陳廣鳳，李冬梅，鄧志英，馮建英，鄭世英，鄭 芳，吳秀芬，田紀(jì)春?

（1.德州學(xué)院 生態(tài)與資源環(huán)境學(xué)院，山東 德州 253000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，小麥品質(zhì)育種研究室，作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018）

小麥種質(zhì)資源是小麥育種的主要親本來(lái)源，是培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高抗小麥新品種的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平進(jìn)一步提高，健康和營(yíng)養(yǎng)已成為近十年我國(guó)小麥品質(zhì)研究的主題，培育特色功能性小麥新品種是小麥育種專家近幾年來(lái)的重要育種目標(biāo)。

目前，微量營(yíng)養(yǎng)元素鐵、鋅等缺乏造成的營(yíng)養(yǎng)不良非常嚴(yán)重。全世界約20億人患有不同程度的貧血，其中約12%由缺鐵所致，我國(guó)的缺鐵性貧血發(fā)病率為20%左右，貧困地區(qū)兒童和孕婦則高達(dá)45%和35%[1]。小麥?zhǔn)俏覈?guó)北方地區(qū)的主要糧食作物，提高人體對(duì)小麥籽粒中礦物質(zhì)元素鐵、鋅等的吸收利用，對(duì)于解決我國(guó)人民由于鐵、鋅等元素含量攝入不足造成的健康問(wèn)題具有重要意義[2-3]。影響鐵、鋅等生物有效性的限制性因子包括植酸、纖維素、丹寧和重金屬等，以植酸最為重要[4-5]。小麥籽粒中植酸含量較為豐富，并且通過(guò)與礦物質(zhì)元素鐵、鋅等正二價(jià)金屬離子結(jié)合，形成螯合態(tài)植酸鹽，顯著降低人體對(duì)鐵、鋅等的吸收利用[6-7]。小麥種質(zhì)資源是選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高抗小麥新品種的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，小麥籽粒中植酸含量較為豐富，品種間籽粒植酸含量存在顯著差異[8-9]，并且含量受遺傳因素和環(huán)境條件的共同作用[10]。因此，對(duì)小麥種質(zhì)資源的深入研究，不僅能提高所選用育種材料的目標(biāo)性，而且有利于提高育種科學(xué)預(yù)見(jiàn)性。自1921年Mellanby首次提出植酸對(duì)營(yíng)養(yǎng)的影響以來(lái)，植酸與營(yíng)養(yǎng)的關(guān)系一直是植酸研究的熱點(diǎn)[11]。對(duì)其研究主要集中在低植酸玉米、大麥和水稻的研究，以期培育兼具營(yíng)養(yǎng)和環(huán)保功能的新型低植酸作物[12-13]。李穎睿等[10]、吳澎等[14]和Liu等[8]曾對(duì)我國(guó)的地方品種和河南、山東、陜西、江蘇和四川等少數(shù)地區(qū)的小麥品種進(jìn)行了植酸含量分析。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)小麥中植酸的研究主要側(cè)重于植酸對(duì)小麥生理功能的影響、植酸的抗?fàn)I養(yǎng)效應(yīng)、植酸對(duì)人和動(dòng)物的影響和植酸的工業(yè)應(yīng)用等方面[13]。

到目前為止，在遺傳方面，關(guān)于小麥籽粒植酸含量的報(bào)導(dǎo)較少。何秋怡等[15]利用重組自交系群體定位到2個(gè)與植酸含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)，分布在3B和3D染色體上。凡迪等[16]利用小麥重組自交系群體定位到 6個(gè)與籽粒植酸含量相關(guān)的位點(diǎn)，分布于 1B、2A、2B 和 6B 染色體上。總體來(lái)說(shuō)，有關(guān)植酸含量分析的資料十分有限，中國(guó)冬麥區(qū)主要品種（系）的植酸含量尚不清楚。

本研究以中國(guó)冬麥區(qū)共 205份（包括 20世紀(jì)80年代以來(lái)的推廣品種或骨干親本 132 和高代品系73份）小麥種質(zhì)資源為研究材料，測(cè)定其植酸含量進(jìn)行聚類分析，并定位解析其單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，篩選出低植酸和高植酸種質(zhì)資源，為中國(guó)冬麥區(qū)低值酸小麥品質(zhì)育種提供優(yōu)良的育種材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

205份供試材料，包括中國(guó)冬麥區(qū)20世紀(jì)80年代以來(lái)的推廣品種或骨干親本132份和高代品系73份，其中高代品系全部來(lái)自中國(guó)山東省。于2016和2017年度將供試材料種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，每份材料種3行，2次重復(fù)，行長(zhǎng)2 m，均勻播種70粒，行間距25 cm。常規(guī)田間管理，生長(zhǎng)期間沒(méi)有發(fā)生嚴(yán)重病蟲(chóng)害和倒伏。

高通量組織研磨機(jī)，SPEX GENO 2010 GRINDER：美國(guó)SPEX Sample Prep公司；酶標(biāo)儀，SPECTRA max PLUS384：北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 表型鑒定

種子收獲后，曬干儲(chǔ)存于種子庫(kù)中。試驗(yàn)時(shí)取每個(gè)小區(qū)的種子分別測(cè)定。用高通量組織研磨機(jī)磨粉。按 Chen等[17]的方法測(cè)定植酸含量，并適當(dāng)改進(jìn)。將30 mg全粉置于1.5 mL離心管中，加入0.4 mol/L HCl 1 mL和15%的TCA提取液，室溫下振蕩3 h，再以2 000×g離心10 min，然后取 50 μL上清液，置于 1.5 mL離心管中（內(nèi)裝36.3 mmol/L NaOH 550 μL）；加入 200 μL 顯色液（含0.03%氯化鐵，0.3%磺基水楊酸），反應(yīng)后取200 μL溶液，用酶標(biāo)儀在500 nm下讀數(shù)，測(cè)定植酸含量。

1.2.2 DNA提取和全基因組90k SNP芯片分型

參照略有改動(dòng)的 Triticarte Pty.Ltd（http://www.triticarte.com.au/）方法提取供試材料群體DNA，用0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度。委托美國(guó)加利弗尼亞大學(xué)戴維斯分校植物科學(xué)系生物技術(shù)檢測(cè)中心，使用美國(guó) Illumina公司和美國(guó)堪薩斯州立大學(xué)共同開(kāi)發(fā)的小麥90k基因芯片（81 587個(gè)SNP）進(jìn)行供試群體DNA的基因分型，利用 GenomeStudio 軟件讀取分型數(shù)據(jù)并以文本文件形式導(dǎo)出保存。用PLINK v1.07對(duì)獲得的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，剔除檢出率小于80%和低頻基因頻率小于 5%的 SNP標(biāo)記，最終獲得24 355個(gè)SNP用于植酸含量關(guān)聯(lián)分析。

利用 Wang等[18]對(duì) 6個(gè) DH遺傳群體（BTSchomburgk AUS33384、Young AUS33414、Chara Glenlea、W7984×Opata M85、Sundor AUS30604和Westonia Kauz）進(jìn)行圖譜整合的位點(diǎn)信息，獲得本研究群體 SNP 位點(diǎn)遺傳信息（表 1）及整合復(fù)合遺傳圖譜[19]。

1.2.3 性狀和標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

應(yīng)用TASSEL 3.0軟件（http://www.maizegenetics.net/）中的MLM（mixed linear model）進(jìn)行性狀和標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)分析。利用Structure 2.3.1軟件計(jì)算Q值，用TASSEL 3.0軟件計(jì)算Kinship值，對(duì)群體結(jié)構(gòu)和基因型過(guò)濾后，運(yùn)行 MLM_Q+K模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，當(dāng)標(biāo)記的P≤0.001時(shí)認(rèn)為標(biāo)記與性狀存在關(guān)聯(lián)。

1.3 表型數(shù)據(jù)處理

采用 SAS（Statistical Analysis System）8.0 軟件，將植酸含量數(shù)據(jù)分別按年度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，以歐氏距離為標(biāo)準(zhǔn)，按 Ward 類平方和法分別對(duì)品種進(jìn)行聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 205份種質(zhì)資源小麥的植酸含量

兩個(gè)種植年度環(huán)境植酸含量均值分別為4.99 g/kg和3.31 g/kg，變幅分別為17.90 g/kg和10.20 g/kg。結(jié)果表明，供試群體植酸含量變異范圍較大，偏度和峰度絕對(duì)值接近 1，近似符合正態(tài)分布，表明植酸含量屬于數(shù)量性狀，通過(guò)品種篩選降低籽粒植酸含量的潛力較大（表2）。

表2 供試群體小麥面粉植酸含量表型變異Table 2 Phenotypic variations of Phytic acid content in the wheat population

2.2 聚類分析

將供試群體所有品種的植酸含量數(shù)據(jù)按年度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，在決定系數(shù)（R2）為 85%水平將供試群體聚為6類（表3）。6類間植酸含量差異均達(dá)到極顯著水平。其中，第2和第3類的品種數(shù)量較少（分別包括3個(gè)和2個(gè)品種），其次是第1類（包括15個(gè)品種）、第5類和第6類（分別包括24個(gè)和37個(gè)品種），第4類品種數(shù)量最多（包括124個(gè)品種）。第3類品種的平均植酸含量最高，為18.35 g/kg，其次是第2、1、5和6類，分別是15.35 g/kg、12.71 g/kg、8.10 g/kg 和 6.19 g/kg。第4類品種的平均植酸含量最低，為2.34 g/kg，顯著低于其他5類。73個(gè)高代育種品系，除第2和3類沒(méi)有分布之外，其它各類中都有均勻分布。

表3 205份小麥種質(zhì)資源植酸含量聚類分析Table 3 Cluster of 205 cultivars based on Phytic acid content

第4類品種數(shù)量最多，包括124個(gè)品種，占群體百分比為60.49%，且平均植酸含量最低，為2.34 g/kg，表明該種質(zhì)群體絕大多數(shù)品種植酸含量較低。并且第四類品種（系）變幅較小，在低植酸含量育種中具有較高的利用價(jià)值。其中，132個(gè)推廣品種或骨干親本中，B54、B40、B86和B126植酸含量最低，有可能成為重要的育種親本，在低植酸含量小麥品質(zhì)育種中發(fā)揮作用。高代品系 B131、B141、B181和 B149植酸含量最低，結(jié)合品系優(yōu)異性狀，有可能選育出低值酸含量功能性小麥新品種。

2.3 植酸含量全基因組關(guān)聯(lián)位點(diǎn)

兩個(gè)種植年度環(huán)境，共檢測(cè)到36個(gè)與面粉植酸含量相關(guān)聯(lián)的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)（P＜0.001），分布在2B、3A、3B、3D、6A和 6B染色體上，單個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)表型變異貢獻(xiàn)率為 5.73%～9.69%（表4，圖1）。通過(guò)TASSELV3.0 軟件分析，獲得2個(gè)環(huán)境下面粉植酸含量全基因組關(guān)聯(lián)分析的QQ圖（圖2），關(guān)聯(lián)群體的群體結(jié)構(gòu)得到了較好控制。E1環(huán)境檢測(cè)到24個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，其中，22個(gè)位點(diǎn)集中在3A染色體 85-91區(qū)段內(nèi)，說(shuō)明這個(gè)此區(qū)段內(nèi)可能存在控制小麥面粉植酸含量的重要基因。另外兩個(gè)位點(diǎn)分別分布在染色體3B和3D上，3D染色體上位點(diǎn)，Tdurum_contig35799_208，達(dá)到極顯著關(guān)聯(lián)水平（2.27×10-5）。E2環(huán)境檢測(cè)到12個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分布在2B、3B、6A和6B染色體上，其中，4個(gè)位點(diǎn)集中在3B染色體同一位置，各有3個(gè)位點(diǎn)分別集中在6A和6B的同一位置上，說(shuō)明染色體上這些區(qū)段是控制小麥籽粒植酸含量基因的重要區(qū)段。

表4 植酸含量關(guān)聯(lián)位點(diǎn)及其對(duì)表型變異的貢獻(xiàn)率（R2）Table 4 Loci associated with Phytic acid content and percentage of phenotypic variation explained (R2)

圖1 植酸含量全基因組關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖Fig.1 Manhattan plot for Phytic acid content in two environments

圖2 植酸含量全基因組關(guān)聯(lián)分析QQ圖Fig.2 Quantile-quantile plot for Phytic acid content in two environments

2.4 關(guān)聯(lián)位點(diǎn)優(yōu)異等位變異

兩個(gè)種植年度環(huán)境中共檢測(cè)到36個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，其攜帶不同等位變異品種的植酸含量表型差值為 0～0.98 g/kg。其中，不同等位變異品種的表型差值達(dá)到顯著性差異水平的位點(diǎn)共25個(gè)，E1環(huán)境19個(gè)位點(diǎn)，E2環(huán)境 6個(gè)位點(diǎn)，品種間表型差值為0.33～0.98 g/kg（表5）。在E1環(huán)境檢測(cè)到的位點(diǎn)Tdurum_contig35799_208對(duì)低植酸含量效應(yīng)最大，差值為0.98 g/kg，該位點(diǎn)的堿基G相對(duì)于T為優(yōu)異等位變異。此外，E2環(huán)境中的優(yōu)異等位變異Excalibur_c96134_152-C、Excalibur_c96134_182-T和Tdurum_contig43538_1687-A對(duì)低植酸含量效應(yīng)較大。

表5 植酸含量關(guān)聯(lián)位點(diǎn)等位變異表型Table 5 Phenotypic effect of allelic for Phytic acid content loci

續(xù)表5

3 討論

對(duì)我國(guó)76份小麥地方品種和 62 份來(lái)自黃淮、長(zhǎng)江中下游和西南麥區(qū)品種的分析表明，小麥植酸含量為5.16～9.87 g/kg[7]。在我國(guó)137份微核心種質(zhì)資源中，植酸含量變異范圍為9.59～29.63 g/kg，大多數(shù)品種植酸含量屬于中等水平[14]。400份印度及 CIMMYT品種和人工合成種植酸含量的變異范圍為11.7～19.3 g/kg[20]。黃淮麥區(qū)212份代表性品種的植酸含量為2.18～13.37 g/kg，絕大多數(shù)品種植酸含量屬于中等水平[10]。本研究表明，中國(guó)冬麥區(qū)205份20世紀(jì)80年代以來(lái)的推廣品種或骨干親本及高代品系的植酸含量為1.00～18.90 g/kg，絕大多數(shù)品種植酸含量較低。與前人報(bào)道相比[9,10,14,20]，本研究中植酸含量的變異范圍更大，且絕大多數(shù)品種植酸含量較低，可能與所選取的材料和數(shù)量有關(guān)。目前還沒(méi)有對(duì)小麥植酸含量進(jìn)行育種選擇，因而其變異范圍較大。因此，在當(dāng)前進(jìn)行小麥低值酸品質(zhì)改良時(shí)，首先對(duì)現(xiàn)有品種的目標(biāo)性狀進(jìn)行篩選將是一個(gè)有效的選擇手段。本研究中，推廣品種或骨干親本中，B54、B40、B86和 B126植酸含量較低，有可能成為重要的育種親本，在低植酸含量小麥品質(zhì)育種中發(fā)揮作用。

高代育種品系具有優(yōu)異目標(biāo)性狀突出、遺傳穩(wěn)定的特征，有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的可直接在生產(chǎn)上應(yīng)用，也可選育成為品種。本群體中B131、B141、B181和 B149等高代育種品系植酸含量較低，結(jié)合品系優(yōu)異性狀，有可能選育出低值酸含量功能性小麥新品種。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)小麥籽粒植酸含量QTL定位方面的報(bào)道較少。本研究分別在2B、3B、3D和6B染色體上檢測(cè)到植酸含量的QTL位點(diǎn)，何秋怡等[15]在3B和3D染色體上檢測(cè)到2個(gè)控制植酸含量的 QTL，凡迪等[16]在 2B和 6B染色體上定位到控制植酸含量的QTL，初步推斷這些染色體上可能存在控制植酸含量的重要基因。

國(guó)內(nèi)外對(duì)小麥鐵、鋅等元素含量已進(jìn)行了較深入研究，品種間存在顯著差異[21]，但植酸含量和鐵、鋅等微量元素含量相關(guān)性研究鮮有報(bào)道。建議在本研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測(cè)定冬麥區(qū)種質(zhì)資源的鐵、鋅等微量元素含量，同時(shí)篩選出值酸含量低且鐵、鋅等微量礦質(zhì)元素含量高的種質(zhì)資源，同時(shí)將其用于育種，為小麥新時(shí)代品質(zhì)育種提供參考。

4 結(jié)論

兩個(gè)種植年度環(huán)境群體植酸含量平均值為4.99 g/kg和3.31 g/kg，變幅分別為17.90 g/kg和10.20 g/kg，群體植酸含量變異范圍較大。聚類分析將群體材料聚為6類。其中，高代育種品系除第2和3類沒(méi)有分布之外，其它各類中都有均勻分布；推廣品種或骨干親本中，B54、B40、B86和 B126植酸含量最低，有可能成為重要的育種親本，在低植酸含量小麥品質(zhì)育種中發(fā)揮作用。高代品系 B131、B141、B181和 B149植酸含量最低，結(jié)合品系優(yōu)異性狀，有可能選育出低值酸含量功能性小麥新品種。關(guān)聯(lián)分析共檢測(cè)到36 個(gè)與小麥籽粒植酸含量相關(guān)聯(lián)的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)（P＜0.001），分布在 2B、3A、3B、3D、6A和6B染色體上，單個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)表型變異貢獻(xiàn)率為5.73%～9.69%。同時(shí)，挖掘了一批低值酸含量基因的優(yōu)異等位變異，例如Tdurum_contig35799_208-G、Excalibur_c96134_152-C、Excalibur_c96134_182-T和Tdurum_contig43538_1687-A對(duì)低植酸含量效應(yīng)較大。