王 丹，董林沛，任昕昕，姜 紅*，王愛華，常 靖，張云峰，張 曦

(1.中國人民公安大學(xué) 偵查學(xué)院，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038；3.島津企業(yè)管理(中國)有限公司，北京 100020)

我國是農(nóng)業(yè)大國，也是農(nóng)藥生產(chǎn)與使用大國。近年來，由農(nóng)藥引發(fā)的負(fù)面問題受到人們的廣泛關(guān)注，由于生產(chǎn)、存儲、運輸及使用不當(dāng)造成意外中毒的事件以及自殺、投毒等案件時有發(fā)生[1]。因此，快速準(zhǔn)確地檢驗血液中的農(nóng)藥，不僅能夠幫助公安機關(guān)查明涉案農(nóng)藥，對判斷案件性質(zhì)、分析案情及后續(xù)偵破工作也具有重要意義。

目前，血液中農(nóng)藥的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[2]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[3]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[4]等。其中，GC-MS/MS具有靈敏度高、選擇性強、抗干擾能力強等優(yōu)點，采用的多反應(yīng)監(jiān)測模式(Multiple reaction monitoring，MRM)可有效消除GC-MS選擇離子掃描模式(Selected ion monitoring，SIM)常出現(xiàn)的假陽性問題。與LC-MS/MS相比擁有成本低、維護便捷、抗污染能力強、易于普及迭代等特點，是復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥分析的理想技術(shù)[5]。血液中存在大量血細(xì)胞、磷脂、脂肪、甘油三酯及蛋白質(zhì)[6]，基質(zhì)成分復(fù)雜，且通常情況下血液中的農(nóng)藥濃度較低，從血液中提取農(nóng)藥的同時減少或消除基質(zhì)成分的干擾已成為分析過程中最關(guān)鍵的步驟。血液中農(nóng)藥常用的樣品前處理方法包括液液萃取法[7]、固相萃取法[8]和QuEChERS方法[9]等。一步凈化QuEChERS納米材料小柱(Simple-QuEChERS Nano)方法由傳統(tǒng)QuEChERS方法改進優(yōu)化，以多壁碳納米管(MWCNTs)替代石墨化碳黑(GCB)、Carbon等吸附材料，可增強凈化能力，提高靈敏度，并且凈化過程能夠一步完成，無需振蕩、離心等操作步驟，大大節(jié)省了前處理時間，已應(yīng)用于茶葉[10-11]、蔬菜[12-14]等基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的檢測，但未見用于血液中農(nóng)殘分析的報道。

本研究采用Simple-QuEChERS Nano結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了血液中97種農(nóng)藥(50種有機磷類農(nóng)藥，15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥，18種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，12種除草劑，2種其他農(nóng)藥)的分析方法，并將其應(yīng)用于實際案件血液中農(nóng)藥的篩查與定性定量工作，獲得良好的效果。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

GCMS-TQ8050 NX(日本Shimadzu公司)；DB-5ms色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司)；CUTE MIXER CM-1000型高速振蕩器(日本Tokyo Rikakakai公司)；Thermo-Fisher Biofuge Primo R型臺式高速冷凍離心機(美國Thermo公司)；Milli-Q Direct水純化系統(tǒng)(德國Merck Millipore公司)。

甲醇、乙酸乙酯、正己烷、乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；Simple-QuEChERS Nano(簡單基質(zhì))凈化柱(含5 mg MWCNTs、150 mg PSA和900 mg MgSO4)及Simple-QuEChERS Nano(復(fù)雜基質(zhì))凈化柱(含25 mg MWCNTs、150 mg PSA和885 mg MgSO4)購自北京綠綿科技有限公司；MF-3301QuSEL多功能針式過濾器(含50 mg PSA)和AOAC-3202QuSEL多功能針式過濾器(含50 mg PSA、50 mg C18和150 mg MgSO4)購自天津阿爾塔科技有限公司；97種農(nóng)藥100 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶于丙酮，天津阿爾塔科技有限公司)。實驗用水為一級水。

空白全血樣品購自北京復(fù)興醫(yī)院。

1.2 樣品制備

取0.5 mL全血樣品于15 mL塑料離心管中，加入1.5 mL水，渦旋混勻后加入2.0 mL乙酸乙酯，振蕩10 min，以8 000 r/min離心10 min。在Simple-QuEChERS Nano凈化柱下端加裝0.22 μm有機微孔濾膜，取上清液加入凈化柱中，使用推桿緩慢下壓凈化柱頂部(控制液滴速度在1～2 滴/秒)，使上清液通過凈化層和濾膜進行凈化和過濾，濾液用進樣小瓶收集，供GC-MS/MS分析。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Agilent DB-5ms色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣(99.999%)，恒線速度模式，線速度：45.6 cm/s；進樣口溫度：260 ℃；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至320 ℃，保持5 min；不分流進樣，進樣體積：1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI源)，離子源溫度200 ℃，接口溫度320 ℃，溶劑延遲時間2 min，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，掃描間隔0.3 s，碰撞氣為高純氬氣(99.999%)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用甲醇稀釋配制質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的97種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇Q3Scan采集模式，在m/z45～500范圍內(nèi)檢測，選擇豐度高且質(zhì)荷比大于100的特征離子作為母離子。設(shè)置碰撞能(CE)范圍為3～45 eV，使用產(chǎn)物離子掃描方法進一步得到各目標(biāo)物的最佳CE電壓以及離子豐度比值，建立MRM分析方法，得97種農(nóng)藥的保留時間與質(zhì)譜參數(shù)見表1。使用1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液驗證MRM方法離子對優(yōu)化結(jié)果，總離子流色譜圖見圖1。

圖1 1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖

表1 97種農(nóng)藥的保留時間與質(zhì)譜參數(shù)

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

2.2 前處理方法優(yōu)化

2.2.1 基質(zhì)條件優(yōu)化全血中存在豐富的血細(xì)胞、大分子蛋白質(zhì)、多糖及脂質(zhì)，基質(zhì)較為黏稠。直接使用有機溶劑提取時，僅33種農(nóng)藥的回收率在70%～120%范圍內(nèi)，并且擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的回收率均低于70%。研究發(fā)現(xiàn)，加入適量水稀釋可使提取溶劑與樣品充分接觸，提高萃取效率。全血經(jīng)3倍水(體積比1∶3)稀釋后再使用有機溶劑提取，凈化前回收率在70%～120%范圍內(nèi)的農(nóng)藥數(shù)量增至57種，其中包括所有的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。因此選擇將全血用3倍水(體積比1∶3)稀釋后提取。

2.2.2 進樣口及提取溶劑優(yōu)化法庭科學(xué)毒物分析領(lǐng)域使用QuEChERS方法時，乙腈沉淀蛋白的效果最佳，是首選提取溶劑，但其與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用時，由于乙腈極性強，長期使用會造成色譜柱填料流失，降低柱效，增加儀器維護頻次。因此乙腈作為提取溶劑時，常配合液相色譜-質(zhì)譜來檢測，或采用搭載程序升溫進樣口(Program temperature volume，PTV)的氣相色譜選擇性地去除樣品中的乙腈[15]。本實驗選擇質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶于乙腈)，通過優(yōu)化進樣口升溫程序，建立了97種農(nóng)藥基于PTV進樣的MRM方法，采用空白全血配制100 ng/mL的97種農(nóng)藥樣品，經(jīng)乙腈提取后選擇建立的PTV進樣的MRM方法分析，將結(jié)果與乙酸乙酯萃取后采用SPL進樣的結(jié)果進行比較。結(jié)果顯示，PTV進樣可有效除去溶劑、抑制進樣口歧視，并能得到更好的峰形。但本方法中97種農(nóng)藥種類多，沸程寬，僅用一個程序升溫進樣容易造成低沸點目標(biāo)物(如涕滅威分解物、滅多威、敵敵畏、乙拌磷亞砜等)隨溶劑排出而無法測定，同時高沸點雜質(zhì)滯留在襯管中，并吸附目標(biāo)物導(dǎo)致樣品重復(fù)性較差。此外與傳統(tǒng)的SPL進樣口相比，搭配PTV進樣口使用的襯管內(nèi)徑較小，抗污染能力較差，對于基質(zhì)較為復(fù)雜的生物樣品大量進樣，需搭配更為嚴(yán)格的樣品凈化步驟。綜上所述，對于目標(biāo)物種類較多的篩查檢測方法宜選用傳統(tǒng)的SPL進樣口進樣，因此，本方法排除了乙腈作為提取溶劑。

相較于乙腈，乙酸乙酯和正己烷的極性較小，適用于氣相色譜分析。實驗考察了乙酸乙酯以及乙酸乙酯-正己烷(體積比1∶1)混合溶劑的提取效率。結(jié)果顯示，以乙酸乙酯-正己烷(體積比1∶1)提取時，農(nóng)藥的回收率普遍較低，21種農(nóng)藥的回收率低于70%，極性強的農(nóng)藥(如亞胺硫磷、莠去通、內(nèi)吸磷、3-羥基克百威)的回收率均低于40%，而單獨使用乙酸乙酯提取時，上述4種農(nóng)藥的回收率提高至71%～91%，且78種農(nóng)藥的回收率在70%～120%范圍內(nèi)，因此選擇乙酸乙酯為提取溶劑。

表2 4種市售凈化柱的凈化材料及用量

2.2.3 凈化材料優(yōu)化QuEChERS方法常用凈化材料包括乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、GCB、C18、中性氧化鋁、Fe3O4磁性納米顆粒以及近年來出現(xiàn)的新型凈化材料Enhanced Matrix Removal Lipid(EMR-Lipid)、MWCNTs等。其中PSA可有效去除有機酸、脂肪酸、糖類等雜質(zhì)，GCB主要用于吸附色素，C18對于油脂類物質(zhì)具有較強的吸附力，中性氧化鋁主要去除脂肪酸、色素和油脂等雜質(zhì)，EMR-Lipid適用于腎臟、肝臟等生物組織，MWCNTs可有效去除水溶性和脂溶性雜質(zhì)，MgSO4主要用于除水[16]。通常根據(jù)基質(zhì)的復(fù)雜程度和雜質(zhì)成分選擇單一凈化材料或多種材料組合對提取溶液凈化，各材料的使用量也會影響凈化效率和回收率。實驗比較了Simple-QuEChERS Nano(簡單基質(zhì))凈化柱、Simple-QuEChERS Nano(復(fù)雜基質(zhì))凈化柱、QuSEL多功能針式過濾器(MF-3301)、QuSEL多功能針式過濾器(AOAC-3202)4款市售凈化柱的凈化效果，其凈化材料和用量見表2，凈化后的回收率見圖2。結(jié)果顯示，QuSEL多功能針式過濾器中MgSO4含量較低，無法有效除水，增強了離子響應(yīng)，導(dǎo)致農(nóng)藥回收率普遍偏高。MWCNTs吸附性強，Simple-QuEChERS Nano(復(fù)雜基質(zhì))凈化柱中裝填了25 mg MWCNTs，在有效去除雜質(zhì)的同時吸附了部分農(nóng)藥，使其回收率下降。Simple-QuEChERS Nano(簡單基質(zhì))凈化柱能有效凈化提取液，且對目標(biāo)農(nóng)藥的影響最低，因此選擇Simple-QuEChERS Nano(簡單基質(zhì))凈化柱對提取液凈化。

圖2 不同凈化材料對100 ng/mL加標(biāo)人血樣品中各農(nóng)藥提取回收率的影響(n=3)

2.3 方法學(xué)驗證

采用空白全血基質(zhì)配制農(nóng)藥質(zhì)量濃度分別為10、25、50、100、200、500 ng/mL的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化條件下測定，以各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)定量離子對色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍和10倍信噪比(S/N)對應(yīng)的添加水平分別計算各目標(biāo)物的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，結(jié)果見表3。各農(nóng)藥在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r2)不低于0.987 3。除丙烯菊酯的LOD和LOQ分別為11.03、36.76 ng/mL外，其余96種農(nóng)藥的LOD為0.06～4.27 ng/mL，LOQ為0.18～14.24 ng/mL。

采用空白全血，設(shè)置目標(biāo)物的加標(biāo)濃度分別為100、200、400 ng/mL，在優(yōu)化條件下測定，計算各目標(biāo)物的回收率。另采用空白全血基質(zhì)配制質(zhì)量濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)測定6次，連續(xù)測定5 d。結(jié)果顯示，97種農(nóng)藥的回收率為32.2%～120%，日內(nèi)精密度(RSD)為1.9%～11%，日間RSD為3.6%～13%。

表3 97種農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回收率、日間RSD、日內(nèi)RSD、檢出限與定量下限

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

2.4 實際樣品分析

2020年5月，河南省泌陽縣某村村東側(cè)河溝內(nèi)發(fā)現(xiàn)一具男尸，經(jīng)當(dāng)?shù)毓矙C關(guān)確認(rèn)為余某，失蹤約半月。取死者心血和稀釋100倍后的胃內(nèi)容物，利用本方法進行篩查和檢驗，均檢出聯(lián)苯菊酯(圖3)，濃度分別為37.3 ng/mL和22.5 ng/g(稀釋后)，為法醫(yī)判定死因提供了參考。該結(jié)果表明建立的方法能夠用于實際血液樣品中農(nóng)藥的檢測。

圖3 心血(A)和胃內(nèi)容物(稀釋100倍,B)檢出聯(lián)苯菊酯的色譜圖

3 結(jié) 論

本研究建立了Simple-QuEChERS Nano結(jié)合GC-MS/MS同時檢測血液中97種農(nóng)藥的分析方法，該方法有機溶劑用量少，綠色環(huán)保，并可一步完成樣品制備，便捷高效，節(jié)約了樣品前處理時間，提高了工作效率。同時，該方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、靈敏度高，能夠滿足實際工作血液中農(nóng)藥的檢測需求。