鄭宇婷，姜進(jìn)勇，周紅寧，馬雅軍

登革熱(Dengue Fever)是登革病毒(Dengue virus)經(jīng)蚊媒傳播引起的急性蟲(chóng)媒傳染病，主要在熱帶和亞熱帶流行[1]。1779年首次發(fā)現(xiàn)登革熱病例[2]，全球約25億人有感染登革病毒的危險(xiǎn)，每年約有1億新感染病例，其中50萬(wàn)重癥病例需住院治療[3]。我國(guó)最早在1873年廈門首次報(bào)道，1995年后呈局部暴發(fā)、輸入性流行的特征[2]，2004年以來(lái)廣東、福建、浙江等省份多次暴發(fā)本地疫情是我國(guó)重點(diǎn)防控區(qū)[4-6]。與云南省接壤的越南、緬甸和老撾等國(guó)家為登革熱常年流行區(qū)[7]。云南省最早發(fā)現(xiàn)登革熱病例是在1975年河口縣[8]， 2004年以來(lái)有散在輸入病例報(bào)告，2008年在德宏州芒市、臨滄市鎮(zhèn)康縣首次報(bào)道云南省登革熱本地病例[9-10]， 2013年景洪市暴發(fā)登革熱本地疫情[10]，此后我省西雙版納州景洪市、勐臘縣、德宏州瑞麗市、臨滄市耿馬縣等多次暴發(fā)流行，且流行日趨嚴(yán)重，登革熱已經(jīng)成為我省邊境地區(qū)重要的蟲(chóng)媒傳染病，嚴(yán)重危害邊境地區(qū)人群健康。

埃及伊蚊(Aedesaegypti)是登革熱的重要傳播媒介，其傳播能力遠(yuǎn)高于白紋伊蚊。埃及伊蚊為云南省的入侵蚊蟲(chóng)，2002年首次在瑞麗市發(fā)現(xiàn)，其后10余年間分布范圍不斷擴(kuò)大，德宏州的芒市、隴川和盈江，西雙版納的景洪、勐臘、勐海，臨滄市的耿馬等3個(gè)州(市)、8個(gè)邊境縣(市)均有埃及伊蚊的分布[11-12]。埃及伊蚊的入侵加劇了云南省登革熱的暴發(fā)和流行風(fēng)險(xiǎn)。媒介控制是登革熱防控的重要措施，研究埃及伊蚊的遺傳特性，對(duì)登革熱防控具有重要意義。

微衛(wèi)星(Simple Sequence Repeat，SSR)一般是由2～6個(gè)堿基為核心組成首尾相連的串聯(lián)重復(fù)序列。DNA的滑動(dòng)復(fù)制導(dǎo)致微衛(wèi)星DNA長(zhǎng)度多態(tài)性的產(chǎn)生，在埃及伊蚊種群特征的研究中，利用對(duì)核苷酸重復(fù)單位數(shù)目差異的研究來(lái)分析遺傳相關(guān)的各項(xiàng)指標(biāo)。微衛(wèi)星因共顯性遺傳、高多態(tài)性和重復(fù)性好等特點(diǎn)，是研究蚊蟲(chóng)群體遺傳結(jié)構(gòu)理想的分子標(biāo)記之一[13]，本研究采集云南省5個(gè)登革熱重點(diǎn)縣的埃及伊蚊，篩選12個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)，通過(guò)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析云南省5個(gè)不同地理來(lái)源的埃及伊蚊種群的親緣關(guān)系群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)特征，對(duì)有效防制埃及伊蚊、科學(xué)防控登革熱提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源 依據(jù)埃及伊蚊入侵、定值和擴(kuò)散的程度，選擇云南省德宏州瑞麗市、西雙版納州景洪市、勐臘縣、勐?？h、臨滄市耿馬縣作為調(diào)查地點(diǎn)，在埃及伊蚊蚊蟲(chóng)密度高峰季節(jié)，采集花瓶、輪胎、水桶、廢棄瓶以及其他等容器中孳生的伊蚊幼蟲(chóng)，帶回實(shí)驗(yàn)室根據(jù)不同的孳生容器分開(kāi)飼養(yǎng)至羽化，形態(tài)學(xué)鑒定蟲(chóng)種[14]，并將鑒定出的埃及伊蚊保存于凍存管分裝，單管單只。每個(gè)點(diǎn)采集根據(jù)采集方位和孳生容器隨機(jī)抽取29～30只[15]埃及伊蚊成蚊樣本，確保采集樣本覆蓋每種孳生容器。低溫冰箱保存待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 樣本單管單只成蚊，采用DNA提取試劑盒[TIANamp Genomic DNA Kit(血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒)(離心柱型)(含蛋白酶K)]，按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取蚊蟲(chóng)組DNA，并用超微量核酸分析儀(杭州奧盛儀器有限公司，Nano-200)檢測(cè)濃度和純度，通過(guò)查閱文獻(xiàn)找出埃及伊蚊微衛(wèi)星位點(diǎn)的側(cè)翼序列[16]設(shè)計(jì)13對(duì)引物(表1)。

對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行13對(duì)引物的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系共25 μL：10*Ex Taq buffer 2.5 μL，DNTP (2.5 mmol/L) 2 μL，MIX primer 1 μL(MIX primer 為正、反向引物等量混合)，DNA模板1 μL，Ex Taq 0.2 μL，H2O 18.3 μL。反應(yīng)條件為：96 ℃ 5 m, 96 ℃ 20 s, 53～58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,10個(gè)循環(huán)；96 ℃ 20 s, 52 ℃ 30 s,72 ℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 m。擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳后得到原始數(shù)據(jù)(華大基因公司完成)。

表1 埃及伊蚊13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)引物的相關(guān)信息

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用GeneMaker(version2.20)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，利用GenAIEx 6.503計(jì)算各基因座等位基因數(shù)(number of allele, Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of allele, Ne)、觀測(cè)雜合度(observed heterozygosity， Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity， He)、群體內(nèi)近交系數(shù)(population inbreeding coefficient, Fis)、遺傳分化系數(shù)(genetic differentiation coefficient, Fst)、基因流(number of migrants per generation, Nm)以及Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(Nei’s standard genetic distance)、遺傳相似系數(shù)(Nei’s standard genetic Identity)等指標(biāo)，并根據(jù)遺傳分化和地理距離進(jìn)行mantel test分析。使用PIC-CALC軟件計(jì)算多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)。利用Arlequin3.5.1計(jì)算種群間成對(duì)固定指數(shù)Fst。

2 結(jié) 果

2.1蚊蟲(chóng)采集結(jié)果 2017年6月1日-24日分別在瑞麗、勐臘、景洪、勐海、耿馬采集伊蚊幼蟲(chóng)，并在顯微鏡下初步判定，收集埃及伊蚊幼蟲(chóng)并飼養(yǎng)至成蚊，共收集234個(gè)有伊蚊幼蟲(chóng)的容器，經(jīng)鑒定飼養(yǎng)收集的埃及伊蚊有603只(表2)。

不同孳生容器中隨機(jī)選取1～10只，總149只開(kāi)展實(shí)驗(yàn)(表3)。

表2 埃及伊蚊采樣信息表

表3 選取埃及伊蚊實(shí)驗(yàn)樣本信息表

2.2毛細(xì)管電泳擴(kuò)增的結(jié)果 樣本DNA提取經(jīng)超微量核酸提取儀檢測(cè)后濃度在16.51～77.88 ng/μL，經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳擴(kuò)增以后共得到1 750個(gè)有效片段用于埃及伊蚊的遺傳特征分析，其中AG7、AC4、AC2引物擴(kuò)增效果最理想，全部擴(kuò)增出有效片段；AC1引物擴(kuò)增效果最差。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為91～197 bp之間。用GeneMaker(version2.20)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，檢測(cè)數(shù)據(jù)和結(jié)果較多，分別選取2個(gè)位點(diǎn)的2個(gè)樣本的系列圖峰作為示例描述。圖1分別是樣本MH066位點(diǎn)AG1上的雜合子、樣本RLCQ23位點(diǎn)AC4上的純合子。

(MH066AG1為雜合子，大小為107和114；RLCQ23AC4為純合子，大小為115和115)

2.3微衛(wèi)星遺傳多樣性 CT2位點(diǎn)未擴(kuò)增出目的片段，其余12對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)5個(gè)不同地理位置：景洪、勐臘、勐海、瑞麗、耿馬的埃及伊蚊自然種群進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測(cè)到216個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因個(gè)數(shù)為10～31個(gè)，所有位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)為18，有效等位基因?yàn)?.653個(gè)。其中，位點(diǎn)AG7和AG2的等位基因?yàn)?1個(gè)，等位基因數(shù)量最多；位點(diǎn)AG3的等位基因?yàn)?0個(gè)，數(shù)量最少。觀測(cè)雜合度為0.548～0.910之間，平均值為0.711；期望雜合度為0.623～0.827，平均值為0.728。12個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量范圍為0.615～0.881，平均PIC 為0.778。其中AG1位點(diǎn)標(biāo)記PIC指數(shù)最高為0.881，AC1位點(diǎn)的標(biāo)記PIC指數(shù)最低為0.615(表4)。

從種群角度分析，平均每個(gè)種群的等位基因數(shù)在7.750～10.583之間，等位基因數(shù)最多的是耿馬，最少的是勐臘(表5)。5個(gè)自然種群平均觀測(cè)雜合度分布范圍是0.661(JH)～0.741(ML)，平均期望雜合度的分布范圍在0.629(ML)～0.774(RL)之間。PIC指數(shù)最高是RL種群(0.750),最低是ML種群(0.588)(表5)。

2.4遺傳分化系數(shù)及基因流 12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis)有8個(gè)位點(diǎn)的雜合子過(guò)剩(Fis>0),4個(gè)位點(diǎn)的雜合子缺失(Fis<0)，F(xiàn)is范圍在0.220～0.207之間，平均值為0.028，AC1和AG2位點(diǎn)的Fis和Fit值最高，分別為0.207、0.137和0.260、0.267。說(shuō)明這2個(gè)位點(diǎn)群體內(nèi)近交程度較其他位點(diǎn)高(表6)。

表4 12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的總遺傳參數(shù)

表5 云南省5個(gè)埃及伊蚊自然種群12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳特征數(shù)值

按照Balloux等[17]的遺傳分化的標(biāo)準(zhǔn)(低:0.15～0.25，中：0.05～0.15，高：0～0.05)，本研究群體間近交系數(shù)(Fst)平均值為0.078，為中度遺傳分化。

云南5個(gè)埃及伊蚊群體Nm均值為3.321，AG5位點(diǎn)上的基因流最大(5.210)，AG2位點(diǎn)上的基因流最小(1.414)。所有位點(diǎn)的基因流均大于1(表6)。

表6 云南5個(gè)埃及伊蚊種群12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的遺傳分化系數(shù)和基因流的情況

應(yīng)用GenALEx軟件中的Mantel Test檢驗(yàn)埃及伊蚊種群間遺傳分化和地理距離的相關(guān)性，地理距離(表7)由采樣點(diǎn)經(jīng)緯度計(jì)算得出，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(y=4E-07x+0.251 1，R2=0.263 5，P=0.100)。

表7 云南5個(gè)埃及伊蚊自然種群間地理距離(對(duì)角線之上)與遺傳分化(對(duì)角線之下)矩陣表

2.5云南5個(gè)自然種群間遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離 Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離在0.162～0.527之間，對(duì)應(yīng)的遺傳相似度在0.590～0.850之間(表8)。

表8 5個(gè)埃及伊蚊種群Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(對(duì)角線之下)與遺傳相似系數(shù)(對(duì)角線之上)

勐臘與勐海群體的遺傳相似度最高為0.850，遺傳距離為0.162；勐臘與瑞麗群體的遺傳相似度最低為0.590，遺傳距離為0.527。

3 討 論

5個(gè)埃及伊蚊自然種群的遺傳多樣性、生物多樣性研究中遺傳多樣性的研究尤為重要，等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息量等參數(shù)用于反映遺傳多樣性水平的重要指標(biāo)，其值越大，說(shuō)明基因豐富度越高、生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)[18]。

本研究利用12對(duì)微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)5個(gè)埃及伊蚊自然種群進(jìn)行遺傳多樣性分析，12個(gè)位點(diǎn)平均Ho為0.711，平均He為0.728，平均PIC為0.778，平均每個(gè)種群的等位基因數(shù)在7.75～10.583之間，表明各種群遺傳多樣性較高，與石清明、劉蓬勃等的研究結(jié)果項(xiàng)目一致[19-20]。景洪、瑞麗、勐海、耿馬、勐臘的平均Ho分別為0.661、0.699、0.722、0.729、0.741；平均He分別為0.725、0.774、0.751、0.758、0.629；平均PIC分別為0.691、0.750、0.724、0.731、0.588，雜合度代表基因多樣度，在不考慮樣本數(shù)量影響的情況下，反應(yīng)群體在多個(gè)基因位點(diǎn)的遺傳變異程度。本研究中景洪、瑞麗、耿馬、勐海種群平均期望雜合度高于平均觀測(cè)雜合度，意味著種群內(nèi)可能存在近交；勐臘種群平均觀測(cè)雜合度高于平均期望雜合度，意味著種群可能有大量外來(lái)個(gè)體的補(bǔ)充，或者可能經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)或奠基者效應(yīng)[19]。參照Botstein等提出的衡量基因變異程度高低的PIC指標(biāo)，本研究5個(gè)種群PIC都大于0.5(平均為0.697)，為高度多態(tài)。5個(gè)群體中瑞麗的PIC最高，表明呈現(xiàn)高度多態(tài)。

5個(gè)埃及伊蚊自然種群的遺傳和親緣關(guān)系群體內(nèi)近交系數(shù)，其值越接近0，基因的分布越接近平衡，值為負(fù)時(shí)提示雜合子缺失，值為正時(shí)存在雜合子過(guò)剩[21]?；蛟谌后w中的流動(dòng)稱為基因流，Nm越大說(shuō)明群體越均勻[22]，大于1則能夠抑制群體間的分化[23]。

各種群的近交系數(shù)中勐臘Fis值為負(fù)，表示與其他種群近交程度很低，其他4個(gè)種群為正，說(shuō)明這些種群中存在著不同程度的近交。5個(gè)自然種群的樣本成對(duì)固定指數(shù)Fst均在0.057～0.148之間，表示種群間中度分化?；蛄鱊m越大，群體間的相似性越大。5個(gè)自然種群12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均Nm為3.321，種群基因流較高，暗示5個(gè)群體間遺傳交流水平高，能夠抵制遺傳漂變作用和防止種群分化的發(fā)生。與劉蓬勃[20]、石清明等[19]的研究結(jié)果一致。

遺傳距離和相似度都是用來(lái)分析群體之間的親緣關(guān)系，5個(gè)群體之間勐臘和瑞麗的Nei’s遺傳距離最大，遺傳相似度最低，表明這2個(gè)群體的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；勐臘和勐海的Nei’s遺傳距離最小，遺傳相似度最高，說(shuō)明這2個(gè)群體的親緣關(guān)系最近。經(jīng)計(jì)算5個(gè)自然種群的地理距離和遺傳分化之間無(wú)顯著相關(guān)性。

本研究采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)云南省5個(gè)埃及伊蚊自然種群進(jìn)行遺傳多樣性分析，多樣性指標(biāo)PIC為0.588～0.750，呈現(xiàn)高度多態(tài)性，近交系數(shù)為0.028；遺傳分化系數(shù)為0.078，基因流均值為3.321，表明群體間遺傳交流水平高，存在一定程度的遺傳分化。5個(gè)群體間的遺傳距離為0.162～0.527之間，勐臘和勐海群體遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近，勐臘和瑞麗的群體遺傳距離最遠(yuǎn)，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。景洪、瑞麗、勐海、耿馬的埃及伊蚊種群存在著不同程度的近交，勐臘的埃及伊蚊種群可能經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)或者有大量外來(lái)個(gè)體補(bǔ)充，還需要進(jìn)一步確定。

利益沖突：無(wú)