王玉林，邵曉瑋，王建強(qiáng)，曹洪杰，張士財

(濱州市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濱州 256600）

萬氏牛黃清心丸收載于2020 年版《中國藥典》 一部,是由牛黃、朱砂、黃連、梔子、郁金、黃芩6 味藥材組成的中藥制劑,臨床上用于清熱解毒、鎮(zhèn)驚安神［1］,但其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了朱砂、黃連中鹽酸小檗堿含量的測定方法,黃芩苷、梔子苷等有效成分只有TLC 定性鑒別,尚無牛黃、黃芩、梔子所含有效成分,文獻(xiàn)［2-5］ 也只涉及含量較高的鹽酸小檗堿、黃芩苷、梔子苷。

為了更全面地評價萬氏牛黃清心丸質(zhì)量,本實驗采用HPLC 法同時測定該制劑中梔子苷、黃芩苷、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、膽紅素的含量,對比藥典法,該方法更簡便、易于操作,可為今后其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供一定參考。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AD 高效液相色譜儀,配置SPD-20A 檢測器(日本島津公司)；XS205DU 電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-300VDV 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 萬氏牛黃清心丸［每丸1.5 g,國藥集團(tuán)馮了性 (佛山) 藥業(yè)有限公司,批號180013］。梔子苷 (純度97.6%,批號110749-201718)、黃芩苷 (純度95.4%,批號110715-201821)、鹽酸巴馬 汀 (純 度 86.8%,批 號110732-201611)、鹽酸黃連堿(純度95.1%,批號112026-201601)、鹽酸小檗堿(純度86.7%,批號110713-201212)、膽紅素 (純 度98.9%,批 號100077-201808) 對照品(中國食品藥品檢定研究院)；表小檗堿對照品 (純度98.59%,批號B-064-180818) (成都瑞芬思科技有限公司)。甲醇、乙腈為色譜純(德國默克公司)；磷酸二氫鉀為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 InertSustain C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)；流動相乙腈(A) -0.05 mol/L磷酸二氫鉀(B),梯度洗脫(0～15 min,10%～20%A；15～40 min,20% A；40～60 min,20%～40% A；60～80 min,40%～10% A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210、345 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 稱取各對照品適量,置于量瓶中,甲醇溶解定容至刻度 (膽紅素用氯仿溶解),即得 (各成分質(zhì)量濃度分別為梔子苷1.988 1 mg/mL、黃芩苷4.928 4 mg/mL、表小檗堿1.024 8 mg/mL、鹽酸黃連堿1.518 7 mg/mL、鹽酸巴馬汀 1.554 6 mg/mL、鹽酸小檗 堿2.044 4 mg/mL、膽紅素5.076 5 mg/mL)。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取丸劑適量,研細(xì),混勻,取約1.00 g,精密稱定,加入40 mL 10%氯仿-乙醇,稱定質(zhì)量,超聲(200 W、45 kHz) 處理30 min,放冷,10%氯仿-乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,上清液經(jīng)0.2 μm 微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方及制劑工藝,分別制備缺梔子、缺黃芩、缺黃連、缺牛黃的陰性樣品,按“2.2.2” 項下方法制備,既得。

2.3 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL,在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定,結(jié)果見圖1。由此可知,供試品在各成分對照品相應(yīng)位置上均有相同保留時間的色譜峰,陰性無干擾,表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1” 項下貯備液,甲醇或氯仿稀釋成不同質(zhì)量濃度,在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,結(jié)果見表1,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗 精密量取“2.4” 項下稀釋的對照品溶液,取中間質(zhì)量濃度,在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次,測得梔子苷、黃芩苷、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、膽紅素峰面積RSD 分別為0.10%、0.18%、0.09%、0.21%、0.15%、0.11%、0.20%,表明儀器精密度良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6 穩(wěn)定性試驗 取丸劑適量(批號180013),按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,于0、4、8、16、32、48 h 在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定,測得梔子苷、黃芩苷、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、膽紅素峰面積RSD分別為0.56%、0.69%、0.88%、0.58%、0.97%、0.48%、0.62%,表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取丸劑適量(批號180013),按“2.2.2” 項下方法制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定,測得梔子苷、黃芩苷、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、膽紅素峰面積RSD 分別為0.83%、0.63%、1.03%、1.10%、0.88%、0.78%、1.21%,保留時間RSD 分別為0.42%、0.22%、0.58%、0.61%、0.38%、0.24%、0.15%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的丸劑6 份(批號180013),每份約0.5 g,精密加入“2.2.1” 項下梔子苷貯備液1.78 mL、黃芩苷貯備液1.45 mL、表小檗堿貯備液0.57 mL、鹽酸黃連堿貯備液1.24 mL、鹽酸巴馬汀貯備液1.48 mL、鹽酸小檗堿貯備液2.77 mL、膽紅素貯備液0.80 mL,按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定,計算回收率。結(jié)果,梔子苷、黃芩苷、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、膽紅素平均加樣回收率分別為98.32%、99.69%、97.25%、99.10%、98.21%、98.94%、99.10%,RSD 分別為1.57%、1.20%、1.63%、0.95%、1.14%、0.85%、0.93%。

2.9 樣品含量測定 取丸劑3 批,每批3 份,按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定,計算含量,結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果（mg/g， n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg/g， n=3）

3 討論

3.1 評價指標(biāo)選擇 在2020 年版《中國藥典》一部中［1］,只對朱砂、鹽酸小檗堿進(jìn)行了含量控制。膽紅素、黃芩苷、梔子苷、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀作為萬氏牛黃清心丸中牛黃、黃芩、梔子、黃連的有效成分,對制劑功能和主治發(fā)揮了重要作用,但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中并未對其含量進(jìn)行測定,難以全面反映質(zhì)量。因此,本實驗選擇上述7種成分作為評價指標(biāo)。

3.2 檢測波長選擇 結(jié)合2020 年版《中國藥典》及文獻(xiàn)［1-18］ 發(fā)現(xiàn),鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿、表小檗堿在345 nm 波長處有最大吸收,再比較了梔子苷、黃芩苷、膽紅素在248、280、453、210 nm 波長處的吸收,結(jié)果選擇210 nm。最終,采用345、210 nm 檢測波長,可保證各成分均有最大吸收,提高了靈敏度,并使定量更準(zhǔn)確。

3.3 流動相選擇 本實驗比較了乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1% 磷 酸、乙 腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀［2-18］,發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀梯度洗脫時基線平穩(wěn),各成分色譜峰分離度、理論塔板數(shù)良好,陰性無干擾。

3.4 色譜柱選擇 本實驗比較了phenomenex Luna C18、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18、InertSustain C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),發(fā)現(xiàn)各色譜柱分離效果均良好,表明該方法穩(wěn)定耐用。

3.5 提取方法選擇 根據(jù)萬氏牛黃清心丸的制備工藝和所測成分的溶解性,本實驗采用70%甲醇、甲醇、70%氯仿乙醇、10%氯仿乙醇進(jìn)行超聲、回流提取,最終選擇10%氯仿乙醇超聲提取30 min,此時各成分能被同時提取。