荊淑瑩, 史 策, 姚善涇, 林東強

連續(xù)流層析及用于抗體分離的新進展

荊淑瑩, 史 策, 姚善涇, 林東強

(浙江大學(xué) 生物質(zhì)化工教育部重點實驗室, 浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310027)

連續(xù)生物制造是生物制藥的發(fā)展趨勢，其中連續(xù)流層析是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。作者根據(jù)近年來國內(nèi)外連續(xù)流層析的研究進展，著重介紹了產(chǎn)物捕獲和精制階段的連續(xù)流層析技術(shù)，分析了不同模式的技術(shù)差異、各自特點和應(yīng)用現(xiàn)狀。針對未來發(fā)展趨勢，進一步介紹了整合連續(xù)流層析過程，以及用于抗體連續(xù)生產(chǎn)的難點和挑戰(zhàn)。作為一項新興技術(shù)，抗體連續(xù)生產(chǎn)具有提高過程產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量、促進設(shè)備小型化和流程自動化、拓展過程靈活性和可靠性、降低生產(chǎn)成本等顯著優(yōu)勢，但尚有不少方面需要改進和深化，包括過程設(shè)計、過程分析技術(shù)和過程控制技術(shù)等，特別是基于模型的預(yù)測分析和控制方法。

連續(xù)流層析；抗體；捕獲；精制；過程集成；過程分析技術(shù)

1 引 言

單克隆抗體(簡稱單抗)藥物具有靶向性強、療效好、副作用小等特點，在治療癌癥、自身免疫性疾病等方面具有顯著優(yōu)勢[1-2]。1985年首個鼠源單抗藥物被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準上市，2002年首個全人源單抗藥物上市，此后單抗類藥物所占市場份額迅速增加[3-5]。2019年，全球藥品銷售額前十名中，7個為單抗藥物。近年來，多個重磅單抗藥物專利到期，各大藥企紛紛開展相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)[6-7]。國家通過“4+7”帶量采購、醫(yī)保藥品談判等措施，極大壓低了藥品價格。因此，制藥企業(yè)面臨著新的挑戰(zhàn)，提高過程效率和產(chǎn)能、降低生產(chǎn)成本，是必須面對的迫切問題。

連續(xù)生物制造(continuous biomanufacturing)是目前業(yè)界普遍關(guān)注的熱點。連續(xù)生產(chǎn)已廣泛應(yīng)用于石油化工、冶金精煉、汽車制造等眾多行業(yè)[8-11]。近年來生物制藥行業(yè)也開始加大對連續(xù)生產(chǎn)的探索，美國FDA公開表示支持連續(xù)生產(chǎn)工藝，組建了專門的團隊以推進連續(xù)生產(chǎn)工藝的研發(fā)和實施[12]。2019年FDA發(fā)布官方聲明推動生物制藥的連續(xù)制造，并頒布了質(zhì)量控制指南[13]。目前連續(xù)灌流細胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)得到突破，并逐漸普及，在上游培養(yǎng)實現(xiàn)連續(xù)化的情況下，下游分離純化就成為整個生產(chǎn)過程的關(guān)鍵限速步驟[14-17]。麻省理工學(xué)院、瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院等一些研究機構(gòu)積極探索下一代抗體連續(xù)制備新技術(shù)，各生物制藥公司也紛紛建立連續(xù)制造研發(fā)中心，嘗試全流程的連續(xù)生產(chǎn)工藝[18]。相關(guān)研究表明，連續(xù)制造可提高過程產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量，促進設(shè)備小型化和流程自動化，拓展過程的靈活性和可靠性，顯著降低制備成本。但是連續(xù)生產(chǎn)過程復(fù)雜、難度較大，至今尚未有抗體藥物的連續(xù)生產(chǎn)工藝被批準，仍有許多方面有待進一步改善。

單抗藥物分離通常采用蛋白A親和層析捕獲和兩步層析精制的平臺工藝。層析是典型的批次處理過程，針對不同分離階段的需要，實現(xiàn)高效的連續(xù)流層析，是過程開發(fā)的關(guān)鍵。本文將綜述國內(nèi)外連續(xù)流層析的研究進展，著重介紹不同環(huán)節(jié)中連續(xù)流層析技術(shù)的原理、應(yīng)用和存在的問題，以及連續(xù)流層析在單抗藥物生產(chǎn)過程中面臨的挑戰(zhàn)。

2 捕獲階段的連續(xù)流層析

2.1 基本原理

抗體下游過程的層析分離主要分為捕獲與精制2個環(huán)節(jié)，捕獲階段多采用蛋白A親和層析，去除大量雜質(zhì)，普遍認為該階段是抗體藥物生產(chǎn)下游過程的關(guān)鍵步驟[19]。層析過程一般采取批次運行模式，即平衡、上樣、沖洗、洗脫、再生等各個步驟依次進行，產(chǎn)能和過程效率比較有限。

目前連續(xù)流層析主要應(yīng)用于抗體捕獲階段，一般采用多柱操作，通過順序切換層析柱，實現(xiàn)連續(xù)上樣分離，又稱為周期性逆流層析(periodic counter-current chromatography，PCC)。圖1(a)是典型的蛋白穿透曲線，為了避免損失，常規(guī)的批次層析通常采取較低的穿透點上樣，此時介質(zhì)的利用率較低(一般為50%~60%)，相當于圖1(a)中僅A部分的介質(zhì)容量被利用，造成了蛋白A層析介質(zhì)的浪費。為提高介質(zhì)利用率，可以將常規(guī)的單柱批次處理方式(圖1(b))轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘀?lián)的連續(xù)上樣模式(圖1(c))：柱1穿透的蛋白進入后續(xù)柱2繼續(xù)吸附，持續(xù)上樣至?xí)r間2，此時柱1的介質(zhì)吸附容量為(A+B)，介質(zhì)利用率顯著提高，經(jīng)優(yōu)化后可達90% 以上；柱1吸附完成后，將串聯(lián)的2根層析柱斷開，料液切換至柱2持續(xù)上樣，而柱1則進行沖洗、洗脫、再生和平衡等操作，然后柱1再次與柱2串聯(lián)，上述步驟依次進行，循環(huán)操作，可以實現(xiàn)料液的持續(xù)上樣。該方式能夠在避免蛋白損失的前提下顯著提高介質(zhì)利用率，同時提高過程產(chǎn)率，減少緩沖液消耗，降低生產(chǎn)成本。

圖1 連續(xù)捕獲層析原理圖

2.2 不同模式比較

基于上述原理，已開發(fā)出不同模式的連續(xù)流層析過程，主要有GE Healthcare公司PCC、Pall公司BioSMB、Novasep公司BioSC和ChromaCon公司CaptureSMB。

(1) 雙柱連續(xù)流層析和CaptureSMB

ChromaCon公司推出雙柱連續(xù)流層析系統(tǒng)Contichrom? CUBE，使用2根層析柱，是最精簡的連續(xù)流層析系統(tǒng)，其蛋白捕獲模式稱為CaptureSMB，YMC Process Technologies公司推出了相應(yīng)的制備生產(chǎn)級EcoPrime? Twin系統(tǒng)。具體操作包括6個步驟，如圖2所示。首先，2根層析柱以串聯(lián)方式上樣，1#柱流穿的蛋白被2#柱捕獲；1#柱達到設(shè)定的穿透點后，將未吸附的蛋白沖洗到2#柱；然后將兩柱斷開，1#柱進行淋洗、洗脫、再生、再平衡等步驟(Recovery-Regeneration，R-R)，與此同時2#柱繼續(xù)上樣。待1#柱完成所有洗脫和再生步驟，將1#柱串聯(lián)至2#柱后，2#柱持續(xù)上樣，與前面過程類似，只是兩柱調(diào)換了位置。因此，通過雙柱交替上樣，便可以實現(xiàn)連續(xù)層析分離。為使系統(tǒng)快速達到穩(wěn)定狀態(tài)，通常會在最前面添加一個啟動環(huán)節(jié)，還會在結(jié)束前添加一個終止環(huán)節(jié)。

圖2 雙柱連續(xù)流層析(CaptureSMB)捕獲蛋白示意圖[20]

CaptureSMB模式只使用2根層析柱，最大程度上簡化了設(shè)備及操作，但具有一定的局限性。由于存在雙柱串聯(lián)的沖洗階段(Step 2和5)，因此上樣過程存在中斷，一種改進方式是在Step 2和5中對后柱持續(xù)上樣，以保持上樣過程的連續(xù)性。此外，在單柱上樣階段(Step 3和6)，為了平衡另一柱的洗脫和再生過程，通常會減慢上樣流速，因此CaptureSMB模式為變流速上樣。

(2) 3~4柱連續(xù)流層析和PCC

GE Healthcare公司推出PCC連續(xù)流層析系統(tǒng)，包括實驗室規(guī)模的?KTA pcc和制備生產(chǎn)規(guī)模的BioProcess pcc，采取3C-PCC和4C-PCC兩種模式，分別使用3和4根層析柱。

3C-PCC系統(tǒng)的具體步驟見圖3，與CaptureSMB類似，也是采用2根層析柱串聯(lián)上樣。首先，1#和2#柱串聯(lián)進行上樣，3#層析柱進行R-R等步驟；當3#柱再生完畢，1#柱也達到預(yù)設(shè)的穿透比例，將1#柱與3#柱串聯(lián)，1#柱中未吸附的蛋白沖洗到3#柱，與此同時料液切換到2#柱，以恒定速度上樣；待1#柱沖洗完畢，斷開1#柱與3#柱，連接2#柱與3#柱，持續(xù)上樣，1#柱進行R-R步驟。重復(fù)以上步驟，從Step 1到Step 6，每根層析柱都完成了層析操作的所有步驟，恢復(fù)到初始狀態(tài)，即完成了一個分離循環(huán)。需要注意的是，上樣過程和洗脫再生過程需要合理設(shè)計，互相匹配。

圖3 3柱連續(xù)流層析(3C-PCC)捕獲蛋白示意圖

如果蛋白濃度較高，上樣時間較短，而洗脫再生時間較長，使得再生過程中蛋白可能從前面2根層析柱中穿透出來，造成蛋白的損失。針對這一狀況，可以使用4根層析柱的4C-PCC系統(tǒng)，具體見圖4，仍采用雙柱串聯(lián)的方式進行上樣，但將洗脫和再生分為2個階段，分別在2根層析柱內(nèi)進行。

不同于雙柱CaptureSMB模式，3C-PCC和4C-PCC采用恒定流速上樣，即在整個層析過程中，無論是2柱串聯(lián)上樣還是單柱上樣，上樣流速均保持不變。不過，對于PCC模式，需要合理匹配上樣過程和洗脫再生過程。若洗脫再生時間較長時，則通過增加層析柱數(shù)來分攤洗脫再生的時間，保證上樣過程中不會有蛋白損失；若上樣時間較長，洗脫再生完畢后，層析柱需要等待，直至上樣完成。對于雙柱CaptureSMB模式，則一般通過計算上樣量，利用降低單柱上樣的流速來匹配洗脫再生步驟，從而實現(xiàn)過程優(yōu)化。

(3) 3~16柱連續(xù)流層析和BioSMB

Pall公司開發(fā)了Cadence BioSMB連續(xù)流層析系統(tǒng)，使用獨特的一次性閥系統(tǒng)，可以實現(xiàn)復(fù)雜的流路設(shè)計，滿足3~16根層析柱的連續(xù)流層析。BioSMB系統(tǒng)最簡單的3柱連續(xù)流層析與3C-PCC技術(shù)類似，差異主要在沖洗階段，如Step 2步驟，BioSMB系統(tǒng)將1#柱和2#柱的出口并聯(lián)，共同接入3#柱，這樣可以保證2#柱中蛋白不會出現(xiàn)穿透的風(fēng)險。待1#柱沖洗完畢，斷開1#柱與3#柱，2#柱與3#柱繼續(xù)串聯(lián)上樣，1#柱則進行R-R步驟。對于BioSMB系統(tǒng)，當再生時間較長、上樣時間較短的情況下，可以通過增加層析柱，將洗脫再生步驟時間分攤到幾根層析柱上，可以避免因再生時間較長而導(dǎo)致蛋白從層析柱中穿透而損失。

圖4 4柱連續(xù)流層析(4C-PCC)捕獲蛋白示意圖

(4) 多柱序列層析和SMCC技術(shù)

Novasep公司開發(fā)BioSC系統(tǒng)，也稱作多柱序列層析(sequential multicolumn chromatography，SMCC)，適用于4~8根層析柱。以4根層析柱為例介紹SMCC操作方式。將前3根層析柱(1#、2#和3#)串聯(lián)，進行上樣，4#柱進行R-R步驟；當4#柱再生完畢，接到3#柱后，此時1#柱已飽和吸附，將未吸附的蛋白沖洗到后續(xù)層析柱后，1#柱與后續(xù)層析柱斷開；1#柱進行R-R步驟；2#、3#和4#柱串聯(lián)進行上樣。每根層析柱交替完成層析過程的所有步驟，恢復(fù)到初始狀態(tài)，完成一個循環(huán)。BioSC系統(tǒng)采用3根層析柱串聯(lián)進行上樣，能充分保證蛋白不會從層析柱中穿透。若蛋白濃度較高，且R-R步驟的時間較長，3柱串聯(lián)仍可能導(dǎo)致蛋白從層析柱中穿透，此時可以添加層析柱。但是，隨串聯(lián)層析柱增加，會造成床層壓力升高，容易引起介質(zhì)坍塌，可以使用較小的線性流速或者較短的層析柱。

與傳統(tǒng)批次層析相比，連續(xù)流層析利用多柱串聯(lián)上樣，提高了介質(zhì)的利用率和過程產(chǎn)率，減少介質(zhì)消耗，同時降低緩沖液等物料消耗，減少了廢液排放。但是，需要注意的是，連續(xù)流層析過程較為復(fù)雜，以上幾種模式各有優(yōu)缺點，還需進一步優(yōu)化設(shè)計。此外，連續(xù)流層析的影響因素較多，包括系統(tǒng)本身、工藝條件以及層析介質(zhì)等，利用層析模型進行預(yù)測分析，系統(tǒng)評價關(guān)鍵參數(shù)對連續(xù)捕獲的影響，將有助于連續(xù)流層析過程的理性設(shè)計。

2.3 抗體連續(xù)捕獲的應(yīng)用和發(fā)展

蛋白A親和層析介質(zhì)價格昂貴[21-22]，采用連續(xù)流層析進行抗體捕獲，可顯著提高介質(zhì)和設(shè)備利用率，增大過程產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。近年來，多個研究機構(gòu)和公司都在研發(fā)連續(xù)捕獲工藝，既有實驗室小試，又有中試嘗試。

Angarita等[23]對動物細胞表達的單抗進行CaptureSMB雙柱連續(xù)流親和捕獲，相較于常規(guī)批次層析過程，產(chǎn)率提高38%，介質(zhì)用量減少28%。高宗曄等[24]以兩款蛋白 A 親和層析介質(zhì)為對象，比較CaptureSMB與常規(guī)批次過程的差異，結(jié)果表明在低保留時間下動態(tài)載量高的介質(zhì)具有優(yōu)勢，過程效果顯著提升，產(chǎn)率提高約40%，介質(zhì)利用率提高約25%，緩沖液消耗下降約40%。Godawat等[25]采用?KTA pcc 75系統(tǒng)，對動物細胞表達的單抗進行3C-PCC 3柱連續(xù)流親和捕獲，與常規(guī)批次層析相比，連續(xù)流過程的介質(zhì)利用率增加30%，緩沖液消耗減少80%，同時柱體積減小26倍。Gjoka等[26]采用Cadence BioSMB系統(tǒng)，建立了多柱連續(xù)流親和捕獲工藝，相較于常規(guī)批次過程，根據(jù)上樣步驟所連接的柱數(shù)量不同，產(chǎn)率提高40%~50%。

Angelo等[27]將實驗室規(guī)模的CaptureSMB雙柱連續(xù)流親和層析放大100倍，采用EcoPrime Twin 100系統(tǒng)進行中試驗證，結(jié)果表明連續(xù)分離的宿主細胞蛋白去除、DNA殘留、蛋白A配基泄漏和抗體純度等均與批次過程相當，產(chǎn)率可提高1.8~2.5倍，介質(zhì)利用率從67% 提高到92%，緩沖溶液消耗節(jié)省一半。Otes等[28]將實驗室規(guī)模的Cadence? BioSMB PD系統(tǒng)(5.65 mL層析柱)放大至Cadence? BioSMB Process 80 system系統(tǒng)(200 mL層析柱)，中試實驗結(jié)果與小試規(guī)模相同，相比于批次過程，產(chǎn)率提高400%~500%。Pollock等[29]從成本和操作可行性出發(fā)，對早期臨床、后期臨床及商業(yè)化生產(chǎn)3個階段的PCC多柱連續(xù)流親和層析進行預(yù)測分析，結(jié)果表明早期臨床階段的成本構(gòu)成對連續(xù)流技術(shù)最為敏感，應(yīng)用連續(xù)流親和捕獲可以節(jié)省約30% 成本。

3 精制階段的連續(xù)流層析

抗體精制的目標在于去除微量雜質(zhì)，包括宿主細胞蛋白、DNA、抗體片段、聚體、異質(zhì)體等，一般采用離子交換層析、疏水相互作用層析和混合模式層析。精制階段連續(xù)流層析的相關(guān)研究相對較少，原理和模式差別較大，以下分別介紹。

3.1 MCSGP模式

在蛋白梯度洗脫分離中，常會遇到目標主峰P和相似組分無法完全分離的情況，包括交疊的前峰雜質(zhì)W和后峰雜質(zhì)S。通過分離條件優(yōu)化，如減小流速、放緩梯度和減小介質(zhì)粒徑等，可以一定程度上提高分離度，但常常難以達到完全分離[30-34]。因此，常規(guī)的單柱層析分離必然存在純度和收率之間的矛盾：若要保證產(chǎn)品純度，就必須減小產(chǎn)品收集區(qū)間，導(dǎo)致收率較低；若想得到較高的收率，需要增大收集區(qū)間，純度就必然下降。為此，Steinebach等[35]提出了一個連續(xù)流層析的解決方案：通過收集主峰和雜質(zhì)峰的交疊區(qū)間，實現(xiàn)循環(huán)上樣，稱為多柱逆流溶劑梯度純化(multicolumn counter-current solvent gradient purification, MCSGP)。雙柱MCSGP的具體操作步驟見圖5，根據(jù)峰形分布，柱1適時收集高純度的目標蛋白區(qū)間P，前峰交疊區(qū)W和后峰交疊區(qū)S經(jīng)在線稀釋后相繼進入后續(xù)柱2，與新鮮料液一起通過柱2進一步實現(xiàn)分離，柱1經(jīng)清洗和再生，兩柱交替換位，從而實現(xiàn)連續(xù)性分離。雙柱連續(xù)流層析系統(tǒng)Contichrom? CUBE combined整合了 MCSGP分離模式，相應(yīng)推出制備生產(chǎn)級的MCSGP連續(xù)流層析系統(tǒng)，可以自動實現(xiàn)多柱切換和在線稀釋。

圖5 雙柱MCSGP連續(xù)流層析分離示意圖

MCSGP連續(xù)分離模式，在保證目標物純度的同時，顯著提高收率，特別適合于性質(zhì)相似組分的分離，已應(yīng)用于抗體電荷異質(zhì)體、抗體聚集體、雙特異性單抗、多肽等分離純化[36-38]。Müller-Sp?th等[39]利用MCSGP分離單抗異質(zhì)體，結(jié)果表明MCSGP的分離效果明顯優(yōu)于單柱批次過程，目標單抗的純度及收率均達到93%。Steinebach等[35]簡化了MCSGP操作，用于單抗電荷異質(zhì)體分離，經(jīng)優(yōu)化后單抗主體蛋白純度和收率均大于90%。Vogg等[40]以目標蛋白的純度和收率作為評價指標，對MCSGP過程參數(shù)進行評價，結(jié)果表明收集區(qū)段的選取對目標蛋白純度有決定性作用。

3.2 雙柱批次循環(huán)模式

Persson等[41]提出雙柱批次循環(huán)模式(two-column batch-to-batch recirculation)。與MCSGP的“交疊組分循環(huán)上樣”思路相似，該模式也使用2根層析柱，柱1適時收集高純度的目標蛋白區(qū)間P，前峰交疊區(qū)W和后峰交疊區(qū)S經(jīng)在線稀釋后相繼進入后續(xù)柱2，與新鮮料液一起通過柱2進一步實現(xiàn)分離。不同于MCSGP模式的1套設(shè)備運轉(zhuǎn)2根層析柱，該模式采用2臺單柱層析設(shè)備(?KTA explore 100)，每臺設(shè)備運轉(zhuǎn)1根層析柱，借助三通閥將2臺設(shè)備進行耦合。Persson等[41]采用該模式對核糖核酸酶A、細胞色素C和溶菌酶的混合物進行分離，建立層析模型對參數(shù)進行優(yōu)化，結(jié)果表明可減少產(chǎn)物損失并提高產(chǎn)物純度，經(jīng)20個周期的循環(huán)分離后，在保證細胞色素C純度大于90% 前提下，收率由單柱批次層析的45.4% 提高至93.6%，產(chǎn)率提高3.4倍。該模式使用常規(guī)層析設(shè)備進行改造，但切換閥等部件較多，控制單元比較復(fù)雜，具有一定的局限性。

3.3 多柱置換層析模式

Khanal等[42]將置換層析與連續(xù)流層析相結(jié)合，提出了多柱置換層析(multi-column displacement chromatography)，構(gòu)建了一套由3根層析柱構(gòu)成的連續(xù)流層析系統(tǒng)，用于分離單抗電荷異質(zhì)體。

單抗電荷異質(zhì)體分為堿性異質(zhì)體和酸性異質(zhì)體，其中前者的等電點比主體蛋白(P)高，與陽離子交換介質(zhì)的結(jié)合能力強，即為強吸附組分(S)；后者的等電點比主體蛋白低，與陽離子交換介質(zhì)的結(jié)合能力弱，即為弱吸附組分(W)。首先將3根層析柱串聯(lián)，對1#柱上樣，在上樣量大于介質(zhì)載量的情況下，料液中的強吸附組分會把主體蛋白及弱吸附組分置換出來，根據(jù)結(jié)合能力強弱，強吸附組分、主體蛋白和弱吸附組分分別主要分布于1#、2#和3#柱中，每根柱中均存在交疊組分；用平衡緩沖液進行沖洗，使1#和2#柱中未結(jié)合的殘留蛋白進入3#柱，以減少蛋白損失；然后將3根層析柱斷開，分別對1#和2#柱進行洗脫，此時3#柱中主要為弱吸附組分和主體蛋白；接著將3根層析柱重新連接，反向從3#柱開始上樣，通過這種方式，將第1個循環(huán)中未洗脫的3#柱內(nèi)的弱吸附組分和主體蛋白循環(huán)上樣，提高主體蛋白的收率。結(jié)果表明，將堿性異質(zhì)體和主體蛋白作為自置換劑，實現(xiàn)了主體蛋白的富集，在滿足主體蛋白90%純度的基礎(chǔ)上，收率從65%提高到90%。

3.4 不同層析過程組合的連續(xù)精制純化

將精制純化階段的不同層析單元進行整合，建立連續(xù)精制層析工藝，不僅提高分離效率，還可以減少中間儲罐的使用，節(jié)省工藝時間與費用。

Kateja等[43]利用一臺?KTA層析設(shè)備對2根層析柱進行串聯(lián)上樣，單抗樣品經(jīng)陽離子交換層析柱分離后，通過三通閥加入緩沖液實現(xiàn)在線調(diào)節(jié)離子強度，之后進入混合模式層析柱進行分離，去除電荷異質(zhì)體和聚集體，純化時間從12縮短至6 h。對純化后的單抗進行檢測，結(jié)果表明聚體含量少于1%，宿主細胞蛋白小于10′10-6，DNA含量小于5′10-9。

L?fgren等[44]將陰離子交換層析、病毒滅活和疏水相互作用層析3步純化單元整合并實現(xiàn)連續(xù)化操作，采用1臺?KTA層析系統(tǒng)裝配2根層析柱分別用于陰離子交換層析和疏水相互作用層析，使用Superloop上樣器進行病毒滅活。通過連續(xù)精制純化，整個純化工藝由7步減少為2步，縮減了生產(chǎn)時間與費用。

4 抗體制備的整合連續(xù)流層析過程

將捕獲階段與精制階段進行整合，構(gòu)建全流程的整合連續(xù)流層析，可以顯著提高過程效率。

Girard等[45]通過3柱SMCC系統(tǒng)，將蛋白A親和層析和離子交換層析2個單元進行整合，結(jié)果表明捕獲階段蛋白A親和層析的產(chǎn)率從0.39提高至1.77 kg×(L×d)-1，精制階段離子交換層析的產(chǎn)率從1.0提高至6.1 kg×(L×d)-1，分別提高了4.5和6.1倍。

Gjoka等[46]通過2臺Cadence BioSMB PD系統(tǒng)，實現(xiàn)了蛋白A親和層析、病毒滅活、陰離子交換層析(流穿模式)和混合模式陽離子交換層析4個單元的整合，將傳統(tǒng)批次過程轉(zhuǎn)換為連續(xù)化生產(chǎn)，可減少95% 的蛋白A及混合模式介質(zhì)的使用，緩沖液消耗減少44%。對于捕獲階段，產(chǎn)率從13提高至50 g×(L×h)-1；對于混合模式層析階段，產(chǎn)率從10提高至60 g×(L×h)-1。

將下游連續(xù)流層析系統(tǒng)與上游灌流細胞培養(yǎng)相耦合，可以實現(xiàn)抗體的全流程連續(xù)生產(chǎn)，從而提高單抗質(zhì)量的穩(wěn)定性和生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本[47-48]。Warikoo等[49]對上下游整合進行了嘗試，利用PCC連續(xù)流層析系統(tǒng)，構(gòu)建了與灌流生物反應(yīng)器組合的連續(xù)捕獲，不間斷地運行30 d，結(jié)果表明產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。在此基礎(chǔ)上，Godawat等[50]進一步擴展為端到端的全流程整合連續(xù)系統(tǒng)，細胞培養(yǎng)液經(jīng)過濾后泵入一次性緩沖罐中，然后進行連續(xù)捕獲層析、病毒滅活，過濾、連續(xù)精制層析、膜層析，最后得到單抗原液。該工藝采用封閉系統(tǒng)以減少污染的風(fēng)險，自動化操作保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性，提高生產(chǎn)效率和靈活性，降低成本。

5 抗體連續(xù)生產(chǎn)的難點及展望

作為一項新興技術(shù)，抗體連續(xù)生產(chǎn)具有顯著優(yōu)勢，是生物制藥發(fā)展的必然趨勢[51]。但是，實現(xiàn)抗體連續(xù)生產(chǎn)，除了法規(guī)部門的監(jiān)管因素外，在過程設(shè)計、過程分析和過程控制等方面仍存在嚴峻的挑戰(zhàn)。

5.1 過程設(shè)計

連續(xù)流層析模式較多，操作復(fù)雜，過程參數(shù)多，優(yōu)化設(shè)計較為困難。對連續(xù)流層析建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化過程參數(shù)，可輔助過程設(shè)計與放大。Ng等[52]分別建立了單柱及多柱SMCC連續(xù)流親和捕獲模型，借助模型進行過程優(yōu)化，將最優(yōu)產(chǎn)率從傳統(tǒng)批次層析的2.9提高到4.0 kg×d-1。Shi等[20]建立了連續(xù)捕獲的數(shù)學(xué)模型與設(shè)計方法，對CaptureSMB過程進行綜合分析，針對過程產(chǎn)率和介質(zhì)利用率雙指標進行優(yōu)化，確定合適的保留時間和穿透點比例。為了更好地比較不同模式的連續(xù)流層析，林東強等[53]提出基于層析模型的連續(xù)流層析設(shè)計及優(yōu)化策略，見圖6，系統(tǒng)分析連續(xù)流層析操作參數(shù)和設(shè)計參數(shù)對分離性能的影響，得到過程產(chǎn)率和介質(zhì)利用率分布圖，合理設(shè)計連續(xù)流層析的操作空間，顯著提高連續(xù)流層析過程開發(fā)效率，并進一步研發(fā)了集成軟件包，輔助不同模式連續(xù)捕獲的過程設(shè)計[54-55]。在此基礎(chǔ)上，為了提高數(shù)據(jù)處理和復(fù)雜優(yōu)化的能力，林東強等[56]引入人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial neural network, ANN)，采用ANN替代機理模型進行穿透曲線的擬合和預(yù)測，在保證計算精度的情況下，加快了運算速度，有利于多維的參數(shù)分析和優(yōu)化，實現(xiàn)連續(xù)流層析的綜合優(yōu)化，同時也研發(fā)了相應(yīng)的集成軟件包[57]。Sellberg等[58]針對MCSGP過程建立了單柱模擬，以實現(xiàn)對連續(xù)分離過程的動態(tài)優(yōu)化，結(jié)果表明借助模型對操作條件進行優(yōu)化，目標蛋白純度可以提高到95%，收率達99%。鑒于連續(xù)流層析的復(fù)雜性，采用合適的模型，引入先進的數(shù)據(jù)處理方法，將有助于過程的合理設(shè)計和優(yōu)化。

圖6 基于層析模型的連續(xù)流層析設(shè)計及優(yōu)化[53]

5.2 過程分析技術(shù)

連續(xù)生產(chǎn)過程中，料液連續(xù)輸入，產(chǎn)品連續(xù)輸出，其中任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，均會對整批產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生重要影響。因此，連續(xù)生產(chǎn)的關(guān)鍵在于確保每一環(huán)節(jié)中間產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性合格且均一穩(wěn)定，即需要對各環(huán)節(jié)進行實時監(jiān)測[59-62]。

為了便于藥物生產(chǎn)的質(zhì)量控制，2004年FDA開始倡導(dǎo)過程分析技術(shù)(process analytical technology, PAT)，即通過及時測量樣品、中間產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，對藥物生產(chǎn)過程進行評估和控制，以確保終產(chǎn)品的質(zhì)量[63]。對于連續(xù)分離過程，目前仍主要依賴于紫外檢測器進行監(jiān)控，缺乏實時、高效的PAT技術(shù)。紫外檢測過于單一，無法全面反映蛋白的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，若中間產(chǎn)品存在偏差將極有可能導(dǎo)致整批產(chǎn)品的浪費，而取樣離線檢測耗時過長，無法實現(xiàn)快速分析，難以滿足連續(xù)分離的監(jiān)測需求[64]。因此，研發(fā)新型過程分析技術(shù)十分重要，如拉曼光譜、近紅外光譜等，一方面發(fā)展小型化、快速化、可靠的過程分析設(shè)備，另一方面需要考慮復(fù)雜組分的分析，以及取樣策略等對連續(xù)過程的影響[65-67]。

5.3 過程控制技術(shù)

高效的過程控制是維護連續(xù)過程穩(wěn)定運行的保障[68-69]，其中關(guān)鍵點包括下游捕獲與上游細胞培養(yǎng)的銜接、連續(xù)層析的預(yù)測控制、全流程的集成控制。

下游親和層析捕獲與上游細胞培養(yǎng)(如灌流培養(yǎng))的銜接是整合連續(xù)過程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。主要問題在于灌流培養(yǎng)輸出的蛋白料液濃度是變化的[70-72]，料液濃度的波動將會直接影響蛋白穿透曲線，從而影響蛋白A親和捕獲的過程控制。?KTA pcc系統(tǒng)在層析柱之前和之后分別設(shè)置紫外檢測器，在線監(jiān)測單抗UV值的疊加響應(yīng)，以控制合適的穿透比例設(shè)定值，稱為DUV控制；Contichrom? CUBE combined系統(tǒng)則只在柱后檢測單抗UV值的疊加響應(yīng)，通過計算單抗穿透曲線的積分面積，以控制合適的上樣量，稱為AutomAb控制。這2種控制策略，一定程度上可以適應(yīng)料液蛋白濃度的小幅波動，但歸根結(jié)底是通過監(jiān)測UV的被動控制。如果采用層析模型對當前時刻的穿透曲線進行擬合，并對后續(xù)柱的穿透曲線進行預(yù)測評估，提前進行過程參數(shù)調(diào)整，就可以提高控制的精準性和可靠性。預(yù)測控制的關(guān)鍵在于建立合適的模型，對監(jiān)測數(shù)據(jù)進行快速處理分析，并對后續(xù)數(shù)據(jù)進行預(yù)測評估和比對，模型質(zhì)量將直接影響控制決策，進一步影響工藝流程的適用性與穩(wěn)健性。

對于連續(xù)過程，各單元之間沒有等待和緩沖，各步驟操作的精準性和時效性要求很高。以MCSGP模式為例，對于相似組分的分離純化，分離條件的微小改變均有可能對層析柱內(nèi)的分離性能產(chǎn)生影響，進而導(dǎo)致實際循環(huán)再分離的組分發(fā)生變化，從而影響產(chǎn)品純度與收率。此外，每個循環(huán)中切割的交疊組分，隨循環(huán)次數(shù)的增加而發(fā)生細微改變，若采取恒定的控制模式將產(chǎn)生偏差，難以實現(xiàn)對目標組分的準確分離。因此，需要加強對連續(xù)層析過程的認識，建立高預(yù)測性、高穩(wěn)健性、高響應(yīng)性的模型以實現(xiàn)預(yù)測控制，通過實時調(diào)整關(guān)鍵操作參數(shù)，實現(xiàn)穩(wěn)定的過程控制。近年來，越來越多的研究集中于建立層析模型以實現(xiàn)不同條件下分離效果的預(yù)測，提高控制效率[73-76]。針對傳統(tǒng)批次層析的模型已較為成熟，能夠較好地對分離效果進行預(yù)測，快速優(yōu)化合適的操作參數(shù)，對過程中出現(xiàn)的各種波動及時進行自動調(diào)整，從而增強層析系統(tǒng)的穩(wěn)健性[77-79]。但是，連續(xù)過程更加復(fù)雜，關(guān)鍵參數(shù)眾多，建立合適模型的難度較大，有待進一步研發(fā)。

對于整合的單抗全流程連續(xù)生產(chǎn)，F(xiàn)eidl等[80]研發(fā)了數(shù)據(jù)采集及監(jiān)控系統(tǒng)(supervisory control and data acquisition system, SCADA)，組合了在線和離線檢測，收集并集中存儲所有過程數(shù)據(jù)，對整個過程進行監(jiān)測和控制，實現(xiàn)各個單元的優(yōu)化協(xié)調(diào)和集成控制，包括灌流細胞培養(yǎng)、CaptureSMB連續(xù)流親和捕獲、病毒滅活和兩步精制層析分離，實現(xiàn)了連續(xù)10 d的穩(wěn)定運行。結(jié)果表明，全流程的集成控制有助于應(yīng)對連續(xù)生產(chǎn)過程的干擾和漂移，實現(xiàn)穩(wěn)健的工藝控制，保障穩(wěn)定的產(chǎn)品質(zhì)量。

6 結(jié) 語

對于單抗等生物醫(yī)藥行業(yè)，連續(xù)化生產(chǎn)是自動化、智能化升級的必由之路，也是發(fā)展的必然趨勢。連續(xù)流層析是下游連續(xù)化生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，能夠提高過程效率、增強產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性、提高工藝的靈活性，還可以減少人為操作的失誤風(fēng)險，降低設(shè)備及試劑費用和人工成本。對于抗體親和捕獲，多種連續(xù)流層析模式已經(jīng)成功研發(fā)，并應(yīng)用于單抗產(chǎn)品的連續(xù)捕獲，但仍需加強過程的理性設(shè)計和優(yōu)化。對于抗體精制階段，研究主要集中于2個方面，利用交疊組分循環(huán)上樣以提高收率，或者將幾步層析整合以簡化流程，但相關(guān)研究還有待進一步完善。對于全流程的整合連續(xù)過程，目前仍處于發(fā)展階段。

作為一項新興技術(shù)，抗體連續(xù)生產(chǎn)具有顯著優(yōu)勢，但真正實現(xiàn)抗體連續(xù)生產(chǎn)還有不少方面需要深入研究，包括更加理性的過程設(shè)計、更加高效的過程分析技術(shù)、更加精準的過程控制，特別是基于模型的預(yù)測分析和控制方法。

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Progress on continuous chromatography and its application in antibody separation

JING Shu-ying, SHI Ce, YAO Shan-jing, LIN Dong-qiang

(Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

Continuous chromatography is a key unit of continuous biomanufacturing which is the trend in biopharmaceutical industry. The continuous chromatographic technologies for protein capture and polishing were reviewed based on recent research progress. Technical differences, characteristics and current applications of different separation modes are focused. Integrated continuous chromatography is introduced and the challenges for continuous production of antibodies are discussed considering future development. Continuous manufacturing has the potentials to increase productivity and product quality, reduce footprint and costs, and enhance process automatization, flexibility and reliability. However, more studies such as process design, process analytical and control technologies, are necessary to improve continuous manufacturing processes, especially for model-based predictive analysis and control strategies.

continuous chromatography; antibody; capture; polishing; process integration; process analytical technology

TQ028.8

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2021.01.001

1003-9015(2021)01-0001-12

2020-03-20；

2020-05-26。

國家自然科學(xué)基金(21776243，22078286)；上海市產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級發(fā)展專項資金(工業(yè)強基GYQJ-2018-02-01)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金。

荊淑瑩(1995-)，女，河南新鄉(xiāng)人，浙江大學(xué)博士生。

林東強，E-mail：lindq@zju.edu.cn