趙東陽，王少華，蘇茹月，鄭丹薇，朱巖坤，馬曉光，石 潔，李 輝，孫定勇

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria bacteria，NTM)是指分枝桿菌屬內(nèi)除結(jié)核分枝桿菌復合群的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis，MTB)、牛分枝桿菌(M.bovis)、非洲分枝桿菌(M.africanum)和田鼠分枝桿菌(M.mictoti)以及麻風分枝桿菌(M.leprae)等以外的其他分枝桿菌。NTM普遍存在于環(huán)境中的土壤和水中，隨著社會發(fā)展，從城市供水系統(tǒng)和飲用水系統(tǒng)也可分離到NTM[1-2]。NTM是機會致病菌，可以引起肺部或其他器官感染，肺部感染后臨床表現(xiàn)與肺結(jié)核相似，常被誤診為肺結(jié)核病。大部分NTM菌株天然耐藥，對一線二線抗結(jié)核藥物普遍耐藥，導致NTM感染后治療效果不好，并且增加病人的負擔[3-4]。本研究中，對河南省耐藥監(jiān)測過程中收集的分枝桿菌陽性培養(yǎng)物進行了NTM分離鑒定及藥物敏感試驗，以期了解南陽市轄區(qū)、中牟縣、新密市、嵩縣和扶溝縣5個監(jiān)測點的NTM分布情況、流行現(xiàn)狀及其耐藥性。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2013年1月至2018年12月來自河南省5個耐藥監(jiān)測點結(jié)核病定點醫(yī)院結(jié)核病患者痰分枝桿菌培養(yǎng)陽性標本1 811例，其中南陽市轄區(qū)493例、新密市406例、中牟縣452例、扶溝縣225例、嵩縣235例，剔除30例信息不完整的病例，共1 781例納入分析。

1.2NTM初步鑒定和藥敏試驗 采用傳統(tǒng)的對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)法對分枝桿菌陽性培養(yǎng)物進行初篩及鑒定，若該菌在PNB鑒別培養(yǎng)基上能生長，則初步判定為NTM。采用傳統(tǒng)固體比例法檢測菌株藥物敏感性：接種環(huán)刮取一環(huán)菌株對數(shù)生長期培養(yǎng)物，細菌超聲分散計數(shù)儀(BACspreaderTM1100，體必康)超聲分散，用生理鹽水配制成1.0麥氏濃度菌液，稀釋成10-2和10-4CFU/mL菌液，取0.01 mL各稀釋菌液接種于不同含藥培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)4～8周觀察結(jié)果[5]。含藥培養(yǎng)基購自河南賽諾特生物技術(shù)有限公司，藥物濃度分別為PNB 500 μg/mL、TCH 5 μg/mL、異煙肼(INH)0.2 μg/mL、利福平(RFP)40 μg/mL、乙胺丁醇(EMB)2 μg/mL、鏈霉素(SM)4 μg/mL、卡那霉素(KM)30 μg/mL、氧氟沙星(OFX)4 μg/mL、卷曲霉素(CPM)40μg/mL、丙硫異煙胺(PTO)40 μg/mL、對氨基水楊酸(PAS)1 μg/mL。

1.3細菌基因組DNA提取 參考張婷等[6]的方法，略作改動：刮取NTM菌落懸于超純水中，95 ℃金屬浴裂解20 min，室溫冷卻后12 000 r/min離心10 min(4℃)，取上清作為模板。

1.4探針熔解曲線法試驗 采用探針熔解曲線法分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(廈門致善)對初篩判定為NTM菌株進行菌種鑒定。該試劑盒可用于臨床和環(huán)境中常見的19種分枝桿菌的定性鑒定[7]：結(jié)核分枝桿菌(復合群)、恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、龜分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、海分枝桿菌或潰瘍分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌。具體操作參照試劑盒說明書進行。

1.5PCR測序 16S rRNA基因擴增上游引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物序列：5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司(Sangon)合成。PCR反應體系為50 μL：PCR預混液(2×Mix購自康為世紀公司)25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板5 μL，無菌去離子水16 μL。反應條件：預變性94 ℃ 10 min；然后94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s共計25個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。同時擴增H37Rv作為對照。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。由Sangon公司測序，并將基因序列提交美國國立生物技術(shù)信息中心(national centerfor biotechnology information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性分析比對。菌株判定及16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建參照文獻[8]進行。

1.6統(tǒng)計學分析 使用SPSS19.0軟件，采用χ2檢驗進行比較分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1NTM菌株鑒定結(jié)果 1 781例分枝桿菌陽性培養(yǎng)物中，67例在PNB和TCH鑒別培養(yǎng)基上均有分枝桿菌生長，初步判定為NTM。67株菌株經(jīng)探針熔解曲線法和測序鑒定，有2株為結(jié)核分枝桿菌。65例NTM中，胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)49例(75.4%)，堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)5例(7.7%)，膿腫分枝桿菌(M.abscessus)3例(4.6%)，鳥分枝桿菌(M.avium)2例(3.1%)，敗血癥分枝桿菌(M.septicum)(1.5%)，結(jié)核分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌混合感染5例(7.7%)，見表1。NTM菌株16S rRNA的PCR擴增產(chǎn)物長度約900 bp，目的條帶單一，具有較好的擴增效果，圖1。NTM菌株與從GenBank下載的5株相應標準菌株或代表株的16SrRNA序列構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹，菌株均得到良好區(qū)分，見圖2。

表1 65例NTM臨床標本鑒定結(jié)果

M為DL2000；1-8為臨床菌株；9為陽性對照H37Rv；10為陰性對照

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2NTM感染率及變化趨勢 2013-2018年分枝桿菌標本中NTM感染率分別為2.0%、3.3%、3.6%、4.4%、5.1%、4.9%，呈逐年上升的趨勢(χ2=5.647，P<0.05)，各年之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=6.043，P>0.05)，見圖3。南陽市轄區(qū)、新密市、中牟縣、扶溝縣和嵩縣5個檢測點NTM感染率分別為5.2%、2.7%、4.3%、1.9%、4.5%，見圖4，各地之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=6.043，P>0.05)。

圖3 2013-2018年NTM感染率

圖4 五地區(qū)NTM感染率

2.3NTM感染患者性別、年齡和初復治分布 1 781例病人中，男性感染率為3.8%(53/1 388)，女性感染率為3.1%(12/393)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.510，P>0.05)。年齡范圍16～95歲，50歲以下患者感染率為2.3%(20/840)，50歲以上的患者感染率為4.8%(45/941)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.303，P<0.01)。初治病人感染率為2.2%(24/1 097)，復治病人感染率為6.0%(41/684)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=17.359，P<0.01)，見表2。

2.4NTM藥敏試驗結(jié)果 NTM對9種抗結(jié)核藥物均具有較高的耐藥率，見表3。65株NTM中耐多藥菌株和廣泛耐藥菌株分別達到95.4%(62/65)、89.2%(58/65)。

表2 NTM感染患者性別、年齡和初復治分布

表3 65例NTM菌株對抗結(jié)核藥物耐藥率

3 討 論

已經(jīng)報道的NTM已經(jīng)超過190種，新種仍在不斷被鑒定發(fā)現(xiàn)[9]。本研究經(jīng)PNB/TCH初篩生長實驗鑒別為NTM的67株菌株，經(jīng)探針熔解曲線法鑒定發(fā)現(xiàn)2例為結(jié)核分枝桿菌，表明PNB/TCH鑒定存在假陽性，還需要通過分子生物學方法鑒定分離的NTM。探針溶解曲線法[6]能夠鑒定常見的NTM，并且可以發(fā)現(xiàn)混合感染，操作簡單，不足的是對不常見菌株仍要進行測序鑒定。65例NTM感染病例中，胞內(nèi)分枝桿菌占比75.4%，其它占比24.6%，胞內(nèi)分枝桿菌是耐藥監(jiān)測地區(qū)的優(yōu)勢感染菌株。研究報道甘肅[10]、浙江[11]、云南[12]、沈陽[13]等地的NTM優(yōu)勢感染菌均為胞內(nèi)分枝桿菌，比例分別為67.92%、52.15%、44.83%、38.9%，低于耐藥監(jiān)測地區(qū)。而上海[14]和重慶[15]NTM感染則以堪薩斯結(jié)核分枝桿菌、膿腫分枝桿菌為主，占比分別為45.0%和39.54%。這表明不同地區(qū)的NTM優(yōu)勢流行菌群不一樣，NTM流行菌種和比例差異可能與當?shù)刈匀粴夂驐l件等因素相關(guān)。

目前國際上關(guān)于NTM感染情況的報道逐漸增多，感染率逐步升高[16-18]。我國歷次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，NTM感染率呈上升趨勢，2010年進行的第5次全國結(jié)核病流行病學調(diào)查NTM的感染率達到了22.9%[19-20]。本研究從2013年到2018年河南省5個耐藥檢測點1 781例患者痰標本分枝桿菌陽性培養(yǎng)物中，鑒定出60例單一NTM感染和5例混合感染，總感染率為3.6%(65/1 781)。NTM總感染率遠低于第5次流行病學調(diào)查結(jié)果的22.9%，也低于杭州地區(qū)的21.4%[21]、福建的30.19%[22]；高于沈陽的1.87%[13]、天津的1.84%[23]、湖北的2.21%[24]。NTM的感染率從2.0%上升到5.0%左右，差異無統(tǒng)計學意義。杭州[21]、沈陽[13]的研究結(jié)果顯示NTM的感染率呈上升趨勢，而天津[23]和湖北[24]的研究結(jié)果表明NTM感染率無明顯增高趨勢。5個監(jiān)測點中南陽市轄區(qū)感染率最高為5.2%，扶溝縣最低為1.9%，感染率也各不相同。這表明NTM的感染率隨著地域變化而變化，部分流行地區(qū)比例呈逐步上升趨勢。

本研究中1 781例病人中，年齡為50歲以上的患者感染率高于50歲以下人群，云南[12]、杭州[21]等地NTM感染者也是年齡50歲以上占優(yōu)勢。這表明隨著年齡增高，免疫水平降低，更容易被感染。本研究中復治病人感染率為6.0%，高于初治病人，與Xu等[25]的報道一致，表明患過結(jié)核病的病人更容易受到NTM的感染。

對分離的NTM進行了9種一線、二線抗結(jié)核藥藥物敏感性實驗。結(jié)果表明，65例NTM對INH的耐藥率為100%，對RFP、SM、OFX、CPM、PAS的耐藥率超過了80%；耐多藥率達到95.4%，廣泛耐藥率達到89.2%。NTM菌株對抗結(jié)核藥物表現(xiàn)了普遍耐藥性，與以前的報道結(jié)果基本一致[10,13,15]。NTM與結(jié)核分枝桿菌雙重感染表現(xiàn)出與NTM單獨感染相似的耐藥表型[25]，本研究中5例混合感染藥敏結(jié)果全為廣泛耐藥，容易造成病人的誤診誤治。因此，臨床上遇到NTM感染病例首先需要進行菌種鑒定，然后再進行藥物敏感性實驗，以確定適當?shù)闹委煼桨浮?/p>

本研究尚存在一些不足之處，比如取樣點數(shù)目少，局限于5個縣區(qū)，需要擴大納入范圍，才能全面的反映河南省NTM流行情況；由于病人追蹤隨訪困難，研究僅鑒定了NTM感染菌株類型，不能確定患者感染NTM后發(fā)病與否，因此這些問題都需要更深入的研究。

綜上，河南耐藥監(jiān)測地區(qū)近年流行的NTM菌種以胞內(nèi)分枝桿菌為主。NTM感染者中男性多于女性，復治患者多于初治患者，中老年人易感。NTM臨床菌株對常用抗結(jié)核藥物普遍耐藥，臨床上需要提高對非結(jié)核分枝桿菌病的認識，結(jié)合實驗室診斷，及時調(diào)整病人的治療方案。

利益沖突：無