馬嘉琪，姚曉琳，劉思杰，殷雪馳，畢鵬飛，王建龍，張道宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

免疫層析法具有操作簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、不依賴儀器和專業(yè)人員等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[1-3]，廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)[4-5]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[6-7]及食品安全[8-9]等領(lǐng)域的現(xiàn)場(chǎng)快速監(jiān)測(cè)。信號(hào)探針是免疫層析方法中最重要的組成之一，也是影響方法靈敏度的最重要因素之一。對(duì)于小分子化合物的免疫層析檢測(cè)，采用競(jìng)爭(zhēng)抑制原理。傳統(tǒng)的免疫層析方法中信號(hào)探針指的是納米材料標(biāo)記的檢測(cè)抗體，但其靈敏度不高，這是因?yàn)椋孩賯鹘y(tǒng)探針中，由于標(biāo)記納米材料而產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)阻礙了檢測(cè)抗體上部分抗原結(jié)合位點(diǎn)對(duì)抗原的結(jié)合作用，導(dǎo)致檢測(cè)抗體對(duì)樣品中游離小分子半抗原的濃度響應(yīng)不夠靈敏；②在基于傳統(tǒng)探針的競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析分析中，分析反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度與所應(yīng)用的檢測(cè)抗體濃度呈正相關(guān)，為獲得足夠的信號(hào)強(qiáng)度，檢測(cè)抗體的用量也隨之增加，不利于競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的進(jìn)行[10-11]；③與游離的抗體相比，標(biāo)記了納米材料的抗體生物活性和布朗運(yùn)動(dòng)受到抑制[12]。免疫層析方法中用以提供信號(hào)的納米材料除最常用的膠體金[13-14]外，還有量子點(diǎn)[15-16]、磁性納米材料[17-18]、碳納米管[19]、石墨烯[20]、乳膠微球納米材料[21]和納米復(fù)合材料[22]等。與膠體金標(biāo)記材料相比，磁性納米材料(Fe3O4)具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)[23]，還具有強(qiáng)烈磁性[24]，可進(jìn)行磁性分離，且合成方法簡(jiǎn)單，是一種理想的標(biāo)記材料。

雌二醇是一種典型的天然雌性激素[25]，是環(huán)境內(nèi)分泌干擾性物質(zhì)的重要組成部分。17β-雌二醇(17β-Estradiol,17β-E2)是與動(dòng)物繁殖相關(guān)最具活性的天然性激素之一，被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)以促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)和提高生產(chǎn)性能[26]。但17β-雌二醇化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且在動(dòng)物體內(nèi)無(wú)特定的代謝系統(tǒng)，因此17β-雌二醇及其衍生物易通過(guò)食物鏈在生物體內(nèi)蓄積。研究表明，從外界攝入過(guò)量的17β-雌二醇會(huì)使人體激素平衡發(fā)生紊亂[27]，導(dǎo)致兒童性早熟[28]，甚至影響女性生育并引發(fā)卵巢癌等疾病[29]，同時(shí)也會(huì)增加男性患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者健康。因此，研究建立一種食品中17β-雌二醇的快速檢測(cè)方法具有十分重要的意義。

本研究采用磁性納米材料分別標(biāo)記檢測(cè)抗體和第二抗體，作為傳統(tǒng)探針和間接探針，又將傳統(tǒng)探針和間接探針按照一定比例組合成配對(duì)探針。為探究不同類型探針對(duì)免疫層析方法分析靈敏度的影響，以17β-雌二醇為檢測(cè)目標(biāo)物，分別建立了基于此3種探針的17β-雌二醇的競(jìng)爭(zhēng)免疫層析分析方法，比較了三者的檢測(cè)靈敏度，其中間接探針和配對(duì)探針的使用刷新了傳統(tǒng)方法中信號(hào)探針必須是信號(hào)材料標(biāo)記檢測(cè)抗體所制備的認(rèn)知，可為其他對(duì)靈敏度要求較高且追求簡(jiǎn)單的免疫層析方法提供借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品、孕酮標(biāo)準(zhǔn)品、睪酮標(biāo)準(zhǔn)品、雌酮標(biāo)準(zhǔn)品、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亞胺(EDC)、正羥基琥珀酰亞胺(NHS)均購(gòu)于Sigma-Aldrich化學(xué)試劑公司；牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自MP Biochina公司；17β-E2-BSA偶聯(lián)物購(gòu)自龍巖生物有限公司；17β-雌二醇單克隆抗體(17β-E2-mAb)為實(shí)驗(yàn)室自制；羊抗鼠IgG(H+L)多克隆抗體(pAb)購(gòu)自洛陽(yáng)寶通實(shí)驗(yàn)材料中心；醋酸鈉、二水合檸檬酸三鈉、四硼酸鈉、蔗糖和六水合三氯化鐵購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二醇購(gòu)自成都科隆化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；Vetex70傅里葉變換近紅外光譜儀(德國(guó)布魯克公司)；JEM-1230透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；HGS510-2-D點(diǎn)膜儀(杭州峰航科技有限公司)；HGS-201切條機(jī)(杭州峰航科技有限公司)；DGG-9030B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信儀器公司)；EOS M2Canon數(shù)碼相機(jī)(日本佳能公司)；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；JT-D高速組織均質(zhì)機(jī)(漯河市金田試驗(yàn)設(shè)備研究所)；VORTEX GENIUS 3渦旋振蕩器(德國(guó)IKA公司)。

1.2 Fe3O4磁性納米材料(MNPs)的合成

采用一步水熱法合成帶有羧基的水溶性Fe3O4磁性納米材料(MNPs)，具體合成過(guò)程如下：將0.675 g的六水合三氯化鐵和0.245 g二水合檸檬酸三鈉溶于20 mL乙二醇中，磁力攪拌1 h，再加入1.2 g醋酸鈉繼續(xù)攪拌30 min，隨后將混合物轉(zhuǎn)入反應(yīng)釜并置于200 ℃烘箱中加熱10 h，待反應(yīng)釜自然降溫后打開(kāi)，所得混合物用無(wú)水乙醇和超純水分別清洗3次，最后放入60 ℃真空干燥箱中干燥，獲得的棕色產(chǎn)物即為合成的MNPs，收集至離心管中，密封備用。

1.3 Fe3O4標(biāo)記探針的制備

首先采用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定抗體的分析性能，然后采用EDC/NHS交聯(lián)法將17β-E2-mAb和羊抗鼠pAb分別修飾在MNPs上。將MNPs材料用蒸餾水稀釋成1 mg/mL的棕黃色溶液，按照每1 mL MNPs材料中加入1 mg EDC和0.6 g NHS的比例對(duì)MNPs進(jìn)行活化，渦旋溶解，在37 ℃下于220 r/min搖床中孵育30 min。磁性分離活化的MNPs，用硼酸緩沖液清洗，除去多余的EDC和NHS。用0.02 mol/L硼酸溶液(pH 6.6)重懸清洗后的功能化MNPs材料。然后加入1 mg/mL的抗17β-E2單克隆抗體或羊抗鼠多克隆抗體溶液，將混合物在 37 ℃下孵育1 h，磁性分離，去除上清液。在磁性標(biāo)記物中加入1 mL含1%BSA的pH 6.6硼酸緩沖液，37 ℃反應(yīng)1 h，對(duì)MNPs表面的空余位點(diǎn)進(jìn)行封閉。將封閉好的磁性納米探針用硼酸緩沖溶液洗滌2次，再用含5%蔗糖、1% BSA的硼酸緩沖液重懸至原體積的1/10，置于4 ℃冰箱中備用。其中，MNPs標(biāo)記的抗17β-E2單克隆抗體為傳統(tǒng)探針，MNPs標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體為間接探針，由兩者組成的混合探針為配對(duì)探針。

1.4 免疫層析試紙條的組裝

試紙條由樣品墊、硝酸纖維素膜(NC膜)和吸水墊組成，制備過(guò)程如下：首先將樣品墊在封閉緩沖液中完全浸濕，于37 ℃下干燥過(guò)夜;再利用點(diǎn)膜儀將0.5 mg/mL的抗原17β-E2-BSA和1 mg/mL的羊抗鼠多克隆抗體溶液以0.5 μL/cm的速率分別均勻噴劃在NC膜上，形成檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，室溫下干燥30 min;之后將NC膜、樣品墊和吸水墊依次貼至襯板上，不同部位之間互相重疊約2 mm，最后用切條機(jī)切成3 mm寬的試紙條，保存于干燥環(huán)境中備用。

1.5 不同探針類型的免疫層析方法分析性能鑒定

將17β-E2標(biāo)準(zhǔn)品用DMSO溶解并稀釋至100 μg/mL作為儲(chǔ)備液，再用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)將儲(chǔ)備液分別稀釋成0.1～40 ng/mL系列質(zhì)量濃度的待檢溶液，每種免疫層析方法7個(gè)濃度，并以PBS為陰性空白對(duì)照。7個(gè)濃度樣品溶液分別取100 μL加入1.5 mL PE管中，再加入適量傳統(tǒng)探針溶液或抗17β-E2單克隆抗體及間接探針溶液或配對(duì)探針溶液，混合均勻，滴加至試紙條樣品墊，免疫層析反應(yīng)10 min后肉眼觀察結(jié)果。每個(gè)濃度重復(fù)3次，最后對(duì)試紙條進(jìn)行拍照記錄，采用ImageJ軟件分析T線的光密度值。

1.6 食品中17β-雌二醇的免疫層析檢測(cè)

采用雞肉和牛奶樣品的添加回收實(shí)驗(yàn)對(duì)所建立的3種免疫層析法進(jìn)行評(píng)估，首先進(jìn)行樣品前處理。雞肉樣品：取空白樣品用高速組織均質(zhì)機(jī)攪碎，精密稱取1.0 g均質(zhì)的雞肉樣品于9個(gè)離心管中，標(biāo)記序號(hào)為0～8#，各其中添加適量17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液并使之終濃度為0.2、0.4、1、2、4、10、16、20 ng/g。在0#離心管中加入相同體積的PBS對(duì)照品溶液，渦旋，充分混勻，將9個(gè)離心管于4 ℃放置過(guò)夜。次日，分別在9個(gè)離心管中加入2 mL PBS，渦旋，充分與樣品混合，超聲5 min，于10 000 r/min離心5 min，收集上清液，待測(cè)。

牛奶樣品：取18 mL牛奶于4 ℃條件下以12 000 r/min離心15 min，去除上層脂肪。取5 mL脫脂牛奶，加等體積PBS溶液稀釋至10 mL，將稀釋好的牛奶樣品加入9個(gè)離心管中，每管1 mL，分別添加適量17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其在牛奶中的終濃度為0.4、0.8、2、4、8、20、32、40 ng/mL，充分渦旋混勻，靜置2 h，作為待檢溶液。分別取100 μL雞肉和牛奶待檢溶液加入1.5 mL離心管中，將所選出的最佳17β-雌二醇試紙條插入混合溶液中，反應(yīng)10 min，肉眼觀察結(jié)果。每個(gè)濃度重復(fù)3次，最后對(duì)試紙條進(jìn)行拍照記錄。

2 結(jié)果與討論

2.1 MNPs的合成鑒定

本研究所采用的MNPs標(biāo)記材料為羧基化的Fe3O4，采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察MNPs形貌(圖1A)，并采用傅里葉變換近紅外光譜儀對(duì)其進(jìn)行紅外光譜掃描(圖1B)。結(jié)果顯示，制備的MNPs呈現(xiàn)粒徑較均一的單分散球形，形貌較好；在540 cm-1處觀察到Fe—O峰，在 1 654 cm-1和1 384 cm-1處的特征峰為羧基拉伸振動(dòng)所致[30]，3 377 cm-1處為—OH的特征峰[31]。表明羧基化的Fe3O4納米材料合成成功，且穩(wěn)定性較好。

2.2 抗17β-雌二醇抗體的性能分析

將17β-E2-BSA完全抗原包被在酶標(biāo)板上，采用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)對(duì)不同質(zhì)量濃度(0、0.05、0.15、0.5、1、2 ng/mL)17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，并繪制競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，以半數(shù)抑制濃度(IC50)來(lái)表示競(jìng)爭(zhēng)ELISA的檢測(cè)靈敏度。結(jié)果顯示，抗體對(duì)17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度可達(dá)0.168 ng/mL(R2=0.998 1)；為評(píng)估該抗體對(duì)17β-雌二醇檢測(cè)的特異性，以20～50倍17β-雌二醇濃度的雌激素類孕酮(PRG)、睪酮(T)和雌酮(E1)為干擾物，3種干擾物標(biāo)準(zhǔn)品均采用0、2.5、5、10、20、40 ng/mL 6個(gè)濃度，17β-E2采用0、0.05、0.15、0.5、1、2 ng/mL 6個(gè)濃度，與17β-E2-BSA開(kāi)展競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。結(jié)果顯示，抗體與3種高濃度雌激素干擾物基本不反應(yīng)，交叉反應(yīng)率均小于1%。因此，本研究中所用抗體對(duì)17β-雌二醇具有較高的靈敏度和特異性，作為核心試劑，高質(zhì)量的抗體能夠?yàn)楹罄m(xù)17β-雌二醇免疫層析方法的建立奠定堅(jiān)實(shí)的材料基礎(chǔ)。

圖2 MNPs、傳統(tǒng)探針和間接探針的紫外掃描光譜圖

2.3 探針的合成鑒定

利用紫外可見(jiàn)吸收光譜對(duì)MNPs材料、傳統(tǒng)探針和間接探針進(jìn)行表征(圖2)。結(jié)果顯示，單純的MNPs在紫外可見(jiàn)區(qū)域未見(jiàn)吸收峰，但結(jié)合了17β-E2-mAb和pAb的2種探針(MNP-mAb和MNP-pAb)在280 nm處均出現(xiàn)了吸收峰，由此證明，傳統(tǒng)探針和間接探針均已成功制備[32]。而配對(duì)探針由傳統(tǒng)探針和間接探針組成，采用同樣的標(biāo)記方法，僅標(biāo)記時(shí)的參數(shù)不同。

2.4 3種免疫層析分析方法的參數(shù)優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了傳統(tǒng)、配對(duì)和間接3種探針的主要參數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)探針中17β-E2-mAb的最佳標(biāo)記量為7 μg/mL；配對(duì)探針由MNP-pAb和MNP-mAb組成，17β-E2-mAb和pAb的最佳標(biāo)記量均為5 μg/mL；間接探針中pAb的最佳標(biāo)記量為14 μg/mL。將MNPs標(biāo)記的抗體溶液濃縮10倍后用于免疫層析分析，每根試紙條上探針的用量設(shè)為2 μL，其中配對(duì)探針中MNP-pAb和MNP-mAb的最佳配比為3∶7，即MNP-pAb和MNP-mAb的最佳用量分別是0.6 μL和1.4 μL?；趥鹘y(tǒng)探針、配對(duì)探針和間接探針的試紙條，每根試紙條上17β-E2-mAb的消耗量分別為140、70、10 ng，由此可見(jiàn)，基于配對(duì)探針和間接探針兩種新型探針的免疫層析方法對(duì)抗17β-E2單克隆抗體的消耗量明顯降低。小分子化合物的免疫層析檢測(cè)采用競(jìng)爭(zhēng)原理，有限量的檢測(cè)抗體是競(jìng)爭(zhēng)分析的核心要素，間接探針?lè)椒ㄖ袑?duì)檢測(cè)抗體消耗量的降低，不僅能夠降低分析的成本，還有助于靈敏度的提高。

2.5 3種免疫層析方法的分析靈敏度

2.5.1 原理分析本研究設(shè)計(jì)的試紙條結(jié)構(gòu)不同于傳統(tǒng)試紙條，僅由樣品墊、NC膜及吸水墊三部分組成(圖3A)，樣品溶液和探針或抗體的混合溶液作為檢測(cè)溶液，以弱陽(yáng)性樣品為例，研究了傳統(tǒng)、間接、配對(duì)免疫層析試紙條的分析原理。由圖可見(jiàn)，檢測(cè)溶液滴加在傳統(tǒng)探針試紙條上后(圖3B)，溶液中的游離17β-E2小分子首先與MNP-mAb傳統(tǒng)探針結(jié)合，當(dāng)溶液層析至檢測(cè)線時(shí)，與小分子結(jié)合達(dá)到飽和的探針?lè)肿?MNP-mAb-17β-E2)由于不能再結(jié)合T線上的17β-E2-BSA抗原，繼續(xù)向前層析泳動(dòng)，到達(dá)C線，與包被在其上的羊抗鼠多抗結(jié)合而被截留在C線上顯色；而未與游離17β-E2結(jié)合達(dá)到飽和或未與游離17β-E2結(jié)合的探針?lè)肿觿t在T線與固定在其上的17β-E2-BSA結(jié)合而被截留顯色。檢測(cè)溶液滴加在基于配對(duì)探針的試紙條上后(圖3C)，溶液中的游離17β-E2小分子首先與MNP-mAb結(jié)合，同時(shí)由于mAb和羊抗鼠多抗的特異性結(jié)合作用，MNP-mAb與MNP-pAb結(jié)合，使得向前層析泳動(dòng)的溶液中至少包含MNP-mAb-17β-E2、MNP-pAb-MNP-mAb-17β-E2、MNP-pAb-MNP-mAb 3種復(fù)合物，同樣的，與游離17β-E2小分子結(jié)合達(dá)到飽和的MNP-mAb-17β-E2或MNP-pAb-MNP-mAb-17β-E2復(fù)合物不能被T線截留，繼續(xù)向前泳動(dòng)，在質(zhì)控線處，因復(fù)合物中暴露在外的mAb被C線上的pAb結(jié)合，復(fù)合物被截留而顯色；而未與游離17β-E2達(dá)到飽和結(jié)合的復(fù)合物或未與游離17β-E2結(jié)合的MNP-mAb、MNP-pAb-MNP-mAb則與T線上的17β-E2-BSA結(jié)合顯色；在此過(guò)程中，由于一個(gè)MNP-mAb探針可以結(jié)合多個(gè)MNP-pAb，而暴露在外的MNP-pAb又可以再與其他的MNP-mAb探針結(jié)合，從而形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使得大量MNPs信號(hào)顆粒聚集，加深檢測(cè)線的顏色，起到了信號(hào)放大的作用。當(dāng)檢測(cè)溶液滴加在基于間接探針的試紙條上時(shí)(圖3D)，溶液中的游離17β-E2小分子首先與游離mAb結(jié)合，同時(shí)由于一抗二抗的特異性結(jié)合作用，mAb又與MNP-pAb結(jié)合，使得溶液中至少存在MNP-pAb-mAb-17β-E2、MNP-pAb-mAb 2種復(fù)合物，其中MNP-pAb-mAb被T線上的17β-E2-BSA結(jié)合顯色，而MNP-pAb-mAb-17β-E2復(fù)合物因不能再結(jié)合T線上的17β-E2-BSA，繼續(xù)向前泳動(dòng)。由于所采用羊抗鼠多克隆抗體為“H+L”型混合物，既能結(jié)合mAb分子的重鏈(H鏈)，也能結(jié)合mAb分子的輕鏈(L鏈)，當(dāng)MNP-pAb-mAb-17β-E2復(fù)合物溶液達(dá)到C線后，mAb分子上未被結(jié)合的重鏈或輕鏈被C線上的pAb結(jié)合，從而使得MNP-pAb-mAb-17β-E2截留在C線上顯色，在此過(guò)程中由于一個(gè)mAb可同時(shí)結(jié)合多個(gè)MNP-pAb探針，從而也具有信號(hào)放大作用。

圖3 試紙條結(jié)構(gòu)(A)及傳統(tǒng)(B)、配對(duì)(C)、間接探針(D)免疫層析方法的分析原理示意圖

2.5.2 分析性能采用間接探針、配對(duì)探針和傳統(tǒng)探針3類試紙條分別對(duì)0～5、0～20、0～40 ng/mL的17β-E2標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，以能夠使試紙條的T線顏色明顯比陰性對(duì)照淺時(shí)的最小17β-E2濃度作為可視化檢出限(Visual limit of detection,vLOD)，以能夠使試紙條T線顏色完全消失時(shí)的最小17β-E2濃度為視覺(jué)截止值(Visual cut-off)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可見(jiàn)，間接探針、配對(duì)探針、傳統(tǒng)探針3種免疫層析方法的vLOD分別為0.2、0.5、1 ng/mL，視覺(jué)截止值分別為5、10、30 ng/mL。另外，基于間接探針和配對(duì)探針的免疫層析方法，在0～0.5 ng/mL范圍內(nèi)，其檢測(cè)線的光學(xué)強(qiáng)度值與17β-雌二醇的濃度成反比，其相關(guān)系數(shù)和線性關(guān)系方程式見(jiàn)圖4B和4D；對(duì)于基于傳統(tǒng)探針的免疫層析方法，在0～1 ng/mL范圍內(nèi)，其檢測(cè)線的光學(xué)強(qiáng)度值與17β-雌二醇的濃度成反比，相關(guān)系數(shù)和線性關(guān)系方程式見(jiàn)圖4F。通過(guò)比較檢出限可知，基于間接探針的免疫層析方法靈敏度最高，而基于傳統(tǒng)探針的免疫層析方法靈敏度最低。另外，在競(jìng)爭(zhēng)免疫分析中，檢測(cè)抗體的使用量直接影響分析的靈敏度，抗體用量越少，則游離小分子目標(biāo)物和固向化抗原對(duì)抗體分子上有限抗原結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)越激烈，方法對(duì)目標(biāo)化合物濃度的響應(yīng)敏感度也越高，此結(jié)果與“2.4”所述抗17β-E2單克隆抗體的消耗量完全對(duì)應(yīng)。配對(duì)探針比傳統(tǒng)探針的靈敏度提高主要?dú)w因于兩個(gè)方面：①由于一抗和二抗的結(jié)合作用，以及一個(gè)MNPs顆粒上能同時(shí)結(jié)合多個(gè)抗體，MNP-pAb、MNP-mAb兩個(gè)探針互相結(jié)合形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，具有信號(hào)放大作用；②達(dá)到同樣的信號(hào)強(qiáng)度，配對(duì)探針相比僅靠MNP-mAb提供信號(hào)的傳統(tǒng)探針，能夠降低MNP-mAb的用量，相應(yīng)的降低檢測(cè)抗體用量，激發(fā)更激烈的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。間接探針相比配對(duì)探針靈敏度的提高主要原因歸因于mAb是游離的抗體分子，而游離抗體分子的使用至少有兩個(gè)優(yōu)勢(shì)：①避免了因標(biāo)記MNPs顆粒所帶來(lái)的位阻效應(yīng)，使17β-E2分子能夠和mAb分子更好的結(jié)合；②在傳統(tǒng)探針和配對(duì)探針中，因一個(gè)MNP顆粒上能夠同時(shí)結(jié)合多個(gè)mAb分子，在檢測(cè)溶液未達(dá)到T線前，已與17β-E2結(jié)合但未達(dá)到飽和的MNP-mAb探針可繼續(xù)與T線上的17β-E2-BSA結(jié)合顯色，從而降低了17β-E2的競(jìng)爭(zhēng)效率。而在間接探針?lè)桨钢?，由于mAb處于游離狀態(tài)，可最大程度地提高17β-E2的競(jìng)爭(zhēng)效率，從而提高對(duì)17β-E2濃度的響應(yīng)敏感性。其次，本研究采用的羊抗鼠多克隆抗體中既含有能結(jié)合mAb分子H鏈的pAb，也含有能結(jié)合mAb分子L鏈的pAb，一個(gè)mAb分子能同時(shí)結(jié)合多個(gè)MNP-pAb探針，使得間接探針亦具有一定的信號(hào)放大作用，顯著提高了分析的敏感性。由此可見(jiàn)，與傳統(tǒng)探針相比，配對(duì)探針更具優(yōu)勢(shì)；而與配對(duì)探針相比，間接探針更具優(yōu)勢(shì)，相應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與原理分析中的理論分析具有一致性。

圖4 基于間接(A、B)、配對(duì)(C、D)和傳統(tǒng)探針(E、F)免疫層析方法的分析靈敏度結(jié)果及性能分析

2.6 食品中17β-雌二醇的檢測(cè)

取100 μL處理好的雞肉和牛奶樣品溶液，采用間接探針免疫層析試紙條檢測(cè)。結(jié)果顯示，間接探針試紙條對(duì)牛奶和雞肉樣品檢測(cè)溶液中17β-雌二醇的檢出限分別為0.2 ng/mL和0.5 ng/g，與測(cè)定17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出限(0.2 ng/mL)相當(dāng)或略高，這是因?yàn)槭称分袕?fù)雜的基質(zhì)效應(yīng)(如蛋白質(zhì)、血紅蛋白、脂肪等)影響了試紙條的分析性能。經(jīng)過(guò)換算，間接探針試紙條對(duì)牛奶和雞肉樣品中17β-雌二醇的檢出限分別為0.4 ng/mL和1.0 ng/g(圖5)，符合國(guó)家出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SNT4892-2017[33]中對(duì)牛奶和雞肉中17β-雌二醇的檢出限要求(均為1.0 μg/kg，相當(dāng)于1.0 ng/g)，且間接探針試紙條具有普適性，只需更換檢測(cè)抗體和目標(biāo)物，即可將制備好的MNP-pAb探針應(yīng)用于更多的檢測(cè)體系中。

圖5 間接探針免疫層析試紙條對(duì)牛奶(A)和雞肉(B)中17β-雌二醇的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié) 論

本研究采用磁性納米材料標(biāo)記檢測(cè)抗體和第二抗體，制備了傳統(tǒng)、間接和配對(duì)3種不同類型的探針，分別建立了17β-E2的免疫層析快速檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，基于間接探針的免疫層析方法對(duì)17β-E2的檢測(cè)靈敏度最高，其可視化檢出限達(dá)0.2 ng/mL。此外，相比傳統(tǒng)探針和配對(duì)探針，間接探針對(duì)檢測(cè)抗體的消耗量最低。間接探針不但能夠顯著降低分析成本，提高靈敏度，還具有普適性，只需更換檢測(cè)抗體和目標(biāo)物，即可將制備好的MNP-pAb探針應(yīng)用于更多的檢測(cè)體系中。因此，間接探針免疫層析方法將具有巨大的推廣潛力和應(yīng)用前景。