邢雅娟， 謝作甫， 單勝道， 成 忠， 沈海濤， 王志明

(1.浙江科技學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院， 浙江省廢棄生物質(zhì)循環(huán)利用與生態(tài)處理重點實驗室， 浙江 杭州 310023； 2.浙江景興紙業(yè)股份有限公司， 浙江 平湖 314214)

近年來由于造紙原料的缺乏，以廢紙為原料的再生紙行業(yè)迅速發(fā)展。與直接利用植物纖維制漿工藝相比，廢紙再生造紙廢水的污染負(fù)荷相對較輕，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過排放標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。在制漿過程中，一般每生產(chǎn)1 t廢紙漿，廢水排放量達(dá)100～150 m3[3]；大量的廢棄物除含有塑料粒、塑片、泥、沙粒外，還有細(xì)微的纖維素和半纖維素、木質(zhì)素、油、膠粒、礦粒、填料等混在廢水中排入江河，其廢水中的SS和CODCr等污染指標(biāo)大大高出國家《制漿造紙工業(yè)水污染排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB3544-2008)，若不加處理直接排放，將對環(huán)境帶來污染和傷害[4]。隨著廢紙再生利用比重的不斷提高，廢紙造紙廢水這一新污染源已引起人們的重視[5-7]。

內(nèi)循環(huán)厭氧反應(yīng)器(Internalcirculationreactor,IC)是荷蘭PAQUES公司于1985年在UASB反應(yīng)器的基礎(chǔ)上研發(fā)的第三代高效厭氧反應(yīng)器[8]。它具有占地面積小、高徑比大、有機(jī)負(fù)荷高、穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)點，適用于處理多種有機(jī)廢水。自1996年以來，高效厭氧內(nèi)循環(huán)反應(yīng)器迅速應(yīng)用于制漿造紙廢水的處理。IC厭氧反應(yīng)器當(dāng)前在造紙行業(yè)應(yīng)用較多的是用各類廢紙作原料的造紙廠，即二次纖維制漿造紙工廠，其中包括脫墨和不脫墨的各類廢紙制漿工藝的廢水處理。荷蘭PAPQES環(huán)保技術(shù)公司在1996年以來的工程項目中，IC反應(yīng)器工程的比例超過了UASB反應(yīng)器，制漿造紙工業(yè)已成為IC反應(yīng)器應(yīng)用較多的領(lǐng)域之一[9]。

以膨脹顆粒污泥床(EGSB)和內(nèi)循環(huán)(IC)反應(yīng)器為代表的高效厭氧裝置，垂直高度較大(一般超過15 m甚至25 m)，在運行中，隨反應(yīng)液循環(huán)的功能菌群承受著巨大的靜水壓差脅迫[10]。厭氧消化菌是高效厭氧反應(yīng)器的功能之源，因此，本文應(yīng)用16SrRNA基因-IlluminaMiSeq高通量測序技術(shù)，分析研究處理造紙廢水UMIC反應(yīng)器中不同高度的微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，以期探明IC反應(yīng)器中厭氧消化菌的種類組成、空間分布特性，為該反應(yīng)器工業(yè)化應(yīng)用中高效、穩(wěn)定運行提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

取自嘉興某造紙企業(yè)處理造紙廢水的厭氧反應(yīng)器中的厭氧顆粒污泥，取樣口1 m，2.5m，5 m，7.5 m，10 m，12.5 m，15 m(見圖1)所取樣品分別記為樣品1，2，3，4，5，6，7號(見圖2)。樣品于-20°C冰箱中保存至DNA提取。

圖1 UMIC反應(yīng)器取樣口

圖2 顆粒污泥樣品

1.2 微生物基因組DNA的提取及測序

采用DNA試劑(3SIDNAisolationkitv2.2forenvironmentalsamples，上海申能博彩生物科技有限公司)抽提樣品基因組DNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗基因組DNA，所得片斷約為23kb。將基因組DNA保存于-20°C。隨后選用細(xì)菌通用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)；古菌通用引物344F(5’-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3’)和915R(5’-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11-12]。PCR擴(kuò)增程序為：95°C 3 min，(95°C 30 s，55°C 30 s，72°C 45 s)27個循環(huán)，72°C 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化與定量后上機(jī)(IlluminaMiseqPE250/PE300平臺，上海美吉生物工程股份有限公司)。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物群落多樣性分析

7組顆粒污泥細(xì)菌群落的生物多樣性如表1所示；7組顆粒污泥古菌群落的生物多樣性如表2所示。7組樣品中細(xì)菌Shannon指數(shù)大小為4>7>6>3>5>1>2，7組樣品中古菌Shannon指數(shù)大小為4>7>6>2>1>5>3。表明在UMIC反應(yīng)器中，細(xì)菌的多樣性要高于古菌，且在反應(yīng)器7.5 m處細(xì)菌和古菌的多樣性都是最高。

表1 細(xì)菌群落的生物多樣性

表2 古菌群落的生物多樣性

2.2 門水平的優(yōu)勢菌群分布特征

在門水平上的細(xì)菌群落組成如圖3所示。7組顆粒污泥樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門分類水平上具多樣性水平較高，均達(dá)到13個門以上。主要包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋菌門(Spirochaetae)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)等。7種類群的相對豐度比例約占70%～80%。就平均而言，在7個樣品中，擬桿菌門和綠彎菌門在顆粒污泥中占有最大的豐度比例，兩者相加相對豐度比例均占50%以上。其中，Bactericides是厭氧過程中酸化水解復(fù)雜有機(jī)大分子的菌門[13]。

各組顆粒污泥樣品在門分類水平上的細(xì)菌群落豐度存在一定的差異。從圖3累積柱狀圖中的微生物相對豐度數(shù)據(jù)標(biāo)簽可知：擬桿菌門在各組顆粒污泥樣品中相對豐度高低為7>6>1>4>2>5>3，綠彎菌門在各組顆粒污泥樣品中相對豐度高低為2>3>5>1>4>6>7，厚壁菌門在各組顆粒污泥樣品中相對豐度高低則較為平均。說明在反應(yīng)器的頂部擬桿菌門微生物分布較多，而綠彎菌門微生物分布較少。厚壁菌門在反應(yīng)器中分布較為均勻。

圖3 細(xì)菌菌門水平微生物多樣性

在門水平上的古菌群落組成如圖4所示。7組顆粒污泥樣品中古菌群落結(jié)構(gòu)在門分類水平上具多樣性水平較低，主要包括廣古生菌門(Euryarchaeota)、深古菌門(Bathyarchaeota)，除4號樣品外，兩者相加相對豐度達(dá)90%以上。在3號和5號樣品中，主要分布著廣古菌門古菌，相對豐度達(dá)90%以上。各組顆粒污泥樣品在門分類水平上的古菌群落豐度存在一定的差異。從圖4累積柱狀圖中的微生物相對豐度數(shù)據(jù)標(biāo)簽可知：廣古生菌門(Euryarchaeota)在各組顆粒污泥樣品中相對豐度高低為5>3>2>6>7>4>1，深古菌門(Bathyarchaeota)在各組顆粒污泥樣品中相對豐度高低為1>7>6>2>4>5>3。說明在UMIC反應(yīng)器的1m處，Euryarchaeota豐度相對較低，而Bathyarchaeota豐度相對較高。在5m和10m處，Euryarchaeota占絕對優(yōu)勢。

圖4 古菌菌門水平微生物多樣性

2.3 屬水平的優(yōu)勢菌群分布特征

在屬水平上的細(xì)菌群落組成如圖5所示。7組顆粒污泥樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬分類水平上具多樣性水平較高，涵蓋了29個屬以上。主要包括Anaerolinea，Bacteroidetes_vadinHA17，Paludibacter，norank_f_Anaerolineaceae，Proteiniphilum，norank_f_FD35，norank_p_WWE3，Ruminococcus，Treponema，norank_p_WS6，Syntrophobacter，Georgenia等。12種類群的相對豐度比例約占60%～75%。就平均而言，在7個樣品中，Anaerolinea在顆粒污泥中占有最大的豐度比例。各組顆粒污泥樣品在屬分類水平上的細(xì)菌群落豐度存在一定的差異。從圖5累積柱狀圖中的微生物相對豐度數(shù)據(jù)標(biāo)簽可知：Anaerolinea在各組顆粒污泥樣品中相對豐度高低為2>3>5>1>6>7>4，與綠彎菌門在各組顆粒污泥樣品中相對豐度高低(2>3>5>1>4>6>7)較為一致。Anaerolinea它屬于嚴(yán)格的厭氧菌科，常見于各種厭氧反應(yīng)器中，能適應(yīng)高濃度的苯酚廢水，參與苯酚的降解[14]。Ruminococcus的豐度雖不是很高，卻能降解淀粉和纖維素和其它多糖以及蛋白質(zhì)和中短鏈有機(jī)酸，是完成厭氧發(fā)酵水解階段的重要微生物[15]。

圖5 細(xì)菌菌屬水平微生物多樣性

在屬水平上的古菌群落組成如圖6所示。7組顆粒污泥樣品中古菌群落結(jié)構(gòu)在屬分類水平上涵蓋了10個屬以上。主要包括Methanosaeta，norank_p_Bathyarchaeota，Methanobacterium，Methanosarcina等。除4號樣品外，其余6組樣品中4種類群的微生物相對豐度比例約占90%以上。其中，Methanosaeta在顆粒污泥中占有最大的豐度比例，7組樣品中相對豐度比例均達(dá)40%以上。各組顆粒污泥樣品在屬分類水平上的古菌群落豐度存在一定的差異。從圖6累積柱狀圖中的微生物相對豐度數(shù)據(jù)標(biāo)簽可知：Methanosaeta在各組顆粒污泥樣品中相對豐度高低為3>2>5>1>7>6>4；norank_p_Bathyarchaeota在各組顆粒污泥樣品中相對豐度高低為1>7>6>2>4>3>5；Methanobacterium在各組顆粒污泥樣品中相對豐度高低為5>3>4>2>7>1>6；Methanosarcina在各組顆粒污泥樣品中相對豐度高低為5>3>6>4>2>7>1。Methanobacterium能以H2作為電子供體，以CO2作為電子受體產(chǎn)甲烷[16]；Methanosaeta屬于典型的乙酸分解型產(chǎn)甲烷菌，是嚴(yán)格的厭氧菌[17]。

圖6 古菌菌屬水平微生物多樣性

3 結(jié)論

(1)采用16S rRNA基因Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對7組UMIC反應(yīng)器顆粒污泥樣品進(jìn)行測序。7組樣品中細(xì)菌Shannon指數(shù)大小為4>7>6>3>5>1>2，7組樣品中古菌Shannon指數(shù)大小為4>7>6>2>1>5>3。說明在UMIC反應(yīng)器中，細(xì)菌的多樣性要高于古菌，且在反應(yīng)器7.5 m處微生物多樣性最高。

(2)7組顆粒污泥樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)在門分類水平上細(xì)菌多樣性水平較高，而古菌多樣性水平較低。細(xì)菌主要包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋菌門(Spirochaetae)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)等；古菌主要包括廣古生菌門(Euryarchaeota)、深古菌門(Bathyarchaeota)等。在反應(yīng)器的頂部擬桿菌門微生物分布較多，而綠彎菌門微生物分布較少。厚壁菌門在反應(yīng)器中分布較為均勻；在UMIC反應(yīng)器的1m處，Euryarchaeota豐度相對較低，而Bathyarchaeota豐度相對較高。在5 m和10 m處，Euryarchaeota占絕對優(yōu)勢。

(3) 7組顆粒污泥樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)在屬分類水平上細(xì)菌多樣性水平較高，而古菌多樣性水平較低。細(xì)菌主要包括Anaerolinea，Bacteroidetes_vadinHA17，Paludibacter，norank_f_Anaerolineaceae，Proteiniphilum、norank_f_FD35，norank_p_WWE3，Ruminococcus，Treponema、norank_p_WS6，Syntrophobacter，Georgenia等；古菌主要包括Methanosaeta，norank_p_Bathyarchaeota，Methanobacterium，Methanosarcina等。Anaerolinea在各組顆粒污泥樣品中相對豐度高低為2>3>5>1>6>7>4，與綠彎菌門在各組顆粒污泥樣品中相對豐度高低(2>3>5>1>4>6>7)較為一致。Methanosaeta在顆粒污泥中占有最大的豐度比例，其在各組顆粒污泥樣品中相對豐度高低為3>2>5>1>7>6>4。