陳建安 鐘堅(jiān) 周靜 王坤

【摘要】 目的：探討膿毒癥患者的外周血淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)和絕對(duì)值情況，了解膿毒癥患者的免疫功能狀況，同時(shí)觀察血清PCT與淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的相關(guān)性，進(jìn)一步探究機(jī)體免疫功能狀態(tài)與機(jī)體炎癥狀態(tài)的關(guān)系。方法：選取2017年1月-2019年10月在本院被確診為膿毒癥的56例住院患者為研究對(duì)象進(jìn)行回顧性分析，并將其納入膿毒癥組。選取健康者22例為健康對(duì)照組。檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群抗原表達(dá)情況、絕對(duì)值情況以及血清PCT水平，比較兩組上述檢測(cè)指標(biāo)。結(jié)果：膿毒癥組的淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD3+CD8+的表達(dá)率均低于健康對(duì)照組，CD3-CD19+、CD4+/CD8+、CD3+CD56+16+的表達(dá)率均高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。膿毒癥組外周血CD3+絕對(duì)值、CD3+CD4+絕對(duì)值、CD3+CD8+絕對(duì)值均低于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。膿毒癥患者的CD3+的表達(dá)率與血清PCT水平呈負(fù)相關(guān)，CD3-CD19+的表達(dá)率與血清PCT水平呈正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：膿毒癥患者存在免疫功能紊亂，T細(xì)胞免疫功能與炎癥情況有關(guān);CD3+CD56+16+ NKT的表達(dá)率增多，在膿毒癥患者免疫功能起到重要的免疫調(diào)節(jié)作用。

【關(guān)鍵詞】 膿毒癥 淋巴細(xì)胞亞群 降鈣素原 流式細(xì)胞術(shù)

Correlation Analysis of the Expression and Absolute Value of Lymphocyte Subsets in Peripheral Blood of Sepsis Patients with PCT/CHEN Jian’an， ZHONG Jian， ZHOU Jing， WANG Kun. //Medical Innovation of China， 2021， 18（16）： -143

[Abstract] Objective： To investigate the expression and absolute value of lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with sepsis， to understand the immune function status of patients with sepsis. Meanwhile， to observe the correlation between serum PCT and lymphocyte subsets expression， to further explore the relationship between the immune function status of the body and the inflammatory status of the body. Method： A retrospective analysis was conducted on 56 inpatients diagnosed with sepsis in our hospital from January 2017 to October 2019， and they were included in the sepsis group， 22 healthy subjects were selected as the healthy control group. The antigen expression， absolute value and serum PCT level of peripheral blood lymphocyte subsets were detected， and the above detection indexes were compared between the two groups. Result： The expression rates of lymphocyte subsets CD3+ and CD3+CD8+ in sepsis group were lower than those in healthy control group， and the expression rates of CD3-CD19+， CD4+/CD8+， and CD3+CD56+16+ were higher than those in healthy control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The absolute value of CD3+， CD3+CD4+ and CD3+CD8+ in peripheral blood of sepsis group were lower than those of healthy control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The expression rate of CD3+ in sepsis patients was negatively correlated with serum PCT level， while the expression rate of CD3-CD19+ was positively correlated with serum PCT level （P<0.05）. Conclusion： Sepsis patients have immune dysfunction， T cell immune function is related to inflammation; The expression rate of CD3+CD56+16+ NKT is increased， which plays an important role in immune regulation in patients with sepsis.

[Key words] Sepsis Lymphocyte subsets Procalcitonin Flow cytometry

First-author’s address： Donghua Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University， Dongguan 523110， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.16.034

膿毒癥是由潛在或已知感染因素引起機(jī)體全身炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的器官功能障礙綜合征，嚴(yán)重膿毒癥和膿毒性休克患者的病死率高，近年來其生存率尚未有明顯的改善，機(jī)體細(xì)胞介導(dǎo)免疫在膿毒癥及其多臟器功能損傷的病理過程起重要作用[1]。急性膿毒癥一般被認(rèn)為是“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的結(jié)果，這與免疫細(xì)胞的活化和促炎因子的釋放高度相關(guān)，并且在初始階段之后，似乎還伴隨著以依賴性方式快速誘導(dǎo)免疫細(xì)胞衰竭的過程[2]，從而導(dǎo)致機(jī)體固有細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能在全身炎癥反應(yīng)時(shí)可被廣泛地激活和功能障礙[3]。因此，本研究通過檢測(cè)分析膿毒癥患者淋巴細(xì)胞亞群水平來探討患者機(jī)體的免疫功能狀態(tài)對(duì)膿毒癥診斷、治療、預(yù)后的意義。與此同時(shí)，由于降鈣素原（PCT）是目前臨床常用的反應(yīng)機(jī)體感染狀態(tài)的指標(biāo)之一[4]，將其與淋巴細(xì)胞亞群的變化進(jìn)行分析，從而探究機(jī)體的免疫狀態(tài)是否與感染程度相關(guān)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月-2019年10月在本院被確診為膿毒癥的56例住院患者為研究對(duì)象進(jìn)行回顧性分析，并將其納入膿毒癥組。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：入住急診醫(yī)學(xué)科和重癥醫(yī)學(xué)科并符合2016年《SSC指南》中膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)者;年齡>18歲。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：具有腫瘤、自身免疫性疾病及原發(fā)器官功能障礙者;入院前2周使用糖皮質(zhì)激素或其他能影響免疫功能藥物者;妊娠、哺乳及月經(jīng)期女性。選取健康者22例為健康對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 儀器為美國(guó)貝克曼-庫(kù)爾特（Beckman Coulter）公司的FC500 MCL流式細(xì)胞儀，日本SYSMEX XN-3000血細(xì)胞分析儀，試劑為SYSMEX公司提供的相應(yīng)配套試劑;FC500 MCL流式細(xì)胞儀試劑為Beckman Coulter公司提供，測(cè)定T淋巴細(xì)胞亞群使用的單克隆抗體包括（批號(hào)7536275）：CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5;測(cè)定B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞亞群使用的單克隆抗體包括（批號(hào)7580213）：CD45-FITC/CD56-PE/CD19-ECD/CD3-PC5;其他試劑：磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、紅細(xì)胞裂解液等。

1.2.2 標(biāo)本收集方法 分別抽取膿毒癥患者、和健康對(duì)照者外周靜脈血2 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中并混勻，TBNK淋巴細(xì)胞亞群分析待檢測(cè);同時(shí)抽取膿毒癥患者外周靜脈血2 mL，置于促凝干燥管內(nèi)，3 500 r/min，離心5 min，分離血清，待進(jìn)行PCT檢測(cè)。

1.2.3 檢測(cè)方法 分別加入T淋巴細(xì)胞亞群、BNK淋巴細(xì)胞亞群的單克隆抗體試劑各5 μL至流式專用管內(nèi)底端，分別加入50 μL EDTA抗凝全血，震蕩混勻，室溫避光反應(yīng)20 min，加入紅細(xì)胞裂解液300 μL，室溫避光20 min，加入300 μL PBS混勻，上機(jī)檢測(cè);通過分析軟件得到CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、CD3-CD56+16+、CD3+CD56+16+表達(dá)率，同時(shí)乘以淋巴細(xì)胞的絕對(duì)值計(jì)數(shù)，從而得到相應(yīng)淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)值。

1.2.4 PCT的檢測(cè)方法 儀器為法國(guó)生物梅里埃（bioMerieux， sa）公司的全自動(dòng)熒光免疫分析儀（VIDAS）;試劑盒為同一公司提供，即PCT測(cè)定試劑盒（酶聯(lián)免疫熒光法）。嚴(yán)格按照儀器和試劑說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用IBM SPSS Statistics 25.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 膿毒癥組56例，男30例，女26例;年齡22～65歲，平均（48±12）歲。健康對(duì)照組22例，男12例，女10例;年齡28～72歲，平均（45±10）歲。兩組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組外周血淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)情況比較 膿毒癥組的淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD3+CD8+的表達(dá)率均低于健康對(duì)照組，CD3-CD19+、CD4+/CD8+、CD3+CD56+16+的表達(dá)率均高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;兩組CD3+CD4+、CD3-CD56+16+的表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.3 兩組外周血淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值比較 膿毒癥組外周血CD3+絕對(duì)值、CD3+CD4+絕對(duì)值、CD3+CD8+絕對(duì)值均低于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;兩組CD3-CD19+絕對(duì)值、CD3-CD56+16+絕對(duì)值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.4 外周血淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)率、絕對(duì)值與膿毒癥患者的相關(guān)性分析 膿毒癥組血清PCT水平（41.07±35.53）ng/mL，高于健康對(duì)照組的（0.87±0.48）ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.319，P<0.05）。膿毒癥組的CD3+、CD3-CD19+的表達(dá)率與血清PCT水平呈線性相關(guān)，膿毒癥患者的CD3+表達(dá)率與血清PCT水平呈負(fù)相關(guān)，CD3-CD19+的表達(dá)率與血清PCT水平呈正相關(guān)（r=-0.271、0.217，P<0.05），但CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+16+、CD4+/CD8+、CD3+CD56+16+表達(dá)率及CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、CD3-CD56+16+絕對(duì)值與血清PCT水平均無相關(guān)性，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

CD3是成熟T淋巴細(xì)胞的特征性標(biāo)志，主要是與T細(xì)胞受體結(jié)合，將T細(xì)胞受體與抗原結(jié)合產(chǎn)生的活化信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，又分為CD3+CD4+輔助性T（Th）細(xì)胞和CD3+CD8+的殺傷性T（Tc）細(xì)胞[5]，前者具有輔助體液免疫和細(xì)胞免疫的功能，后者有殺傷和抑制作用，可誘導(dǎo)和維持免疫抑制，一系列研究表明在膿毒癥發(fā)展過程中，T淋巴細(xì)胞在介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答時(shí)非常關(guān)鍵，可以明顯減弱其增殖活力，Th2免疫反應(yīng)更加突出，在Th2細(xì)胞介導(dǎo)早期往往有大量淋巴細(xì)胞凋亡，容易造成機(jī)體的炎癥反應(yīng)[6-7]。機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)可以用CD4+/CD8+的比值進(jìn)行預(yù)估，該值超出正常范圍時(shí)，表示機(jī)體的免疫功能紊亂。當(dāng)免疫系統(tǒng)處于負(fù)調(diào)節(jié)狀態(tài)時(shí)，CD3+CD4+細(xì)胞反應(yīng)性會(huì)下降或喪失，這導(dǎo)致其他免疫細(xì)胞，如B淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+ T細(xì)胞、其他免疫細(xì)胞的增殖分化以及免疫調(diào)節(jié)能力均下降，進(jìn)一步使得CD3+CD8+細(xì)胞相對(duì)性增加，因此當(dāng)CD4+/CD8+比值下降程度較大時(shí)，說明機(jī)體可能處于免疫抑制狀態(tài)[8]。CD3-CD19+細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞，為體液免疫的主要功能細(xì)胞，CD3-CD56+16+細(xì)胞為NK細(xì)胞，是自然殺傷細(xì)胞，起到直接殺傷作用[9]，因此，上述細(xì)胞在表型、功能等各個(gè)方面的變化可能在很多疾病中均可作為疾病活動(dòng)、復(fù)發(fā)和療效的判定指標(biāo)之一，具有很重要的臨床意義[10]。

本研究結(jié)果顯示，膿毒癥組的CD3-CD19+表達(dá)率及CD4+/CD8+均高于健康對(duì)照組，CD3+、CD3+CD8+的表達(dá)率及外周血CD3+絕對(duì)值、CD3+CD4+絕對(duì)值、CD3+CD8+絕對(duì)值均低于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示存在T淋巴細(xì)胞的缺失，細(xì)胞免疫功能明顯受到抑制，機(jī)體的免疫功能紊亂，與Gouel-Chéron等[11]報(bào)道相似。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床研究也發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞以及其亞群的數(shù)目在膿毒癥早期診斷及預(yù)后有意義[12]。與趙雪峰等[13]、李華福等[14]報(bào)道大致相同，亦有不同，本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，膿毒癥組的CD3+CD4+的表達(dá)率無明顯變化，CD4+/CD8+比值偏高，與預(yù)期和趙雪峰等[13]的結(jié)果相反，處于膿毒癥休克患者同時(shí)存在著免疫抑制和自身免疫的過度激活，而導(dǎo)致這種狀況，與龍盼等[15]報(bào)道相似;雖本研究CD3+CD4+的表達(dá)率無減少，但CD3+CD4+絕對(duì)值明顯減少，提示淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值計(jì)數(shù)能更好地反映患者細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。而當(dāng)患者處于重度膿毒癥或膿毒癥休克時(shí)，特異性體液免疫增強(qiáng)，CD3-CD19+的表達(dá)率會(huì)上升，與孟祥忠等[16]報(bào)道相似。

PCT被認(rèn)為是一項(xiàng)細(xì)菌感染的特異性指標(biāo)，穩(wěn)定性、靈敏度和特異性都較高[17]，作為膿毒癥的診斷指標(biāo)廣泛應(yīng)用[18]。在膿毒癥患者中，可以認(rèn)為血清PCT水平越高者，發(fā)生MODS的可能性越大，預(yù)后不良的可能性也越大，患者機(jī)體的炎癥狀態(tài)越嚴(yán)重[19]。研究表明，兒童血清PCT水平越高，患者機(jī)體感染程度越嚴(yán)重，其T淋巴細(xì)胞亞群選擇性表達(dá)缺失越顯著，這說明免疫抑制有利于感染炎癥的進(jìn)展[20]。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥患者的CD3+表達(dá)率與血清PCT水平呈負(fù)相關(guān)，CD3-CD19+的表達(dá)率與血清PCT水平呈正相關(guān)，提示細(xì)胞免疫功能越低，膿毒癥患者的炎癥程度越嚴(yán)重。

CD3+CD56+16+細(xì)胞為NKT細(xì)胞，為一群獨(dú)特的T淋巴細(xì)胞亞群，是被CD1d分子遞呈的糖脂類抗原激活的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞[21]，在感染、自身免疫性疾病、內(nèi)分泌、腫瘤中發(fā)揮作用[22]，NKT細(xì)胞被激活后分泌大量的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素（IL-4、IL-10、IL-13）及干擾素等，通過影響Th1/Th2平衡，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，是炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)免疫平衡的基礎(chǔ)[23-25]。本研究結(jié)果顯示CD3+CD56+16+ NKT細(xì)胞表達(dá)率增多，提示其在膿毒癥患者中起到重要的免疫調(diào)節(jié)作用，從而影響其細(xì)胞免疫功能的變化。

綜上所述，膿毒癥患者存在免疫功能紊亂，T細(xì)胞免疫功能與炎癥情況有關(guān);CD3+CD56+16+ NKT細(xì)胞在膿毒癥患者中起到重要的免疫調(diào)節(jié)作用。

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（收稿日期：2021-03-25） （本文編輯：姬思雨）