孫仲平，吳乃瑾，楊蘇才，魏文俠，宋云

輕工業(yè)環(huán)境保護研究所，工業(yè)場地污染與修復北京市重點實驗室

三氯乙烯(TCE)作為工業(yè)溶劑、脫脂劑和電子零件清潔劑，在生產(chǎn)和生活過程中得到了廣泛應用。由于不合理的處理或處置，導致TCE進入土壤和地下水，其毒性和難降解性對人體健康和生態(tài)環(huán)境造成持續(xù)的風險[1]，我國在2018年實行的GBT 14848—2017《地下水質(zhì)量標準》中新增了多種揮發(fā)性氯代烴污染限值，Ⅲ類水質(zhì)TCE限值為70 μgL。針對環(huán)境健康風險和污染現(xiàn)狀，亟需開展對TCE污染地下水的治理研究。

目前，TCE的修復包括物理、化學和生物等技術(shù)，其中，原位生物修復技術(shù)最為經(jīng)濟有效，且應用最廣，在適宜的環(huán)境中能將TCE徹底礦化為CO2和環(huán)境可接受的水溶性物質(zhì)，因此該技術(shù)已成為研究熱點[2-3]。國外研究證明[4-5]，在含水層的缺氧、厭氧條件下，TCE可作為電子受體通過微生物介導發(fā)生脫氯降解，并分離出多種能降解氯代烴的功能微生物，如Desulfitobacteriumsp.、Sulfurospirillumsp.、Dehalobactersp.、Dehalococcoides等多種菌屬[6-10]。Dehalococcoides是目前報道的重要脫氯菌，屬于綠彎菌門，科研工作者陸續(xù)分離得到對不同結(jié)構(gòu)氯代乙烯有降解能力的脫鹵擬球菌屬的菌株[4,11-12]。

大量研究表明，氫解和二氯消除是TCE降解的主導過程[13-14]，而TCE在地下水缺氧環(huán)境中的生物降解則主要通過氫解作用逐步脫氯，依次生成二氯乙烯(DCE)、氯乙烯(VC)和乙烯(ETH)等產(chǎn)物[15-16]。從應用現(xiàn)狀來看，微生物和電子供體條件是制約原位生物修復技術(shù)實施的重要因素。實際修復工程中常采用添加菌種進行生物強化或添加電子供體進行生物刺激來縮短生物降解的周期，前者在實際應用中成本較高，且一般發(fā)現(xiàn)氯代烴污染的場地成分比較復雜，菌種投放在污染場地后很可能由于不能適應多變的環(huán)境而被土著微生物競爭取代[17-18]。筆者從北京市某氯代烴實際污染場地采集含水層沉積物及地下水，利用微宇宙試驗體系，在厭氧條件下分別研究添加不同濃度的醋酸鈉、乳酸鈉、乳酸對地下水中TCE去除效果的影響，結(jié)合各厭氧體系內(nèi)中間產(chǎn)物的分析和微生物多樣性的變化對反應機理進行闡述，以期為國內(nèi)TCE污染地下水原位生物修復提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用醋酸鈉、乳酸鈉、乳酸均為分析純，TCE為色譜純(國藥集團化學試劑有限公司)。試驗所用地下水和沉積物取自北京市某化工廠的氯代烴污染場地(取樣深度約為-15 m)，利用哈希Hydrolab多參數(shù)水質(zhì)分析儀測定地下水溶解氧濃度、pH、氧化還原電位(ORP)、電導率，污染地下水初始pH為7.18，電導率為1 608 Scm，ORP為163.2 mV，溶解氧濃度為4.97 mgL。

1.2 試驗設(shè)計

采用微宇宙試驗體系模擬研究地下水環(huán)境中TCE的生物降解規(guī)律[20]，從北京市某化工廠的氯代烴污染區(qū)采集地下水和含水層沉積物，在100 mL血清瓶中盛裝6 g過2 mm篩的沉積物和60 mL地下水，隨后置于手套箱中，開啟真空泵至壓力表穩(wěn)定在-0.1 MPa 保持1 h左右(抽真空完成)，然后填充氮氣至箱內(nèi)使氣壓稍高于外界氣壓，反復3次，分別配置成含有10 mgL TCE的污染物體系，并用含聚四氟乙烯墊片的蓋子密封后混勻。TCE厭氧微宇宙試驗周期為30 d，將含不同組分(表1)樣品瓶放入恒溫振蕩搖床〔60 rmin，(25.0±0.5)℃〕數(shù)日，取上清液測定目標污染物殘留濃度，定期取1 mL培養(yǎng)瓶頂空相氣體檢測乙烷、乙烯、氯乙烷、氯乙烯的濃度，并在試驗進行過程中同時監(jiān)測各反應體系的pH和ORP。每組設(shè)置2個平行。

表1 厭氧微宇宙試驗組成

1.3 分析方法

采用吹掃捕集-氣相色譜-質(zhì)譜(Agilent，GC7890B、MSD5977A，美國)測定水中TCE濃度，色譜柱參數(shù)為DB-624 column (Agilent，60 m×250 μm×1.4 μm，-20～260 ℃)。柱箱溫度為40 ℃，檢測器溫度為260 ℃，保留時間為19 min，分流比為20∶1。

利用氣相色譜(Agilent GC7890B，美國)分析微宇宙體系中的氣體成分。色譜柱參數(shù)為HP-PLOT/Q column (Agilent，30 m×320 μm×20 μm，-60～270 ℃)，前進樣口溫度為220 ℃，隔墊吹掃流量為3 mL/min，分流比為20∶1，柱箱溫度為40 ℃，F(xiàn)ID檢測器溫度為200 ℃，保留時間為15 min，尾氣吹掃流量為30 mL/min。

微生物多樣性是基于Illumina HiSeq測序平臺，利用雙末端測序的方法，構(gòu)建小片段文庫進行測序。通過對Reads拼接過濾，OTUs(operational taxonomic units)聚類，并進行物種注釋及豐度分析，可以揭示樣品的物種構(gòu)成。同時利用實時熒光定量分析對總細菌和功能基因數(shù)量進行測定。

TCE降解率(η)的計算公式如下：

η=[(C0-C)/C0]×100%

(1)

式中：C為TCE在反應過程中的濃度,mg/L；C0為TCE的初始濃度，即10 mg/L。

對TCE降解進行反應動力學分析，公式如下：

ln(C/C0)=-kt

(2)

式中：k為反應速率常數(shù)，d-1；t為反應時間,d。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同電子供體刺激下TCE的降解效果

2.1.1無電子供體

圖3 投加不同濃度醋酸鈉后TCE降解率、pH和ORP的變化Fig.3 Effects of sodium acetate concentration on the degradation rate of TCE,pH and ORP

為考察未添加電子供體時TCE的降解狀況，設(shè)置了空白組、自然組、滅菌組，反應體系內(nèi)TCE相對濃度隨時間變化如圖1所示。由圖1可見，在自然組、滅菌組和空白組中，TCE濃度變化不大，因此，在后續(xù)的試驗中，因揮發(fā)或吸附等因素造成的損失可以忽略。

圖1 厭氧條件下TCE濃度變化Fig.1 Variation of TCE concentration under anaerobic conditions

地下水理化參數(shù)是影響微生物活性的重要因素。研究表明，厭氧條件下氯代烴發(fā)生還原脫氯最適pH為6.8～7.5，且微生物降解氯代烴會在一定的ORP下有次序地進行[13,21]，并以甲烷產(chǎn)生和硫酸鹽還原過程(-300～-100 mV)占優(yōu)勢，在較強還原環(huán)境時還會發(fā)生β-消除反應。TCE降解過程中反應體系的pH和ORP的監(jiān)測值如圖2所示。從圖2可以看出，整個試驗過程中各組pH一直保持在6～8，而ORP為100～300 mV，未實現(xiàn)理想的還原環(huán)境，從而導致目標污染物未發(fā)生顯著降解。

圖2 TCE降解過程中pH和ORP監(jiān)測值Fig.2 pH and ORP monitoring values during degradation of TCE

2.1.2醋酸鈉為電子供體

以0.5、1.0、2.0 g/L醋酸鈉為電子供體時TCE的降解情況和各組pH、ORP監(jiān)測值如圖3所示。

由圖3(a)可見，3組微宇宙試驗體系中TCE均發(fā)生明顯降解，結(jié)合未添加電子供體組(空白組、自然組、滅菌組)的情況可以判斷，TCE降解的主要過程為微生物降解，這是由于加入了營養(yǎng)物質(zhì)和電子供體，有效刺激了微生物生長。

從圖3(b)可以看出，整個試驗過程中各組pH始終保持在6.5～7.2，ORP均值為-300～-100 mV，均達到厭氧環(huán)境，有利于厭氧微生物的生存和代謝，從而導致TCT產(chǎn)生降解。該組試驗中隨醋酸鈉濃度升高，TCE降解率先增大后減小，在反應30 d后，1.0 g/L醋酸鈉下TCE降解率最高，可達到94.5%;0.5 g/L醋酸鈉下TCE降解率為91.9%;2.0 g/L醋酸鈉下TCE降解率最低，為87.0%。這可能是因為隨著醋酸鈉濃度升高，參與脫氯降解的微生物代謝活動逐漸增強，但醋酸鈉濃度過高反而抑制了微生物活性，故本組試驗中1.0 g/L為醋酸鈉最適宜投加量。

2.1.3乳酸鈉為電子供體

以0.5、1.0、2.0 g/L乳酸鈉為電子供體時TCE的降解情況和各組pH、ORP監(jiān)測值如圖4所示。由圖4可見，3組微宇宙試驗體系中TCE均發(fā)生明顯降解，整個試驗過程中各組pH始終保持在6.5～7.2，ORP均值為-300～-100 mV，均達到厭氧環(huán)境，有利于厭氧微生物的生存和代謝，從而導致TCE產(chǎn)生降解。隨著乳酸鈉濃度升高，TCE降解率先增大后減小，其中，在反應30 d后，1.0 g/L乳酸鈉下TCE降解率最高，可達到91.4%；0.5 g/L乳酸鈉下TCE降解率次之，為87.1%；2.0 g/L乳酸鈉下TCE降解率最低為83.1%。這可能是因為隨著乳酸鈉濃度升高，參與脫氯降解的微生物代謝活動逐漸增強，但乳酸鈉濃度過高反而抑制了微生物活性，故本組試驗中1.0 g/L為乳酸鈉最適宜投加量。

圖4 投加不同濃度乳酸鈉后TCE降解率、pH和ORP變化Fig.4 Effects of sodium lactate concentration on the degradation rate of TCE,pH and ORP

2.1.4乳酸為電子供體

以0.5、1.0、2.0 g/L乳酸為電子供體時TCE的降解情況和各組pH、ORP監(jiān)測值如圖5所示。由圖5可見，3組微宇宙試驗體系中TCE均發(fā)生明顯降解，整個試驗過程中0.5、1.0 g/L試驗組pH始終保持在6.5～7.2，2.0 g/L試驗組pH最終降至6.1，一定程度上不利于厭氧微生物生長代謝；各組ORP均值為-200～-100 mV，均達到厭氧環(huán)境，有利于厭氧微生物的生存和代謝。

隨著乳酸濃度的升高，TCE降解率先增大后減小，在反應30 d后，1.0 g/L乳酸下TCE降解率最高，達74.0%；0.5 g/L乳酸下其降解率次之，為67.4%；2.0 g/L乳酸下TCE降解率最低，為62.2%。這可能是因為隨著乳酸濃度升高，參與脫氯降解的微生物代謝活動逐漸增強，但乳酸濃度過高反而抑制了微生物活性，故本組試驗中1.0 g/L為乳酸最適宜投加量。

對比以上結(jié)果，該試驗條件下，各組電子供體的適宜添加量為1.0 g/L，此時TCE的降解率從高到低依次為醋酸鈉>乳酸鈉>乳酸，因此選用1.0 g/L醋酸鈉為最適電子供體。

圖5 投加不同濃度乳酸后TCE降解率、pH和ORP變化Fig.5 Effects of lactic acid concentration on the degradation rate of TCE,pH and ORP

圖6 投加不同電子供體后TCE降解的擬合曲線Fig.6 Fitting curve of TCE degradation of adding different electron donors

2.2 動力學分析

圖6為醋酸鈉、乳酸鈉、乳酸3種電子供體在3種濃度投加情況下TCE降解的ln(C/C0)-t擬合曲線。由圖6可知，不同種類電子供體對TCE降解反應的ln(C/C0)與t均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，1.0 g/L醋酸鈉試驗組中TCE脫氯降解反應速率常數(shù)最高，為0.092 5 d-1，這3種電子供體刺激下TCE的反應速率常數(shù)的大小依次為1.0 g/L醋酸鈉>0.5 g/L醋酸鈉>1.0 g/L乳酸鈉>0.5 g/L乳酸鈉>2.0 g/L醋酸鈉>2.0 g/L乳酸鈉>1.0 g/L乳酸>0.5 g/L乳酸>2.0 g/L乳酸，進一步表明在這3種電子供體中，1.0 g/L醋酸鈉是最適電子供體。

2.3 降解產(chǎn)物分析

厭氧條件下，TCE的降解主要通過還原作用完成，包括氫解作用和二氯消除作用，但大部分研究指出，TCE在地下水缺氧環(huán)境中主要發(fā)生氫解作用即還原脫氯[15,23]，依次生成DCE、VC和ETH等產(chǎn)物，降解路徑見圖7。

圖7 TCE的厭氧還原脫氯過程示意Fig.7 Pathways of anaerobic reductive dechlorination of chlorinated ethylene

在對厭氧反應降解中間產(chǎn)物的氣相取樣分析中，并未檢測到VC和乙烯的產(chǎn)生，在液相取樣分析中分別取樣檢測了反應體系可能產(chǎn)生的反式-1,2-二氯乙烯 (trans-1,2-DCE)、順式1,2-二氯乙烯(cis-1,2-DCE)、1,1-二氯乙烯(1,1-DCE)的產(chǎn)生情況，待分析中間產(chǎn)物只在反應第30天檢測到了cis-1,2-DCE的產(chǎn)生，其濃度如圖8所示。結(jié)合文獻和試驗結(jié)果可以判斷，該試驗中TCE微生物厭氧脫氯反應產(chǎn)生了cis-1,2-DCE，說明TCE降解發(fā)生了氫解反應。在這個還原脫鹵過程中，理論上講DCE的3種同分異構(gòu)體都可能產(chǎn)生，然而Bouwer等[24]的研究表明，生物降解過程中cis-1,2-DCE作為中間產(chǎn)物要比trans-1,2-DCE常見，1,1-DCE是3種異構(gòu)體中出現(xiàn)概率最低的子產(chǎn)物，這與本試驗未檢測到trans-1,2-DCE和1,1-DCE的現(xiàn)象相符。

圖8 第30天微宇宙試驗體系降解產(chǎn)物分析Fig.8 Analysis of degradation products in microcosms on the 30st day

試驗第30天未檢測到ETH和VC，雖然已有研究表明，在地下水厭氧環(huán)境中，TCE能徹底還原脫氯成ETH或乙烷[17,25]，但是氯代烴的厭氧還原脫鹵過程是按照一定順序發(fā)生的，其中TCE轉(zhuǎn)化為DEC過程較快，cis-DCE轉(zhuǎn)化為VC最終至ETH或乙烷的生成速率較慢。Pant等[16]發(fā)現(xiàn)厭氧條件下氯代乙烯能還原脫氯成無毒ETH，其中VC轉(zhuǎn)化為ETH耗時最長，這可能是本組試驗未檢測到VC和ETH的原因。也有研究表明[26-27]，TCE脫氯不完全主要因為能將TCE徹底還原脫氯的Dehalococcoides菌種并非普遍存在，即使存在，其種類、數(shù)量及其他菌種的影響等都可能造成該菌種無法充分發(fā)揮作用。

2.4 微生物多樣性及定量分析

為進一步分析不同處理條件下微宇宙體系內(nèi)微生物多樣性的變化規(guī)律，分別在反應前中后期分析監(jiān)測了1.0 g/L醋酸鈉樣品中微生物多樣性，第0天、第15天和第30天樣品分別記為UNt0、TCE15、TCE30。

2.4.1微生物門水平相對豐度變化

3組樣品門水平物種相對豐度見圖9。從圖9可以看到，第0天未處理樣本中優(yōu)勢菌門為Proteobacteria(變形菌門，84.9%)、Bacteroidetes(擬桿菌門，8.7%)、Actinobacteria(酸桿菌門，2.5%)等，TCE15樣本中優(yōu)勢菌門為Proteobacteria(66.1%)、Firmicutes(厚壁菌門，22.1%)、Bacteroidetes(11.1%)，TCE30樣本中優(yōu)勢菌門為Proteobacteria(49.8%)、Firmicutes(47.9%)、Bacteroidetes(0.6%)。大量研究表明，變形菌門和厚壁菌門為潛在高效脫氯微生物[28-30]。

由圖9可見，厚壁菌門相對豐度隨時間推移而增大，變形菌門相對豐度隨時間推移減小，但最終相對豐度仍高于20%。厚壁菌門和擬桿菌門多為嚴格的厭氧和兼性細菌，即厭氧菌的相對豐度隨時間推移增大，這說明隨著反應的進行，微宇宙體系內(nèi)潛在高效降解菌均為優(yōu)勢菌門，且厭氧微生物生長狀況良好，表明TCE的降解與優(yōu)勢菌群的生長有著密切的聯(lián)系。微生物門水平數(shù)據(jù)顯示，有少量的綠彎菌門微生物生長(未列出)，而該類細菌也是潛在高效脫氯微生物Dehalococcoides所屬菌門[4,31]，該類微生物也有可能與污染物的降解有密切關(guān)系。

2.4.2微生物屬水平相對豐度變化

對高效潛在氯代烴降解細菌進行更細致的分類，樣品在屬水平上的物種相對豐度見圖10。由圖10可知，在樣品中均發(fā)現(xiàn)了Desulfitobacterium，研究發(fā)現(xiàn)Desulfitobacterium屬于厚壁菌門，其中的Desulfitobacteriumdehalogenans、Desulfitobacteriumstrain PCE1和Desulfitobacteriumstrain PCE-S具有轉(zhuǎn)化含氯烯烴的能力[28]，這與在TCE降解微宇宙試驗中污染物的降解現(xiàn)象相符，反應過程中Desulfitobacterium屬相對豐度有顯著增加，說明本試驗中微宇宙體系的條件有效刺激了該菌屬的生長。此外還檢測到了可能與脫氯過程相關(guān)的微生物，包括地桿菌屬(Geobacter)，有研究表明其可負責PCE或TCE降解至cis-1,2-DCE，Geobacterlovleyisp. nov. strain SZ是一種在醋酸鹽存在情況下，一種能夠以TCE作為電子受體進行還原脫氯的菌，其還原終產(chǎn)物為cis-1,2-DCE，此外該類菌還可起到鐵還原的作用[29,32]。

圖10 土壤樣品中不同細菌類群(屬水平)的相對豐度Fig.10 Relative abundances of bacterial groups (genus) in the soil samples

2.4.3基因定量分析

脫鹵擬球菌已在大量研究中被證實可實現(xiàn)氯代烴的脫氯降解[5,12,33-35]，且有包括pceA、tceA、vcrA和bvcA等功能基因的定量分析，這些基因相應的脫鹵酶催化不同的Dehalococcoides對氯代烴的降解。本研究各樣本中均檢測到了較高的tceA含量。總細菌和tceA檢測結(jié)果如表2所示。

表2 樣品中總細菌和tceA定量結(jié)果

從表2可以看出，隨著反應的進行，各組樣品的總細菌拷貝數(shù)顯著增加，相較于第0天未處理樣品的2.08×105mL-1，總細菌拷貝數(shù)增長4個數(shù)量級，這是由于各試驗組中添加了充足的電子供體及營養(yǎng)物質(zhì)，促使微生物大量生長繁殖。樣品TCE15總細菌拷貝數(shù)最高，為6.90×109mL-1，TCE30降至1.76×109mL-1，可能是因為反應前期為微生物快速增長期，隨著電子供體以及營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，微生物數(shù)目會出現(xiàn)先增多后減少的情況。

從表2可以看到，在本試驗反應周期內(nèi)，各組樣品均保持較高的tceA,功能基因水平(水樣中拷貝數(shù)可達106～107L-1)，這也表明各組樣本中均有Dehalococcoides的生長繁殖。研究表明[30,36-37]，tceA所編碼的還原脫氯酶主要催化TCE逐步脫氯直至VC的降解過程，表明本試驗中TCE的微生物降解可能是在功能基因tceA的作用下進行的。但對TCE降解產(chǎn)物的分析中并未檢測到VC。有研究表明[38]，DCE脫氯到VC的降解過程是比較緩慢的，這可能是該周期內(nèi)VC未檢出的主要原因。

3 結(jié)論

(1)厭氧條件下，對于同種電子供體而言，3組投加量(0.5、1.0、2.0 g/L)時TCE的降解率均先增大后減小，第30 天時，添加1.0 g/L醋酸鈉的反應體系中TCE的去除率最高，可達94.5%；添加1.0 g/L的乳酸鈉和乳酸的反應體系次之，分別為91.4%和74.0%。此外，添加醋酸鈉的試驗體系可長時間維持中性pH及較低的氧化還原電位。

(2)反應中間產(chǎn)物僅檢測到cis-1,2-DCE，推測該試驗條件下TCE生物降解的主要機制為氫解反應。

(3)微宇宙體系內(nèi)，各樣品門水平上優(yōu)勢菌門均含有Proteobacteria、Firmicutes，為TCE的潛在高效降解菌?；蚨糠治鲲@示，各反應體系中細菌總量大大增長，且各樣本均檢測到較高水平的功能基因tceA(水樣中拷貝數(shù)可達106～107L-1)，推測TCE的降解可能是在功能基因tceA的作用下進行的。