0.063A2+0.025B2+1.182×10-3C2(R2=0.869 6),故選擇二項(xiàng)式擬合模型,方差分析見表5,可知各因素影響程度依次為A＞C＞B；模型P＜0.01,表明其達(dá)到極顯著水平。響應(yīng)面分析見圖3,可知最優(yōu)工藝為加8.72 倍量水浸泡39.9 min 后煎煮34.4 min,結(jié)合實(shí)際操作,將其修正為加9 倍量水浸泡40 min 后煎煮35 min。

再按照優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、芒柄花苷含量RSD 分別為 0.98%、4.14%、4.36%、2.11%、1.28%、4.40%、1.98%,均小于5%,表明該工藝合理可行。取葛根飲片適量,按照一般飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑工藝(浸泡30 min,頭煎7 倍量水30 min,二煎6 倍量水20 min,濃縮至5 倍飲片質(zhì)量)［4］進(jìn)行煎煮,平行3 次,測(cè)得7 種成分平均含量分別為0.088%、1.087%、0.376%、0.345%、0.157%、0.009%、0.011%,綜合評(píng)分為0.594,優(yōu)于一般飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑工藝。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of tests

表4 模型擬合分析Tab.4 Fitting analysis of models

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

3 討論

由于解表藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑缺乏具體的工藝參數(shù),故本實(shí)驗(yàn)對(duì)加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間進(jìn)行考察,不僅可為葛根標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝提供依據(jù),還能為其他解表藥提供參考。另外,在“解表類、清熱類、芳香類不宜久煎,煮沸后再煎煮15～20 min” 的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范下,應(yīng)區(qū)別對(duì)待解表藥,尤其是藥效成分不以揮發(fā)油為主者。

2020 年版《中國(guó)藥典》 項(xiàng)下葛根成分檢測(cè)指標(biāo)僅有葛根素,但中藥組成復(fù)雜,單一化合物不能充分評(píng)價(jià)其質(zhì)量。葛根主要有效成分為黃酮,包括葛根素、大豆苷、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素等,近年來(lái)大量研究表明,它們具有廣泛的藥理作用,如抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖、治療心腦血管疾病、改善腸道菌群等［17-21］。本實(shí)驗(yàn)采用層次分析法對(duì)多成分指標(biāo)得到的權(quán)重系數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)分,通過(guò)響應(yīng)面法計(jì)算響應(yīng)值,進(jìn)而確定最佳工藝。對(duì)比《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》 規(guī)定,本實(shí)驗(yàn)可使結(jié)果更加科學(xué)化,并驗(yàn)證了葛根標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝的合理性。

葛根作為常見的藥食同源中藥,近年來(lái)受到人們廣泛關(guān)注,將其制成標(biāo)準(zhǔn)湯劑能更好地服務(wù)于患者。目前,湯劑存在許多問題,如規(guī)范不一、用法不同等,故明確標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝既能為葛根臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ),又可促進(jìn)相關(guān)新劑型的開發(fā)。

圖3 各因素響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plots for various facotrs