賈 瑋，李芮廷，劉樹興，石 琳，武希璇，儲曉剛,2

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021;2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100123)

灘羊肉是我國寧夏的優(yōu)勢特色畜種產(chǎn)品[1-3]，以脂肪分布均勻，肉質(zhì)鮮美，風(fēng)味獨特受到消費者的喜愛。冷鏈(-20 ℃)貯藏是消費者和上游供應(yīng)商之間的冷藏食品的連續(xù)溫控儲存和運輸系統(tǒng)，用于保持食品的質(zhì)量安全和長期儲存[4]。宰后的新鮮灘羊需經(jīng)過冷鏈貯藏才可到達(dá)消費者的餐飲中，在此過程中水分、溫度和持水力等因素均會對肉質(zhì)產(chǎn)生一定影響[5-9]。

脂質(zhì)作為灘羊肉的主要營養(yǎng)成分之一，其組成成分會對肉的氣味、風(fēng)味、顏色及質(zhì)地等產(chǎn)生一定的影響，是決定消費者購買意愿的主要標(biāo)志[10-14]。研究表明，脂類物質(zhì)代謝物的存在形式與肉類的氣味和風(fēng)味密切相關(guān)，如4-甲基壬酸、4-甲基辛酸和4-乙基辛酸是綿羊的主要風(fēng)味脂肪酸[15-16]。脂質(zhì)組學(xué)因具有獨特的生物活性被廣泛應(yīng)用于食品鑒定(如泰和烏骨雞與豬肉)[17-18]。質(zhì)譜分析在儀器和技術(shù)方面的迅速發(fā)展，極大地促進了脂質(zhì)組學(xué)及其在食品中的應(yīng)用[19]。目前針對食品在冷鏈貯藏過程中脂質(zhì)組學(xué)方面的研究較少，因而利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究宰后灘羊肉的脂質(zhì)組成對探索動物宰后肉成熟機理、改進冷鮮肉加工貯運技術(shù)具有積極的指導(dǎo)作用。

本文采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS)與脂質(zhì)組學(xué)相結(jié)合的分析方法，對灘羊肉在冷鏈貯藏過程中變化顯著的脂質(zhì)進行了篩查，研究其含量的變化規(guī)律，分析在冷鏈貯藏過程中發(fā)生的脂質(zhì)代謝，揭示不利于灘羊肉品質(zhì)保證的脂質(zhì)變化規(guī)律，并確定其相對合適的冷鏈貯藏時間；分析顯著變化脂質(zhì)的二級碎裂質(zhì)譜和碎裂機制模式，獲得其特征性碎裂片段。旨在分析灘羊肉冷鏈貯藏影響因素與探索脂質(zhì)變化規(guī)律，從而為灘羊肉的質(zhì)量控制和市場上灘羊肉的冷鏈貯藏時間判別提供相關(guān)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

甲酸銨(純度≥99%，瑞士Fluka公司)；甲酸(純度≥95%，美國Sigma Aldrich公司)；水和異丙醇(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；乙腈(純度≥99.95%，荷蘭Akzo Nobel公司)。灘羊肉購于中國寧夏回族自治區(qū)，將其去除骨頭和皮膚，切割背部最長肌的中間部分成大小為3 cm×3 cm×3 cm的肉，用絞肉機絞碎混合后，再分別均勻地轉(zhuǎn)移至聚乙烯塑料袋中并排氣，放入溫度為-20 ℃冷庫(第0～24 d)。每日在同一時間隨機抽取12個平行樣本進行脂質(zhì)提取(連續(xù)取24 d)。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(美國Thermo Fisher Scientific公司)，配備Syringe自動取樣器系統(tǒng)、電噴霧離子源和Hypersil Gold C18反相色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.9 μm)；TY2018001252型立式高速冷凍離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；MIX-25P型迷你混合器(杭州MIULAB公司)。

1.3 樣品前處理

通過對比脂質(zhì)的回收率、精密度、提取脂質(zhì)的數(shù)量和所用程序的復(fù)雜性等方法學(xué)參數(shù)，表明異丙醇提取方式優(yōu)于甲醇/氯仿提取方式[20]。因此，優(yōu)化后的前處理采用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)的脂質(zhì)提取方式。提取過程如下：將12個平行樣本各稱取0.5 g混合肉糜分別置于12個10 mL離心管中，各加入4.5 mL異丙醇，渦旋混合1 min，室溫下超聲處理10 min后，置于-20 ℃下保存3～5 h加速蛋白質(zhì)沉淀，渦旋1 min，離心(14 000×g，4 ℃，10 min)。取1 mL上清液過0.22 μm尼龍濾膜并轉(zhuǎn)移至進樣小瓶中，進樣分析。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Hypersil Gold C18反相色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.9 μm);流動相：溶液A為0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸銨+乙腈/水(60∶40，體積比)，溶液B為0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸銨+異丙醇/乙腈(90∶10，體積比)。進樣量為5 μL；進樣速度為300 μL/min；柱溫為55 ℃。梯度洗脫程序：0～1 min，30%～38% B；1～4 min，38%～56% B；4～14 min，56%～98% B；14～15 min，98%～100% B；15～16 min，100% B；16～16.1 min，100%～30% B；16.1～20 min，30% B。

電噴霧離子源(ESI)參數(shù)：噴霧電壓為3.5 kV；鞘氣流速為48 L/min；輔助氣流速為11 L/min；毛細(xì)管溫度為240 ℃；輔助氣加熱器溫度為300 ℃；采集時間為0～20 min；全掃描模式的分辨率為70 000 FWHM；二級掃描模式的分辨率為35 000 FWHM；質(zhì)量采集范圍為m/z100～1 500。質(zhì)量控制樣品(QC)和空白樣品在每組樣品間隔進樣分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將質(zhì)譜所得原始數(shù)據(jù)存于Xcalibur(版本4.1)軟件，導(dǎo)入Compound Discover軟件中通過背景漂移校正、峰提取、峰對齊獲得脂質(zhì)分子峰表，利用LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫匹配特征性脂質(zhì)。隨后將匹配好的5組樣品(第0、6、12、18、24 d)的脂質(zhì)數(shù)據(jù)可視化為csv文件，導(dǎo)入MetaboAnalyst(版本4.0)進行多元統(tǒng)計學(xué)分析。LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫匹配脂質(zhì)分為5類：脂肪酰基肉堿、磷脂酰膽堿(PC)、溶血性磷脂酰膽堿(LPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和溶血性磷脂酰乙醇胺(LPE)。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪?；愔|(zhì)分子分析

采用正離子模式對灘羊肉的脂質(zhì)提取物和質(zhì)量控制樣品進行分析，所得質(zhì)譜圖的脂質(zhì)信號以1～3 min、5～10 min和12～13 min為主。對脂肪?；鈮A進行二級碎裂并分析其特征性碎裂離子，發(fā)現(xiàn)其碎裂模式與多不飽和脂肪酸的碳原子數(shù)無關(guān)，而與其極性頭部基團相關(guān)。以棕櫚酰肉堿的二級裂解為例(圖1)，其分子離子為m/z400.341 09[M+H]+。裂解途徑為：分子離子發(fā)生i-斷裂，導(dǎo)致C3H9N片段丟失產(chǎn)生特征性碎裂離子m/z341.267 82[M+H-C3H9N]+，該離子進而以γH重排的方式生成終產(chǎn)物離子m/z85.028 91[M+H-C3H9N-C16H32O2]+；分子離子還可通過失去C16H32O2片段產(chǎn)生同分異構(gòu)體離子m/z144.101 65[M+H-C16H32O2]+，該同分異構(gòu)體離子可通過正離子誘導(dǎo)的i-斷裂導(dǎo)致C3H9N片段丟失，生成終產(chǎn)物離子m/z85.028 91[M+H-C3H9N-C16H32O2]+。最終形成3個特征性碎片離子，分別為m/z85.028 91、m/z341.267 82和m/z144.101 65。

圖1 棕櫚酰肉堿的二級質(zhì)譜圖及碎裂途徑分析

2.2 甘油磷脂類脂質(zhì)分子分析

LPC、PC、LPE和PE 4種亞類脂質(zhì)解離發(fā)生在極性基團。LPC(18∶1)分子離子以正離子誘導(dǎo)的i-斷裂產(chǎn)生離子m/z463.281 92，再通過多次γH重排和H2O的丟失產(chǎn)生離子m/z181.025 59和離子m/z163.015 29(如圖2A和圖3A)。特征性碎裂離子分別為m/z522.354 19、m/z181.025 59、m/z163.0152 9。PC(18∶2/18∶2)分子離子發(fā)生誘導(dǎo)裂解，極性基團失去C3H9N片段生成離子m/z723.493 86，通過γH重排失去脂肪酸酰基鏈和分子骨架，生成極性基團離子m/z124.999 77和m/z98.984 66(如圖2B和圖3B)。特征性碎裂離子分別為m/z723.493 86、m/z124.999 77和m/z98.984 66。PE(16∶0/18∶2)分子離子經(jīng)過誘導(dǎo)裂解產(chǎn)生特征性碎裂片段m/z460.284 18，發(fā)生γH重排產(chǎn)生特征性碎裂離子m/z417.249 72和碎片離子m/z198.052 59，均通過γH重排產(chǎn)生特征性碎裂離子m/z155.010 38(如圖2C和圖3C)。特征性碎裂離子分別為m/z460.284 18、m/z417.249 72、m/z155.010 38。PE(18∶0/18∶1)分子離子通過失去H2片段產(chǎn)生離子m/z743.546 17，裂解失去NH3片段產(chǎn)生碎裂離子m/z726.519 41，再通過α-裂解產(chǎn)生離子m/z104.977 17；第2條裂解途徑為m/z743.546 17通過α-裂解產(chǎn)生特征性碎裂離子m/z122.009 68，再裂解失去NH3片段產(chǎn)生m/z104.977 17(如圖2D和圖3D)。特征性離子分別為m/z743.546 17、m/z122.009 68和m/z104.977 17。

圖2 甘油磷脂的碎裂途徑分析

圖3 甘油磷脂的二級質(zhì)譜圖

通過特征碎裂離子與LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫比對，共鑒定115個脂質(zhì)成分，其中48個脂質(zhì)在冷鏈貯藏過程中的含量變化顯著(如表1)，包括脂肪?；?脂肪酰基肉堿)和甘油磷脂類(PC、LPC、PE、LPE)兩大類。表1中p-值為t檢驗結(jié)果，用于評價變量在不同樣本間的差異是否顯著;FC-值為差異倍數(shù)，為代謝物的平均表達(dá)量在兩組樣本中的比值。同時，運用脂質(zhì)組學(xué)方法研究48個差異性脂質(zhì)分子在冷鏈貯藏過程中的含量變化規(guī)律。

表1 灘羊肉24 d冷鏈貯藏過程中變化顯著性脂質(zhì)代謝物的分子信息

(續(xù)表1)

圖4 5組樣品和QC樣品的PCA模型(n=12)

圖5 5組樣品的PLS-DA模型(n=12)

采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(PLS-DA)研究5組樣品中變化顯著的物質(zhì)。PCA模型可表明不同冷鏈貯藏時間灘羊肉的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物水平的總體輪廓分布，圖4結(jié)果顯示，所得PC1和PC2分別為45.2%和39.9%，充分地解釋了樣品間的差異性。每組樣品均明顯分離，且QC樣品很好地聚集，說明儀器的穩(wěn)定性良好。為進一步判斷不同冷鏈貯藏時間的變化顯著性脂質(zhì)，建立了PLS-DA模型(如圖5)，該模型可消除背景噪聲和組內(nèi)誤差干擾的影響，使組間差異最大化。該模型的解釋變量R2和可預(yù)測變量Q2分別為0.997和0.995，可以很好地解釋和預(yù)測兩組樣本間的差異。上述結(jié)果表明，PCA和PLS-DA模型對于不同冷鏈貯藏時間發(fā)生脂質(zhì)變化的灘羊肉樣品均能較好地分類。

2.3 脂質(zhì)組學(xué)分析

本實驗鑒定了冷鏈貯藏過程中灘羊肉的48個變化顯著性脂質(zhì)，包含8個脂肪?；鈮A、3個LPC、1個LPE、23個PC、13個PE等5類脂質(zhì)。其變化主要表現(xiàn)在第0～12 d和第12～24 d間的不同變化趨勢，不僅可以解釋灘羊肉在冷鏈貯藏過程中發(fā)生的脂質(zhì)代謝，探討灘羊肉的最佳冷鏈貯藏時間，并可通過分析建立的“貯藏脂質(zhì)代謝物指紋圖譜”評價市場上經(jīng)過冷鏈貯藏的灘羊肉品質(zhì)。

2.3.1 脂肪?；惖慕M學(xué)分析脂肪酰基肉堿是灘羊肉在冷鏈貯藏過程中檢出的亞類脂質(zhì)之一，歸屬于脂肪?；悺Ｈ绫?所示，8個長鏈脂肪酰基肉堿發(fā)生顯著性變化，分別為O-(17-羧基庚烷?；?肉堿、O-十四烷?；鈮A、2-羥基十六烷?；鈮A、亞油酸肉堿、硬脂酰肉堿、棕櫚酰肉堿、O-油酰肉堿和反式十六烷基-2-烯醇肉堿。脂肪?；鈮A在第0～12 d表達(dá)上調(diào)，第12～24 d表達(dá)下調(diào)，第12 d達(dá)到最大含量。同時發(fā)現(xiàn)長鏈脂肪?；鈮A與L-肉堿的比例在第0～12 d表達(dá)上調(diào)，表明冷凍貯藏促進了長鏈脂肪酸向脂肪?；鈮A的轉(zhuǎn)化[21]。脂肪?；鈮A為脂肪酸β-氧化的中間產(chǎn)物，其含量的積累可促進脂肪酸在冷鏈貯藏后期的β-氧化，導(dǎo)致灘羊肉品質(zhì)下降。

2.3.2 甘油磷脂類的組學(xué)分析灘羊肉在冷鏈貯藏過程中發(fā)生顯著性變化的第2類脂質(zhì)為甘油磷脂，其中PC、PE、LPC、LPE 4種亞類變化尤為顯著。如表1所示，第0～12 d期間，PC(18∶0/22∶5(4Z，7Z，10Z，13Z，16Z))、PE(18∶0/18∶1(9Z))等62%的PC和PE發(fā)生明顯上調(diào)，12 d后開始下降；PC(16∶0/16∶0)、PE(16∶0/18∶2(9Z，12Z))等其余脂質(zhì)在冷鏈貯藏初始表現(xiàn)下調(diào)直至冷鏈貯藏結(jié)束。LPC(18∶2)、LPE(18∶0)等全部LPC和LPE的含量在整個冷鏈貯藏過程中顯著增加。文獻(xiàn)研究顯示，磷脂酶活性在冷鏈貯藏期間的增加可導(dǎo)致水牛肉中LPC和LPE的含量增加以及PC和PE的含量降低[22]，這表明冷鏈貯藏會影響PC、PE、LPC和LPE之間的脂質(zhì)轉(zhuǎn)化及含量變化。PC具有自氧化作用，PE具有抗氧化作用，在冷鏈貯藏的第12 d后灘羊肉會發(fā)生大量的PC和PE氧化代謝；環(huán)境的穩(wěn)定性和氨基酸種類的不同使得PE轉(zhuǎn)化為PC，導(dǎo)致PC短期積累，從而影響灘羊肉風(fēng)味[23-24]。

3 結(jié) 論

本研究建立了UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS結(jié)合脂質(zhì)組學(xué)分析灘羊肉在冷鏈貯藏過程中脂質(zhì)變化規(guī)律的方法。結(jié)果表明灘羊肉在冷鏈貯藏期間保持氧化分解狀態(tài)，其中，在冷鏈貯藏的前12 d，PC、PE和脂肪酰基肉堿含量的短期積累導(dǎo)致灘羊肉在第12 d后發(fā)生大量的自氧化代謝反應(yīng)，進而使得灘羊肉品質(zhì)變差的概率大大提升。說明在宰后冷鏈貯藏的前12 d內(nèi)灘羊肉脂質(zhì)的變化對肉質(zhì)影響相對較小，即12 d為最佳的冷鏈貯藏時間。同時采用二級碎裂質(zhì)譜信息研究灘羊肉在冷鏈貯藏過程中變化顯著脂質(zhì)的裂解機理，獲得變化顯著脂質(zhì)的特征碎裂片段。利用QC樣本對方法穩(wěn)定性進行判斷，結(jié)果表明QC樣本聚集明顯，滿足儀器對實驗分析的穩(wěn)定性要求。本研究利用碎裂機理和UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS結(jié)合脂質(zhì)組學(xué)的檢測方法具有可靠性高、樣品消耗量少和信息采集豐富等特點，可廣泛應(yīng)用于冷鏈貯藏中肉的品質(zhì)判斷。