熊雨菡，李智穎，盧 楠，陳俊伊，唐佳玲，徐 蕾，楊 春，何永林

全球每年約有1 000萬新發(fā)結(jié)核病例，其中有150萬人死于結(jié)核病(Tuberculosis，TB)[1]。而結(jié)核分枝桿菌多藥耐藥(MDR)和廣泛耐藥(XDR)突變株的出現(xiàn)和傳播將阻礙結(jié)核病的治療[2]。2018年，全球預計有484 000人患上了利福平(結(jié)核病最有效的一線藥物)耐藥結(jié)核病(RR-TB)，其中78%患有多藥耐藥結(jié)核(MDR-TB)[1]，而結(jié)核分枝桿菌變得對藥物治療不敏感可能是由于其進入了非復制狀態(tài)[3]。有研究表明，在大多數(shù)個體中，最初的感染轉(zhuǎn)變?yōu)闊o癥狀的潛伏狀態(tài)，結(jié)核分枝桿菌以無復制的持續(xù)狀態(tài)存在于宿主肉芽腫中，且代謝活性低[4-5]。導致這種生理狀態(tài)建立的不利環(huán)境因素包括低氧、營養(yǎng)不良、pH低以及宿主免疫反應產(chǎn)生的氧化和亞硝化應激[5]。這種適應主要歸因于RNA聚合酶參與的能夠調(diào)節(jié)其復雜基因組表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡[6]。σ因子與RNA聚合酶全酶結(jié)合，提供其對特定啟動子的特異性，并在調(diào)節(jié)基因表達和適應原核生物的壓力中起關鍵作用[7]。結(jié)核分枝桿菌基因組編碼13個σ因子，輔助σ因子σE是結(jié)核分枝桿菌中最典型的σ因子之一，它對于在不同壓力環(huán)境下(包括表面和氧化應激條件)的生存至關重要[8]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，σE可通過促進恥垢分枝桿菌進入持留狀態(tài)影響抗結(jié)核藥物的敏感性[9]。

近來，抑制σ因子功能的抗σ因子也受到越來越多的關注。結(jié)核分枝桿菌的抗σE因子RseA由Rv1222基因編碼。恥垢分枝桿菌是一種在安全性、生長特性和遺傳易感性方面用于分枝桿菌研究的模式生物，已被廣泛用于抗生素的作用和耐藥性研究[10]。恥垢分枝桿菌的RseA由基因MSMEG_5071編碼。RseA編碼基因緊鄰下游σE，已被證明是可直接調(diào)控σE的特異性抗σE因子[11]，而至今針對RseA在抗結(jié)核藥物敏感性的機制研究較少。因此，本實驗構(gòu)建了重組恥垢分枝桿菌pMV261-MSMEG-5071/MS，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術和生物信息學方法篩選出差異表達基因(differentially expression genes，DEGs)，并對其進行了基因本體論(Gene Ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析，構(gòu)建了蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡，通過MCODE插件篩選出可能受RseA調(diào)控的基因及其可能的分子機制并進行初步驗證，為耐藥結(jié)核病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1實驗材料 質(zhì)粒pMV261、E.coliDH5α和恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsegmatismc2155，MS)和RpfE蛋白由實驗室保存。HindⅢ、BamH Ⅰ和T4連接酶(Thermo Fisher Scientific)，DAB顯色試劑盒(康為世紀)，卡那霉素(Genview)，膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白Marker(Takara)，小鼠抗組氨酸單克隆抗體(Bioworld Technology)，HRP標記的羊抗兔IgG(美國Signalway Antibody)，SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(EpiZye)，異煙肼、利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、鏈霉素(北京睿博興科)。

1.2方 法

1.2.1重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建 根據(jù)NCBI GenBank(基因序列號NC_008596.1)中恥垢分枝桿菌MSMEG_5071的基因序列設計引物。以MS基因組為模板進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pMV261分別經(jīng)BamHⅠ/HindⅢ酶切并用T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，長出單菌落后，挑取單菌落培養(yǎng)并測序驗證。將構(gòu)建成功的pMV261-MSMEG_5071重組質(zhì)粒經(jīng)2.5 KV、4 ms電轉(zhuǎn)至恥垢分枝桿菌感受態(tài)中，涂布在含有卡那霉素的7H10固體培養(yǎng)基上，長出單菌落后，挑取單菌落培養(yǎng)以獲得重組恥垢分枝桿菌pMV261-MSMEG_5071/MS。

1.2.2Western blot驗證蛋白RseA的表達 將構(gòu)建成功的重組恥垢分枝桿菌pMV261-MSMEG_5071/MS接種于含有卡拉霉素的7H9培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，分別于40 ℃、42 ℃、44 ℃和46 ℃熱誘導3 h后，37 ℃，160 r/min培養(yǎng)4 h，離心收集菌體后，于-80 ℃反復凍融3次，加入無菌PBS混勻，超聲碎菌，離心后分別收集上清與沉淀。將樣品經(jīng)金屬浴100 ℃ 10 min變性，通過Western blot驗證。

1.2.3樣本準備及轉(zhuǎn)錄組測序 將重組菌接種于含有卡那霉素的7H9培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.8，42 ℃熱誘導3 h，加入10 μg /mL EMB，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)48 h，離心收集菌體后，PBS洗滌3次，置于液氮盒中，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組學測序和生物信息學分析。

1.2.4測序數(shù)據(jù)質(zhì)控 通過Illumina Hiseq 測序獲得的原始圖像經(jīng)base calling轉(zhuǎn)換為序列數(shù)據(jù)，即原始數(shù)據(jù)raw data。使用Sickle和SeqPrep質(zhì)控軟件除去reads中的adapter序列、5′端含有非A、G、C、T的堿基和含N的比例達到10%的reads，修剪測序質(zhì)量較低的reads末端 (測序質(zhì)量值小于Q20)，棄置經(jīng)去adapter及質(zhì)量修剪后長度小于25 bp的小片段，得到高質(zhì)量reads，即clean data，并對數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估。通過Diamond分析軟件進行核糖體RNA污染率評估，若rRNA含量低于15%，則可進行后續(xù)分析。

1.2.5DEGs分析 使用Bowtie2軟件計算出每組中各個基因的表達量，通過DEGseq分析RseA基因過表達恥垢分枝桿菌組及空質(zhì)粒對照組的DEGs。篩選差異倍數(shù)(fold change)≥2且P≤0.001的基因為顯著DEGs。

1.2.6GO功能富集和KEGG信號通路分析 GO是一個在生物信息學領域中廣泛使用的本體，是實現(xiàn)統(tǒng)一基因相關數(shù)據(jù)、進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和開展數(shù)據(jù)挖掘的基礎，包括分子功能(molecular function，MF)、細胞組分(cellular components，CC)和生物學過程(biological process，BP)。KEGG是從分子水平信息了解高級功能和生物系統(tǒng)的實用程序數(shù)據(jù)庫資源。本實驗通過DAVID6.8對DEGs進行GO分析及KEGG分析。P<0.05為功能和通路具有統(tǒng)計學意義。

1.2.7PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建 STRING(https://string-db.org/)是可用于PPI網(wǎng)絡功能富集分析的在線數(shù)據(jù)庫之一。在STRING中輸入DEGs，以得到其PPI關系(sore>0.9)，通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡。通過復雜分子檢測(molecular complex detection，MCODE)插件篩選出最重要模塊，對模塊進行GO功能富集分析和KEGG信號通路分析，P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。并篩選出模塊中連接度最高的前8個hub基因。

1.2.8復蘇指數(shù)的測定 將重組菌培養(yǎng)至生長對數(shù)期，調(diào)節(jié)OD600至0.5，用含有卡那霉素的7H9液體培養(yǎng)基洗滌2次，離心后分別用含有100 μg /mL異煙肼(isoniazid，INH)、25 μg /mL利福平(rifampin，RIF)、10 μg /mL乙胺丁醇(ethambutol，EMB)、10 μg /mL左氧氟沙星(levofloxacin，LVFX)、10 μg /mL環(huán)丙沙星和6.4 μg /mL鏈霉素(streptomycin，STRE)的7H9培養(yǎng)基重懸，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)48 h。離心棄上清，用7H9培養(yǎng)基重懸后分為2組。一組等倍梯度稀釋至106，所有濃度的菌液各吸取10 μL加至7H9固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)3 d，計數(shù)；另一組用含有 20 ng/mL RpfE(可以促進非復制的持留菌復蘇生長[12])的7H9液體培養(yǎng)基等倍梯度稀釋至106，每濃度菌液吸取200 μL加至96孔板，并設置復孔，96孔板四周用200 μL 7H9液體培養(yǎng)基封板，于37 ℃培養(yǎng)2周后，觀察并記錄陽性細菌孔，查表得到最大可能數(shù)(Most probable number，MPN)。通過log10(MPN)-log10(CFU)計算得出的復蘇指數(shù)(Resuscitation Index，RI)來表示其復蘇能力[13]。

2 結(jié) 果

2.1重組恥垢分枝桿菌pMV261-MSMEG_5071/MS的構(gòu)建及驗證 以MS基因組為模板，擴增得到的PCR產(chǎn)物大小約為400 bp，與預期大小一致(見圖1)。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pMV261-MSMEG_5071經(jīng)BamHⅠ/HindⅢ酶切后，酶切片段大小與預期一致(圖2)。將重組質(zhì)粒pMV261-MSMEG_5071電轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌，40 ℃、42 ℃、44 ℃和46 ℃誘導表達，超聲碎菌處理，離心后，收集上清與沉淀，經(jīng)Western blot驗證，獲得分子量為17 kD左右的條帶，與預期大小一致(圖3)。

2.2兩組間DEGs分析結(jié)果 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，兩組間共篩選出2 403個DEGs，其中2 335個上調(diào)基因，68個下調(diào)基因。將2 403個DEGs繪制成火山圖，其中紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因(圖4)。

M.DNA marker；1-3.MSMEG-5071；PCR product is about 400bp；4.H2O as a control.

M.DNA Marker；1.pMV261-MSMEG-5071；2.Double digestion

M.Marker；1-8.supernatant and precipitation of pMV261-MSMEG-5071 lysate induced at 40 ℃，42 ℃，44 ℃，46 ℃；9.No-load strain induced at 42 ℃ for 3 h.

圖4 DEGs火山圖

2.3GO功能富集和KEGG信號通路分析 將篩選出的DEGs進行GO分析，發(fā)現(xiàn)DEGs共參與了155個生物學過程(P<0.05)，其中MF主要富集在轉(zhuǎn)錄因子活性，序列特異性DNA結(jié)合、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性和核酸結(jié)合；CC主要富集在細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)移酶復合物，轉(zhuǎn)移含磷基團；BP主要富集在氮化合物代謝過程的調(diào)控、RNA代謝過程的調(diào)控和細胞代謝過程的調(diào)控等過程。GO富集的部分生物學過程見圖5。KEGG分析顯示，DEGs參與了8個KEGG信號通路(P<0.05)，主要富集在萜類骨架的生物合成、果糖和甘露糖代謝和同源重組等通路(表1)。

表1 DEGs的KEGG通路分析

2.4PPI網(wǎng)絡 通過STRING在線分析軟件獲得DEGs的PPI關系，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡。結(jié)果顯示，共有1 136條邊緣數(shù)和594個hub基因(圖6)。使用插件MCODE分析出的最重要模塊含有16個hub基因和119條邊緣數(shù)(圖7)。對這16個hub基因進行GO分析和KEGG分析。GO分析結(jié)果顯示，這16個hub基因主要富集在翻譯、核糖體的結(jié)構(gòu)成分和核糖體等功能(表2)。KEGG分析結(jié)果表明，其主要富集在核糖體通路(表3)。

①：P<0.001

表2 模塊內(nèi)基因的GO富集分析

表3 模塊內(nèi)基因的KEGG通路分析

圖6 PPI網(wǎng)絡圖

圖7 PPI中MCODE分析得到的最高分子模塊

2.5RseA過表達對藥物誘導的持留菌復蘇情況的影響 分別用高濃度藥物INH、RIF、EMB、LVFX、CPFX和STRE處理細菌48 h，誘導細菌處于非復制狀態(tài)，用含有20 ng/mL RpfE蛋白的7H9促進持留菌復蘇，觀察兩組菌復蘇情況。INH、RIF、EMB、LVFX和CPFX 5種藥物處理后，MSMEG_5071過表達組復蘇指數(shù)明顯低于對照組(圖8)，差異有統(tǒng)計學意義(tINH=4.37，tRIF=7.26，tEMB=6.75，tLVF=11.13，tCPFX=8.24，tSTRE=0.02；P<0.05，PINH=0.011 966，PRIF=0.001 912，PEMB=0.002 512，PLVF=0.000 371，PCPFX=0.001 185,PSTRE=0.987)。

①P<0.05，②P<0.01，③P<0.001

3 討 論

本研究通過生物信息學分析，比較了pMV261-MSMEG_5071和含有空質(zhì)粒pMV261的恥垢分枝桿菌的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，共篩選出2 403個DEGs，其中上調(diào)基因2 335個，下調(diào)基因68個。同時，分析了這些基因的PPI關系，構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡并通過MCODE插件分析，篩選了RseA影響恥垢分枝桿菌藥物敏感性的關鍵靶向基因。其中，篩選出的前8個基因，rpsG、rplM、rpsO、rpsT、rpmH、rplS、rpsJ、rplT可能在RseA影響恥垢分枝桿菌藥物敏感性過程中具有重要作用。

rpsG編碼核糖體蛋白S7，該蛋白位于核糖體小亞基(30S)頭部，是唯一與mRNA交聯(lián)的顯著靶標，也是通過翻譯反饋機制控制核糖體蛋白合成的主要調(diào)控元件之一，對于30S亞基的組裝至關重要[14-16]。rplM編碼核糖體蛋白L13，是核糖體大亞基(50S)組裝中的必需蛋白[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，恥垢分枝桿菌MSMEG_1556(rplM)敲除株無法在42 ℃條件下生長，由此證明了MSMEG_1556(rplM)對于恥垢分枝桿菌的生長至關重要[17]。rpsO編碼核糖體蛋白S15，是位于30S亞基平臺上的唯一一級結(jié)合蛋白。S15與16S rRNA的預先結(jié)合是二級和三級核糖體蛋白(r蛋白)S6、S18、S11、S21與新興復合物結(jié)合所必需的[18]。由此證明，S15參與了亞基締合并在30S亞基組裝中發(fā)揮了重要作用[19]。rpsT編碼核糖體30S亞基蛋白S20，該蛋白直接與16S rRNA結(jié)合，并獨立于其他蛋白，被定義為一級結(jié)合蛋白，由此表明S20在30S亞基的組裝中起著關鍵作用[20]。并有研究表明，缺乏S20的菌株生長速度明顯降低[21]。rpmH編碼核糖體大亞基蛋白L34，L34的缺乏會導致70S核糖體形成的嚴重缺陷和生長速率的降低[22]。rplS編碼核糖體50S蛋白L19，L19可以抵御抗體，并且與氯霉素的結(jié)合有關[23]。rpsJ編碼核糖體30S亞基蛋白S10，有實驗表明，該蛋白是參與轉(zhuǎn)錄抗終止作用的細胞成分之一[24]。rplT編碼核糖體50S蛋白L20，參與50S亞基的早期組裝步驟以及自身基因表達的反饋控制[25]。

PPI網(wǎng)絡模塊分析顯示，RseA過表達導致多種核糖體蛋白異常表達，核糖體的結(jié)構(gòu)蛋白合成和翻譯通路富集。核糖體是核糖核蛋白復合物，由具有21個蛋白和16S rRNA的小亞基(30S)以及具有36個蛋白，23S rRNA和5S rRNA的大亞基(50S)組成，已成功被多種抗生素所靶向[26]。核糖體執(zhí)行蛋白質(zhì)生物合成的關鍵功能，主要分為翻譯起始、延伸、終止和再循環(huán)4個階段，而翻譯是適應某些環(huán)境條件(例如饑餓，物理或化學壓力，尤其是休眠)的主要監(jiān)管目標[27]。因此，推測RseA過表達后，主要通過涉及核糖體的翻譯過程影響恥垢分枝桿菌對環(huán)境的適應能力，從而影響恥垢分枝桿菌的藥物敏感性。

我們采用復蘇指數(shù)來衡量持留菌的數(shù)量多少。使用高濃度藥物INH、RIF、EMB、LVFX、CPFX和STRE處理細菌，使其處于非復制的持留狀態(tài)，通過復蘇促進因子(RpfE)復蘇后，計數(shù)最大可能數(shù)MPN，即包括持留菌在內(nèi)的所有活菌；同時計數(shù)未通過RpfE處理的菌落CFU，即不包含持留菌的活菌，兩者之差即為復蘇指數(shù)RI，以此來反應持留菌的多少。實驗結(jié)果觀察到，INH、RIF、EMB、LVFX、CPFX藥物作用后，RseA過表達組的復蘇指數(shù)明顯低于對照組，即RseA過表達可能導致持留菌減少；STRE作用后，RseA過表達組與對照組無差異。而STRE是一種氨基糖苷類抗生素，通過靶向核糖體，引起遺傳基因誤讀干擾翻譯啟動，抑制細菌蛋白質(zhì)合成，從而殺滅細菌或抑制細菌生長[28]。由此可見，過表達RseA可能影響了核糖體通路，從而影響恥垢分枝桿菌對藥物的敏感性。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)RseA在恥垢分枝桿菌藥物敏感性的影響中發(fā)揮了重要作用，為RseA以后在結(jié)核分枝桿菌的治療應用提供了新的思路，后續(xù)將開展大量的基礎研究對此結(jié)果進行進一步的驗證。

利益沖突：無