王 悅，孫 穎，孫炳奇

結(jié)核病(TB)位居全球單一致死性傳染病的首位(排在HIV/AIDS之前)，每年約有50萬利福平耐藥病例，其中78%為耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)。我國是全球耐藥結(jié)核病負(fù)擔(dān)最大的3個(gè)國家之一。異煙肼(INH)和利福平(RIF)的廣泛使用及菌體基因突變加劇了耐藥性的發(fā)生[1-3]。實(shí)際工作中，由于傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)方法費(fèi)時(shí)、繁瑣，無法滿足快速臨床診斷的要求[4-5]。目前，許多快捷高效的分子技術(shù)已成功應(yīng)用于MTB檢測(cè)，包括實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、線性探針耐藥檢測(cè)分析(LPAs)和寡核苷酸或DNA微陣列等。

DNA微陣列技術(shù)(基因芯片耐藥基因檢測(cè)技術(shù))是指在rpoB、inhA和katG基因的特定位置結(jié)合特異性核苷酸，檢測(cè)痰標(biāo)本中MTB對(duì)于利福平和異煙肼的耐藥情況。

本研究以MGIT 960藥敏試驗(yàn)為參考標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證芯片法對(duì)MDR-TB的檢測(cè)能力。對(duì)于芯片法與液體藥敏檢測(cè)不一致的結(jié)果，采用WHO推薦的線性探針耐藥檢測(cè)法進(jìn)行復(fù)核，以期客觀的探討芯片法對(duì)培陽結(jié)核病患者的耐藥性的檢測(cè)能力。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1研究對(duì)象 收集沈陽市第十人民醫(yī)院2019年7至12月間，389名疑似肺結(jié)核患者的合格痰樣，排除標(biāo)準(zhǔn)為治療超過兩周的患者。年齡分布為2～90歲，男性入組280人(72.0%)，女性入組109人(28.0%)。本課題已通過沈陽市第十人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要儀器及試劑 晶芯○R微陣列芯片掃描儀LuxScanTM10K-B，Extractor 36 核酸快速提取儀，HybSet基因微陣列芯片雜交盒，結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)試劑盒，北京博奧晶典生物集團(tuán)有限公司；MGIT960全自動(dòng)結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)法儀及配套試劑，美國BD公司；全自動(dòng)核酸印記微生物檢測(cè)系統(tǒng)(GT-Blot48)及配套試劑，法國生物梅里埃。

1.2主要方法及工作流程 見圖1。

1.2.1痰標(biāo)本前處理 流程按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]規(guī)定進(jìn)行，培養(yǎng)法后剩余痰處理液留作芯片法檢測(cè)及備用。

1.2.2培養(yǎng)法 按照BACTEC MGIT960系統(tǒng)操作說明書進(jìn)行操作。儀器報(bào)陽后對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行抗酸染色鏡檢確認(rèn)，鏡下抗酸桿菌扭曲纏繞呈紅色繩索狀，而其他細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。確認(rèn)為抗酸桿菌后進(jìn)行MPB64抗原檢測(cè)，陽性者進(jìn)入培養(yǎng)法藥敏試驗(yàn)(培養(yǎng)管中的藥物終濃度為利福平1.0 μg/mL,異煙肼0.1 μg/mL)。

1.2.3芯片法 對(duì)于培養(yǎng)陽性標(biāo)本，取出留存的痰處理液，進(jìn)行芯片法耐藥檢測(cè)。檢測(cè)耐藥位點(diǎn)包括利福平耐藥相關(guān)基因rpoB基因檢測(cè)6個(gè)位點(diǎn)，即531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位 CAA→AAA、516位 GAC→GTC、516位 GAC→TAC、516位GAC→GGC及533位CTG→CCG等13種突變型，對(duì)于異煙肼耐藥相關(guān)基因katG基因及inhA基因啟動(dòng)子各檢測(cè)1個(gè)位點(diǎn)，分別為katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC 2個(gè)突變型，inhA基因啟動(dòng)子-15位C→T突變型。按照北京博奧生物集團(tuán)有限公司的試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取，PCR擴(kuò)增，芯片雜交及結(jié)果判讀過程，對(duì)于“無法判定”的結(jié)果及時(shí)進(jìn)行復(fù)檢，以確定是否有可用的耐藥結(jié)果。

1.2.4線性探針耐藥檢測(cè)法 原理基于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過反向雜交技術(shù)與預(yù)先固化在試紙條上的特異性探針雜交，通過條帶顯色情況判定耐藥性。檢測(cè)耐藥基因?yàn)閞poB是利福平耐藥、katG是異煙肼高水平耐藥和inhA是異煙肼低水平耐藥，在雜交帶上3個(gè)基因的野生型和突變型均可以體現(xiàn)。標(biāo)本處理按照法國生物梅里埃有限公司的試劑盒說明書進(jìn)行，包括DNA提取、擴(kuò)增、雜交、制備流程。判讀標(biāo)準(zhǔn)為野生條帶(利福平8個(gè)野生探針，異煙肼katG和inhA野生探針分別為1個(gè)和2個(gè))均顯色且突變條帶無顯色時(shí)為敏感，野生條帶有缺失或突變條帶顯色為耐藥。

圖1 主要方法及工作流程圖

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有檢測(cè)結(jié)果、患者基本信息采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算芯片法耐藥檢測(cè)的靈敏度、特異度、一致性、陽性預(yù)測(cè)值(PPV)、陰性預(yù)測(cè)值(NPV)和Kappa值以及2種方法對(duì)于檢測(cè)MDR-TB結(jié)果的比對(duì)，并對(duì)結(jié)果不一致者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)說明。

相關(guān)公式解釋：靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致性=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；Kappa值≥0.75兩者一致性較好；0.4≤Kappa<0.75兩者一致性一般；Kappa<0.4兩者一致性較差。

2 結(jié) 果

2.1培養(yǎng)法結(jié)果 對(duì)389例疑似肺結(jié)核患者的痰樣本進(jìn)行培養(yǎng)，334例為培養(yǎng)陽性，其中40～60歲年齡段的患者的陽性率最高90.2%(157例)；男性患者陽性檢出率88.6%(248例)高于女性78.9%(86例)；初治患者陽性檢出率86.9%(232例)高于復(fù)治患者為83.6%(102例)，見表1。

2.2藥敏結(jié)果 334例培陽標(biāo)本中，2例為MPB64抗原檢測(cè)陰性，所以有332例進(jìn)行了MGIT 960藥敏試驗(yàn)；同時(shí)挑出培陽患者的痰處理液，用芯片法檢出共323例有藥敏結(jié)果，此外檢出非結(jié)核分枝桿菌2例，這與MPB64的陰性檢測(cè)結(jié)果相符，另有9例無結(jié)果(未檢出MTB)，這可能是分子法檢出限的劣勢(shì)所致。與參考標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比，芯片法檢測(cè)RIF和INH的Kappa值均大于0.75，顯示了較好的一致性；芯片法除了異煙肼的靈敏度稍低(82.6%)外，其他方面的參數(shù)均較好，見表2。這個(gè)結(jié)論和大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致。

表1 389例患者特征和培養(yǎng)法對(duì)抗酸桿菌陽性的檢出情況

表2 芯片法檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥與培養(yǎng)法藥敏結(jié)果的比較

2.3芯片法檢測(cè)MDR-TB的能力評(píng)價(jià) 根據(jù)治療史的不同，我們將患者分為初治和復(fù)治。與參考標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比，芯片法檢測(cè)MDR-TB 的靈敏度、特異度、一致性和Kappa值見表3。在MDR-TB的病人中，應(yīng)用芯片法檢測(cè)的Kappa值可以達(dá)到0.86，與液體法藥敏試驗(yàn)有較好的一致性；并且在初治患者中Kappa值為0.95，靈敏度為95.5%，明顯優(yōu)于復(fù)治患者，這對(duì)于更早的指導(dǎo)臨床參考用藥有著非常重要的意義。

表3 芯片法對(duì)不同治療史樣本患者M(jìn)DR-TB結(jié)果的判定

2.4不一致的耐藥結(jié)果 本研究中“不一致”的含義為芯片法對(duì)利福平和異煙肼相關(guān)耐藥基因檢測(cè)結(jié)果與MGIT 960藥敏結(jié)果不符。總體上看，利福平耐藥結(jié)果不符者有11例(表4)，其中線性探針法有7例與MGIT 960藥敏法一致，4例與芯片法一致；在異煙肼耐藥結(jié)果的17例(表5)不一致中,線性探針法有9例與參考標(biāo)準(zhǔn)一致，有8例與芯片法一致。

表4 3種檢測(cè)方法對(duì)利福平耐藥不一致結(jié)果的對(duì)比分析

表5 3種檢測(cè)方法對(duì)異煙肼耐藥不一致結(jié)果的對(duì)比分析

3 討 論

本研究顯示，芯片法比培養(yǎng)法藥敏試驗(yàn)更快速并且具有較好的準(zhǔn)確性[7]，與參考標(biāo)準(zhǔn)比較，對(duì)MTB耐藥檢測(cè)及MDR-TB檢測(cè)的靈敏度、特異度、符合率、PPV、NPV和Kappa值與相關(guān)報(bào)道的結(jié)果相似，即芯片法靈敏度中等，但是特異度較高[8-10]。

分類A中，有5例利福平和14例異煙肼耐藥結(jié)果為芯片法敏感而MGIT 960藥敏法耐藥。其原因可能是分子法的檢測(cè)限一般在20%左右，而表型法的檢測(cè)限可達(dá)到1%[11]；分子法檢測(cè)的耐藥突變位點(diǎn)有限，不能覆蓋所有耐藥突變的位點(diǎn)；除了位點(diǎn)突變還存在其他耐藥機(jī)制，如外排泵[12-13]，這也是分子檢測(cè)不能及的。上述情況也可能是導(dǎo)致芯片法在檢測(cè)9例培陽痰液時(shí)出現(xiàn)未檢出MTB的原因。在A分類中，線性探針共有12例與MGIT 960藥敏法一致，可能是由于耐藥檢測(cè)范圍大于芯片法所致，如芯片法僅檢測(cè)了rpoB基因核心突變區(qū)的6個(gè)位點(diǎn)的13種突變類型，而線性探針技術(shù)則通過8條分子探針覆蓋了rpoB基因核心突變區(qū)的全部27個(gè)氨基酸的81個(gè)堿基[14]；線性探針含有katG315(AGC→ACA)、inhA-16(T→G)、inhA-8(T→C)和inhA-8(T→A)突變類型，而芯片只在katG和inhA基因啟動(dòng)子各測(cè)一個(gè)位點(diǎn)[15-16]。但是我們是對(duì)不一致的樣本進(jìn)行線性探針的檢測(cè)，所以不能以與參考標(biāo)準(zhǔn)一致結(jié)果數(shù)量多而斷定線性探針法的檢測(cè)結(jié)果更接近于參考標(biāo)準(zhǔn)；其次芯片法的自動(dòng)判讀更大程度的避免的人工判讀的誤差的產(chǎn)生；此外芯片法的封閉式雜交流程更大程度的避免了非特異片段的干擾和交叉污染的產(chǎn)生，降低了假陽性的出現(xiàn)。

分類B中，有6例利福平和3例異煙肼耐藥結(jié)果為芯片法耐藥而MGIT 960藥敏法敏感，這可能的原因是與體外培養(yǎng)可能導(dǎo)致耐藥菌亞群比例下降，低于其檢測(cè)靈敏度有關(guān)[17]。也有可能與MGIT360藥敏法的利福平終濃度設(shè)置過高有關(guān)。

總之，實(shí)驗(yàn)室污染、多重感染、菌株的低水平耐藥、耐藥和敏感菌落亞群比例不同或異質(zhì)性耐藥存在都可能導(dǎo)致基因型和表型或是兩種分子法結(jié)果的不一致，異質(zhì)性耐藥被認(rèn)為是造成表型與基因型耐藥結(jié)果不符的重要原因[18]。目前，二代測(cè)序技術(shù)、分子克隆與數(shù)字PCR技術(shù)在臨床和科研方面也廣泛應(yīng)用，本研究中的結(jié)果不一致者(包括疑似異質(zhì)性耐藥)可以通過上述技術(shù)在未來的研究中進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

中國是耐藥高負(fù)擔(dān)國家，有效控制和降低MDR-TB總體負(fù)擔(dān)迫在眉睫，而WHO推薦的耐藥診斷產(chǎn)品多為進(jìn)口，存在價(jià)格昂貴和戰(zhàn)略安全的風(fēng)險(xiǎn)。近年來在我國傳染病重大專項(xiàng)的支持下，國內(nèi)的耐藥結(jié)核病診斷技術(shù)研發(fā)取得了顯著進(jìn)展，本研究對(duì)國產(chǎn)耐藥檢測(cè)產(chǎn)品的臨床應(yīng)用提供了相關(guān)資料的支持。雖然無法取代表型藥敏技術(shù)，但是芯片法其快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，仍適用于結(jié)核病耐藥初篩，MDR結(jié)核病患者可以通過適當(dāng)?shù)亩€藥物快速治療，取得更好的療效，考慮到成本、技術(shù)專利等問題，國產(chǎn)芯片產(chǎn)品更便于基層臨床醫(yī)院的推廣。

利益沖突：無