鄧志英，李文淑，郭迎新，趙云哲，陳廣鳳，王德華，王冠穎，田紀春?

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,作物生物學(xué)國家重點實驗室，小麥品質(zhì)育種研究室，山東 泰安 271018；2.德州學(xué)院 生態(tài)與資源環(huán)境學(xué)院，山東 德州 253000）

小麥是世界上廣泛種植的禾本科植物，約為世界上40%的人口提供能量和營養(yǎng)。我國是小麥的生產(chǎn)和消費大國。小麥播種面積為24 507.99千公頃，約占全國的20.77%，產(chǎn)量為13 433.39萬噸，約占全國糧食總產(chǎn)量的20.30%。小麥是我國第二大糧食作物，而且大部分人口都以小麥制品作為主食，其生產(chǎn)水平對保障國家糧食安全具有重要意義。隨著我國人民飲食生活習(xí)慣和水平的不斷提高，人們對小麥產(chǎn)品的營養(yǎng)成分和風(fēng)味品質(zhì)的要求也在不斷提高。在保證產(chǎn)量的基礎(chǔ)上，培育優(yōu)質(zhì)、廣適的小麥新品種，是我國小麥品質(zhì)育種的主要趨勢之一[1]。

淀粉是組成小麥干物質(zhì)的主要成分，約占小麥籽粒總重的75%，分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。淀粉中直鏈淀粉含量是影響面條品質(zhì)的重要因素，與面條的軟度、粘性、光滑性、口感和綜合評分等品質(zhì)參數(shù)呈負相關(guān)關(guān)系[2]。小麥直鏈淀粉含量和支鏈淀粉支鏈長度分布對淀粉的糊化性有較大影響，對面包制作具有不可缺少的作用[3]。淀粉分支酶(SBE)[4]、可溶性淀粉合成酶(SSS)和淀粉去分支酶(DBE)負責(zé)支鏈淀粉的合成[5]；而顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)是與直鏈淀粉合成直接有關(guān)的酶[6-7]，顆粒結(jié)合型淀粉合成酶有兩個同工酶，根據(jù)其發(fā)揮作用的場所劃分為顆粒結(jié)合型淀粉合成酶Ⅰ和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶Ⅱ，其中顆粒結(jié)合型淀粉合成酶Ⅰ(GBSSⅠ)也稱為 Wx蛋白。而關(guān)于根莖葉和其它非貯藏器官的直鏈淀粉合成是顆粒結(jié)合型淀粉合成酶Ⅱ[8]。Wx蛋白由3種亞基組成，分別是Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1。Wx-A1位于7A染色體上短臂上，Wx-B1位于4A染色體長臂上、Wx-D1位于7D染色體短臂上。Wx蛋白與直鏈淀粉的合成密切相關(guān)，其隱性突變體籽粒中直鏈淀粉含量下降[9]。研究表明：小麥直鏈淀粉含量與 Wx蛋白相對含量呈高度正相關(guān)。缺失Wx蛋白會引起直鏈淀粉含量的減少。Miura[10]的研究發(fā)現(xiàn)，Wx-B1蛋白對直鏈淀粉含量影響最大。降低直鏈淀粉含量，改善淀粉特性，可以使面粉擁有更好的面條品質(zhì)參數(shù)。但是，前人對不同Wx蛋白亞基缺失對干面條品質(zhì)質(zhì)構(gòu)參數(shù)及煮熟面條品質(zhì)的拉伸參數(shù)研究較少。因此，本研究以含有不同 Wx蛋白亞基缺失類型的重組自交系(RIL)群體為材料，檢測其Wx蛋白重組類型，并對不同重組類型的直、支鏈淀粉的含量進行分析；同時對干、濕面條品質(zhì)進行了質(zhì)構(gòu)參數(shù)的分析；其研究結(jié)果對面條品質(zhì)的改良具有較好的參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小麥RIL群體是以藁城8901（父本）與糯麥1號（母本）雜交，通過單粒傳法獲得的純合家系的RIL群體。糯麥1號是以“江蘇白火麥”和“關(guān)東 107”雜交育成的全糯小麥品種；藁城 8901是以“77546-2”和“臨漳”育成的優(yōu)質(zhì)強筋小麥品種。兩親本在淀粉品質(zhì)和蛋白質(zhì)品質(zhì)方面存在顯著差異。2017—2018年種植在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗基地，3行區(qū)，2次重復(fù)。收獲的籽粒利用 Buhler磨進行磨粉，出粉率在70%左右。

1.2 實驗方法

1.2.1 Wx蛋白亞基的鑒定

Wx蛋白提取方法及電泳步驟參考潘志芬[11]方法；電泳結(jié)果采用銀染[12]。

1.2.2 雙波長法測定直鏈淀粉和支鏈淀粉含量

配制淀粉標準溶液：分別稱取馬鈴薯直鏈淀粉純品（Sigma公司）和馬鈴薯支鏈淀粉純品（Sigma公司）0.100 0 g至100 mL燒杯中，加入0.5 mol/L KOH 10 mL，75 ℃水浴10 min，轉(zhuǎn)移至 100 mL容量瓶中，定容至 100 mL，即為1 mg/mL直、支鏈淀粉標準溶液。

用等吸收點作圖法選擇直、支鏈淀粉的測定的波長和參比波長，得出支鏈淀粉測定波長為553 nm、參比波長為740 nm，直鏈淀粉測定波長為790 nm，參比波長為820 nm。

制作雙波長支鏈淀粉標準曲線，用 UV-Vis Analyst軟件建立標準曲線，線性相關(guān)系數(shù) r =0.996 2，支鏈淀粉含量 C(mg/mL) = -0.002 7+0.367 9*ΔA。制作雙波長直鏈淀粉標準曲線，用UV-Vis Analyst軟件建立標準曲線，線性相關(guān)系數(shù)r = 0.999 6，直鏈淀粉含量C(mg/mL) = 0.000 0+0.220 5*ΔA。

1.2.3 面條制作

面粉用量為 100 g（14%濕基），加水量為吸水率的50%。采用美國KitchenAid和面儀一檔邊加水邊攪拌30 s，加水后一檔攪拌30 s，然后4檔攪拌2 min，最后2檔攪拌2 min。室溫（25 ℃）熟化 30 min，采用 JMTZ-14型面條機壓輥間距2 mm處軋面，再三折合片兩次、兩折合片各一次，然后將面片逐漸壓薄至1.0 mm（壓距分別為3.5、3.0、2.5、2、1.5、1 mm 各一次）。面片切成 2.0 mm寬的細長面條，將切出的面條一部分掛在圓木棍上，放入恒溫（約40 ℃）恒濕（75%）箱內(nèi)，干燥10 h，然后再室溫干燥10 h，另一部分置于塑料封袋口中備用。

1.2.4 干面條斷裂參數(shù)測定

利用TA.XT.plus型質(zhì)構(gòu)儀進行測定，承重平臺HDP/90，附件A/SFR：包括上下兩個支撐槽。將干面條放置在探頭的上下兩個支槽之間，支撐槽以0.5 mm/s的速度緩慢向下移動擠壓樣品，當(dāng)達到力量感應(yīng)元應(yīng)受到的最小的力(15 g)后，開始記錄數(shù)據(jù)，然后支撐槽以2.5 mm/s的速度繼續(xù)下移，面條逐漸被壓制彎曲直至斷裂，面條斷裂后，探頭以10.0 mm/s的速度返回起始位置。

1.2.5 濕面條拉伸參數(shù)測定

將待測面條用蒸餾水煮至白芯剛好消失；取出煮熟至白芯剛好消失的面條置于涼水中沖洗；然后利用TA.XT.plus型質(zhì)構(gòu)儀進行測定，承重平臺HDP/90，附件A/SPR：上下兩個相互平行的摩擦輪。測試臂以1.0 mm/s的速度緩慢上升，力量感應(yīng)元在感受到5 g的力后，測試臂以3.0 mm/s的速度移動，同時傳感器開始記錄數(shù)據(jù)，當(dāng)面條受到的拉力超過它能承受的極限時，面條斷裂。探頭以10.0 s的速度自動返回起始位置。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析應(yīng)用DPS v7.05及SPSS11.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 Wx蛋白亞基組合類型分析

由圖1和表1可知，群體中共鑒定出8種Wx蛋白亞基組成類型，且8種類型分布比較均勻。其中野生型即 Wx蛋白亞基正常所占比例最多為13.94%。Wx蛋白亞基全缺失突變型即全糯比例最少，共 23個，占 11.06%。三種單缺失類型共77個，分別占 11.54%、12.02%、13.46%。三種雙缺失性與單缺失型比例相近，共79個，比例分別是13.46%、12.50%、12.02%。由此可知，群體中涵蓋了所有不同Wx蛋白亞基缺失組合類型。

表1 Wx蛋白亞基組合類型及比例Table 1 Combination types and proportions of Wx protein subunits

圖1 群體中不同Wx蛋白亞基缺失組合SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoretogram of different waxy protein subunits deletion combinations in RIL population

2.2 不同Wx蛋白亞基組合類型對小麥淀粉含量的影響

由表2可知，不同Wx蛋白亞基位點缺失對小麥直、支鏈淀粉含量都有一定的影響，但影響程度不同。就直鏈淀粉含量而言，Wx蛋白全缺失類型和野生型、單缺失和雙缺失類型相比，達5%顯著差異；單缺失類型中，Wx-A1蛋白缺失類型和其他兩個單缺失類型相比，達5%顯著差異；雙缺失類型之間直鏈淀粉含量有差異，但沒達顯著性差異。就支鏈淀粉含量而言，突變型與其他組合類型相比，達5%顯著性差異；單缺失類型之間，Wx-A1蛋白缺失類型與其他兩種組合相比達5%顯著性差異；雙缺失類型之間有差異，但未達顯著水平。

表2 不同Wx蛋白亞基組合類型對直、支鏈淀粉含量的差異分析Table 2 Effect of different Wx protein subunits combination on amylose and amylopectin content %

2.3 不同Wx蛋白亞基組合類型對干面條質(zhì)構(gòu)參數(shù)的影響

由表 3可知，干面條斷裂強度以突變型即全糯型材料最好，不易斷裂，與野生型即正常型、Wx-D1缺失和Wx-A1和Wx-D1共同缺失類型呈1%極顯著性差異；單缺失類型之間，Wx-A1缺失和Wx-B1缺失類型之間無顯著性差異；雙缺失類型之間，同時缺失Wx-B1和Wx-D1類型與同時缺失 Wx-A1和 Wx-D1類型之間達 5%顯著性差異，與同時缺失Wx-A1和Wx-B1類型之間無顯著性差異，由此可知，在雙缺失類型條件下，存在 Wx-B1缺失位點對面條干面條斷裂強度影響較大，不易斷裂。就干面條彈性而言，除Wx-D1缺失類型和突變型之間達5%顯著性差異外，其余組合類型之間差異都未達顯著。因此，對干面條質(zhì)構(gòu)參數(shù)而言，Wx蛋白亞基的缺失主要影響干面條斷裂強度。

表3 不同Wx蛋白亞基組合類型對干面條斷裂強度和彈性的差異分析Table 3 Effect of different Wx protein subunit combinations on the dry noodle quality

2.4 不同Wx蛋白亞基組合類型對面條拉伸參數(shù)的影響

由表4可知，就煮熟面條拉伸力而言，Wx-A1缺失類型與Wx-D1缺失類型、Wx-A1和Wx-B1同時缺失類型、Wx-A1和 Wx-D1同時缺失類型及突變類型達5%顯著性差異，與其他類型未達顯著性差異。單缺失類型之間，Wx-A1缺失類型和Wx-B1缺失類型間無顯著性差異，都與 Wx-D1缺失類型達5%顯著性差異；雙缺失類型之間無顯著性差異。

表4 不同Wx蛋白亞基組合的面條拉伸參數(shù)的比較分析Table 4 Effect of different Wx protein subunit combinations on the tensile parameters of cooked noodle

就拉伸距離而言，突變型即全糯型最好，與野生型、Wx-D1缺失類型都達 5%顯著性差異，與其他組合類型未達顯著性差異；單缺失類型之間，Wx-A1缺失類型和 Wx-B1缺失類型間無顯著性差異，都與Wx-D1缺失類型達5%顯著性差異，與拉伸力在單缺失類型之間的差異一致；雙缺失類型之間無顯著性差異，與拉伸力在雙缺失類型之間的差異一致。

就曲線面積而言，不同組合類型之間的差異與拉伸力之間的差異基本一致。即Wx-A1缺失類型與Wx-D1缺失類型、Wx-A1和Wx-B1同時缺失類型、Wx-A1和 Wx-D1同時缺失類型及突變類型達5%顯著性差異，與其他類型未達顯著性差異。雙缺失類型之間無顯著性差異，單缺失類型之間，除Wx-D1缺失類型外，也都無顯著性差異。

以上分析可知，單缺失類型條件下，影響煮熟面條拉伸參數(shù)嚴重程度為 Wx-A1缺失類型≥Wx-B1缺失類型＞W(wǎng)x-D1缺失類型；雙缺失條件下，以Wx-B1和Wx-D1同時缺失時為最優(yōu)；當(dāng)三個位點同時缺失時，主要影響煮熟面條的拉伸距離，其次是曲線面積和拉伸力。

3 討論

前人研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，Wx蛋白可以控制直鏈淀粉的合成，進而影響淀粉品質(zhì)和最終加工品質(zhì)。Wx蛋白基因的表達會影響直、支鏈淀粉含量及淀粉的糊化特性和膨脹特性。本研究發(fā)現(xiàn)，直支鏈淀粉含量的差異與Wx蛋白亞基的組合類型密切相關(guān)。Wx蛋白全缺失類型直鏈淀粉含量和野生型、單缺失和雙缺失類型相比都達到了顯著差異；單缺失類型中，Wx-A1蛋白缺失類型的直鏈淀粉含量和其他兩個單缺失類型相比達顯著差異；雙缺失類型之間直鏈淀粉含量有差異，但沒達顯著性差異?？傮w而言，直鏈淀粉含量的高低以野生型＞單缺失類型＞雙缺失類型＞突變型（全缺失類型），與前人的研究基本一致[15-16]。前人研究發(fā)現(xiàn) Wx-B1位點的缺失對面條品質(zhì)尤其是面條的滑爽性影響較大[17-18]，而對干面條品質(zhì)質(zhì)構(gòu)參數(shù)及煮熟面條品質(zhì)拉伸參數(shù)的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，在雙缺失類型條件下，當(dāng)組合中存在Wx-B1缺失位點時對面條干面條斷裂強度影響較大，不易斷裂；而干面條彈性方面，除Wx-D1缺失類型和突變型之間達顯著性差異外，其余組合類型之間差異都未達顯著。因此，對干面條品質(zhì)質(zhì)構(gòu)參數(shù)而言，Wx蛋白亞基的缺失主要影響干面條斷裂強度。

通過比較發(fā)現(xiàn)，單缺失類型條件下，影響煮熟面條拉伸參數(shù)嚴重程度為 Wx-A1缺失類型≥Wx-B1缺失類型＞W(wǎng)x-D1缺失類型；雙缺失條件下，以Wx-B1和Wx-D1同時缺失時為最優(yōu)；當(dāng)三個位點同時缺失時，主要影響煮熟面條的拉伸距離，其次是曲線面積和拉伸力。因此，在雙缺失條件下，Wx-B1亞基位點是否缺失是影響面條品質(zhì)質(zhì)構(gòu)參數(shù)的重要因素。在優(yōu)質(zhì)專用小麥品種選育過程中，要考慮不同 Wx亞基組合類型對淀粉品質(zhì)及面條品質(zhì)的影響。

4 結(jié)論

不同Wx蛋白亞基位點缺失對小麥直、支鏈淀粉含量影響的程度不同。雙缺失類型之間直、支鏈淀粉含量都沒有顯著差異，突變型和其他組合相比達顯著差異。雙缺失組合中存在 Wx-B1缺失位點時對面條干面條斷裂強度影響較大，不易斷裂。影響煮熟面條拉伸參數(shù)，單缺失組合為 Wx-A1≥Wx-B1＞W(wǎng)x-D1，雙缺失組合中Wx-B1和Wx-D1同時缺失時面條拉伸表現(xiàn)最優(yōu)；全缺失時，主要影響煮熟面條的拉伸距離，其次是曲線面積和拉伸力。