崔瑛

（許昌市人民醫(yī)院質(zhì)控辦，河南 許昌461000）

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是世界上最常見的癌癥類型之一，每年約新發(fā)病例100萬例，在所有癌癥中發(fā)病率居第三位,嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[1]。目前,結(jié)腸癌的治療方法涉及手術(shù)、化療、靶向治療等多種治療方法,取得了一定的效果[2]。然而，部分患者治療后往往復(fù)發(fā)，不利于患者改善預(yù)后。因此，預(yù)測術(shù)后預(yù)后和選擇合適的輔助治療是非常重要的，尤其對(duì)于II、III期CRC患者。雖然術(shù)前腫瘤標(biāo)志物、腫瘤-結(jié)節(jié)-轉(zhuǎn)移（TNM）等多種臨床病理因素已被報(bào)道為影響預(yù)后的因素,但對(duì)復(fù)發(fā)高?；颊叩淖R(shí)別并不容易[3]。近年來，分子標(biāo)記作為預(yù)測預(yù)后的標(biāo)志物在CRC中得到了廣泛的關(guān)注。

無翼/集成（Wingless/Integrated，Wnt）信號(hào)通路是胚胎發(fā)育和成人組織中控制細(xì)胞行為規(guī)范的基本進(jìn)化保守信號(hào)機(jī)制之一[4]。異常的Wnt信號(hào)通路激活與各種癌癥在內(nèi)的多種疾病發(fā)生相關(guān)[5]。有三種不同的Wnt信號(hào)通路：β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路、鈣離子依賴（calcium-dependent）通路和平面細(xì)胞極性通路(planar cell polarity pathway)。三個(gè)Wnt信號(hào)通路進(jìn)一步可分為規(guī)范和非規(guī)范信號(hào)通路，其中β-catenin通路，屬于規(guī)范的途徑,具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和增殖的作用[6]。為此,本研究對(duì)2011年5月至2014年5月期間106例TNM II期或III期CRC患者組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路及相關(guān)因子進(jìn)行檢測,分析其與CRC預(yù)后的相關(guān)性，報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 資料來源 收集2011年5月至2014年5月我院收治的TNM II期或III期CRC患者106例，男61例，女45例，年齡33～85歲，平均61.9±15.7歲，均經(jīng)組織病理學(xué)確診，排除合并其它惡性腫瘤以及術(shù)前行放化療等治療的患者。

1.2 檢測方法 使用TRIzol（（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）試劑盒從組織中提取總RNA。采用TaKaRa Reverse Transcription Kit（TaKaRa，Dalian，China）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為37°C 15 min，85°C 5s。然后將1:10稀釋的2μl cDNA加入25μl的反應(yīng)體系（PCR mix 12.5μl、ROX 0.5μl、正向引物1μl、反向引物1μl和H2O 8μl），試劑盒采用TaKaRa公司的Power SYBR Green，反應(yīng)條件為95 C變性30s，其次為95°C 5s、退火溫度下34秒的35循環(huán)，最后溶解曲線分析。儀器采用ABI Prism 7700 Sequence Detection System實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。采用βactin和GAPDH作為內(nèi)參基因。Wnt1、β-catenin、TCF4、β-actin和GAPDH擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 基因PCR擴(kuò)增引物序列及退火溫度

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 經(jīng)Kolmogorov-Smirnov分析，各組水平數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示,組間比較采用方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS19.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 Wnt1、β-catenin、TCF4在CRC患者組織中的表達(dá) CRC患者癌組織中Wnt1、β-catenin、TCF4 mRNAs表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表2。

表2 Wnt1、β-catenin、TCF4在CRC患者組織中的表達(dá)（±s）

表2 Wnt1、β-catenin、TCF4在CRC患者組織中的表達(dá)（±s）

組別 例數(shù)癌旁正常組織癌組織t值P值106 106 Wnt1 β-catenin 1.07±0.56 3.25±1.61 14.343<0.001 0.97±0.63 5.33±2.96 19.967<0.001 TCF4 1.03±0.57 7.18±3.53 23.517<0.001

2.2 Wnt1、β-catenin、TCF4的表達(dá)與CRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系106例CRC組織中Wnt1的表達(dá)與腫瘤大小、浸潤程度和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）；β-catenin的表達(dá)與分化程度、浸潤程度和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）；TCF4的表達(dá)與浸潤程度和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。三項(xiàng)指標(biāo)均與與患者年齡、性別和腫瘤部位無關(guān)（P均>0.05）。見表3。

2.3 Wnt1、β-catenin、TCF4表達(dá)與CRC患者預(yù)后的關(guān)系 106例CRC患者的隨訪時(shí)間為3~60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為28.9±11.2個(gè)月。隨訪期間59例發(fā)生死亡，死亡率為55.7%。COX單因素分析,浸潤程度、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Wnt1、β-catenin和TCF4是CRC患者預(yù)后的影響因素；進(jìn)一步納入多因素模型進(jìn)行分析,顯示局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Wnt1、βcatenin和TCF4是CRC患者預(yù)后的獨(dú)立因素。見表4。

3 討論

TNM分期臨床上決定CRC患者預(yù)后的重要標(biāo)準(zhǔn),其中TNM II期和III期腫瘤約占CRC患者的70%[7]。雖然研究顯示多學(xué)科聯(lián)合治療成功地誘導(dǎo)了約60%的II期和II期臨床緩解,但目前關(guān)于II期和III期患者的治療方案選擇仍存在較大爭議。NCCN指南規(guī)定，治療原發(fā)性非轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的手術(shù)和輔助全身治療,后者需要根據(jù)病理分期和臨床特點(diǎn)。通常認(rèn)為,輔助化療通?？梢蕴岣逫II期CRC患者的無病生存率，然而，T1-2N1M0腫瘤（IIIA期）患者的生存率明顯高于IIB期腫瘤患者，并且相當(dāng)一部分III期患者僅僅遭受化療的副作用，提示輔助化療需要優(yōu)化[8]。同時(shí)研究顯示[9]，約30%的組織學(xué)上沒有淋巴結(jié)受累的CRC患者術(shù)后5年內(nèi)死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)，提示單純的TNM分期不能充分預(yù)測CRC的臨床進(jìn)程。因此，尋找其它有效指標(biāo)準(zhǔn)確地識(shí)別II期高?；颊吆虸II期低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)患者，顯得迫切需要。

表3 Wnt1、β-catenin、TCF4的表達(dá)與CRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表4 COX分析影響CRC患者整體生存的預(yù)后因素

Wnt信號(hào)通路在維持正常細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用,目前已知其與包括CRC在內(nèi)的多種腫瘤進(jìn)展相關(guān)[10]。Wnt蛋白是分泌糖蛋白，是Wnt信號(hào)通路的配體。Wnt有19個(gè)亞型，F(xiàn)z有10個(gè)亞型，它們具有相同的遺傳結(jié)構(gòu)同源性。單個(gè)Wnt配體和Fz受體可以激活不同疾病的典型或非典型通路，因此Wnt信號(hào)通路非常復(fù)雜。在目前的研究中，我們關(guān)注Wnt1/β-catenin通路。Wnt-1最初被認(rèn)為是小鼠乳癌病毒（mouse mammary tumor virus，MMTV）插入激活的靶點(diǎn),從而導(dǎo)致乳腺增生。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Wnt-1被認(rèn)為是一種分泌的生長因子，與細(xì)胞表面結(jié)合同源Fz受體相互作用時(shí)，產(chǎn)生Wnt信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而影響細(xì)胞的各種功能,包括細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、極性和增殖[11]。在細(xì)胞內(nèi)部，信號(hào)通過散體蛋白（dsh）和zesti-white 3-糖原合成酶激酶3~（zw3/GSK3）基因的蛋白產(chǎn)物進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。Wnt1可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞形態(tài)上的變化，這些變化有利于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[13]。本研究中，106例CRC患者癌組織中Wnt1的表達(dá)要明顯高于癌旁正常組織，并且與腫瘤大小、浸潤程度和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05），提示其在CRC發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

β-catenin是一種多功能蛋白,主要結(jié)構(gòu)包括130個(gè)氨基酸氨基末端結(jié)構(gòu)域、包含42個(gè)氨基酸的12個(gè)不完全重復(fù)（又稱，Arm重復(fù)）和100個(gè)氨基酸的羧基末端結(jié)構(gòu)域。β-catenin的氨基端對(duì)調(diào)節(jié)該蛋白的穩(wěn)定性具有重要作用,而羧基端融合到GAL4 DNA結(jié)合域時(shí),可起到激活轉(zhuǎn)錄的作用[14]。除了在粘附連接處的結(jié)構(gòu)功能外，β-catenin在Wnt配體刺激的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中積累，并介導(dǎo)細(xì)胞核中的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而β-catenin的累積是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵事件。核β-catenin與淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子/T細(xì)胞因子（LEF/TCF）家族的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合,從而將TCF從轉(zhuǎn)錄抑制因子轉(zhuǎn)化為激活因子[15]。TCF/β-catenin復(fù)合物進(jìn)一步上調(diào)Wnt的靶基因如c-myc，cyclin D1、CD44、Axin2和SP5的表達(dá)[16]。在沒有Wnt刺激的情況下，細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin可與酪蛋白激酶1α（CK1α）和糖原合成酶激酶3（GSK-3）等形成細(xì)胞質(zhì)蛋白復(fù)合物。最終，氨基端磷酸化的β-catenin被泛素化并隨后被蛋白酶體破壞[17]。β-catenin可通過同時(shí)與E鈣粘蛋白和α鈣粘蛋白結(jié)合,將粘附分子連接到細(xì)胞骨架聚合物肌動(dòng)蛋白上,細(xì)胞粘合連接并且核βcatenin表達(dá)升高被認(rèn)為是異常β-catenin信號(hào)通路激活和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的跡象[18]。Xu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核中β-catenin的升高與腫瘤患者的與不良預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，CRC癌組織中βcatenin的表達(dá)與分化程度、浸潤程度和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05），與相關(guān)報(bào)道一致。

TCF4對(duì)于小腸和結(jié)腸上皮細(xì)胞的胚胎發(fā)育和成體組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。當(dāng)在高遷移率族DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列的緊鄰上游插入產(chǎn)生潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)盒時(shí)，TCF4可被全身敲除，從而導(dǎo)致小鼠由于小腸失去增殖能力而在圍產(chǎn)期死亡[20]。Wang等[21]研究顯示，腸組織中TCF4的靶向缺失伴隨著小腸和結(jié)腸中增殖細(xì)胞的喪失。同時(shí)，譜系示蹤實(shí)驗(yàn)表明,成年Tcf4缺陷的小腸和結(jié)腸干細(xì)胞不會(huì)促進(jìn)上皮自我更新[22]。Hua等[23]研究顯示，TCF4是CRC的發(fā)生、發(fā)展的重要因素。本研究結(jié)果也顯示TCF4在CRC癌組織中明顯升高,并且其表達(dá)與浸潤程度和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。COX多因素模型進(jìn)行分析顯示，TCF4和Wnt1、β-catenin均是CRC患者預(yù)后的獨(dú)立因素。

綜上所述,Wnt1、β-catenin和TCF4可以有效預(yù)測TNM II期和III期CRC患者的預(yù)后,便于臨床制定更有效的CRC綜合治療方案。