鄧寒冰 李春琴 張 粲 金祖敏

(1.?？谑械谌嗣襻t(yī)院針灸理療科,海口 571100;2.海南醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院針灸科,?？?571100;3.云南中醫(yī)藥大學(xué)推拿基礎(chǔ)教研室,昆明 650500;4.貴州織金縣中醫(yī)院治未病科,貴州畢節(jié) 552100)

腦卒中屬臨床常見心腦血管疾病,致殘率、復(fù)發(fā)率、致死率均較高[1],修復(fù)神經(jīng)元、緩解小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)等可改善腦卒中[2]。電針刺激可緩解神經(jīng)疼痛、促進(jìn)受損神經(jīng)功能[3],但具體機(jī)制尚未清楚。激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-bindingoligomerizationdomain-like receptor protein 3,NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(ccysteine aspartate proteolytic enzyme 1,caspase-1)通路可在組織損傷、器官功能障礙中發(fā)揮作用[4],抑制NLRP3/caspase-1 通路在小膠質(zhì)細(xì)胞中可減緩炎癥反應(yīng),從而緩解脊髓損傷處后肢運(yùn)動功能[5],但尚未發(fā)現(xiàn)腦卒中中相關(guān)研究。本研究采用Longa 線栓法改良建立腦卒中大鼠模型,探究三種不同電針方法對腦卒中大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元的影響,觀察是否均有影響,以期為臨床上緩解腦卒中提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

60 只清潔級健康SD 大鼠、6～7 周齡,雌雄不限,購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(豫)2017-0001],飼養(yǎng)于海南省藥品檢驗(yàn)所[SYXK(瓊)2016-0009]。體重(200±20)g,所有大鼠均在溫度(25±1)℃、濕度(55±5)%、12 h/12 h(黑暗/光照)在實(shí)驗(yàn)動物中心常規(guī)飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理協(xié)會審核并通過(20170018),并按3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

尼氏染色液(北京索萊寶科技有限公司,批號:20180118);Tunel 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)(碧云天科技有限公司,批號:20170209);一抗Iba1(羊抗鼠)、ED-1(兔抗鼠)、NLRP3(兔抗鼠)、caspase-1(兔抗鼠)、pro-caspase-1(兔抗鼠)、內(nèi)參GADPH(兔抗鼠)、二抗羊抗兔、Alaxa Fluor? 555抗羊熒光二抗、Alexa Fluor? 594 抗兔熒光二抗(英國abcam,批號:20180415、20170519、20160114、20180408、20180408、20160112、20170803、20180418、20160111);電針儀(四川科儀誠科技有限公司,型號:6805-D);蛋白凝膠成像儀(上海天能公司,型號:Tanon 3500/3500R)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物建立腦卒中模型

48 只大鼠據(jù)參考文獻(xiàn)[6]按照Longa 線栓法改良建立大鼠腦卒中模型,3% 戊巴比妥鈉(0.5 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,大鼠右側(cè)側(cè)臥于手術(shù)臺上,去左頸部鼠毛并用醫(yī)用乙醇消毒,切開皮膚分離出左側(cè)頸總動脈、頸外動脈并結(jié)扎。參考文獻(xiàn)[7]分離頸內(nèi)動脈,在頸內(nèi)動脈與頸外動脈分叉膨大處切口,尼龍線插入頸內(nèi)動脈切口端,長度20 mm,插線結(jié)束后尼龍線與頸內(nèi)動脈結(jié)扎。傷口處和皮膚逐層縫合,并注射青霉素防止感染。術(shù)后2 h Longa 驗(yàn)證模型成功與否,其中1～3 分為建模成功,模型成功率100%。模型組大鼠隨機(jī)分為4 組,模型組、陽陵泉+配穴組、關(guān)元組、照海+申脈組,每組12只;12 只健康大鼠不結(jié)扎、不切口不插線,其余步驟相同,對照稱為假手術(shù)組。

1.3.2 電針刺激模型動物

大鼠建模3 d 陽陵泉+配穴組、關(guān)元組、照海+申脈組,參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]對實(shí)驗(yàn)動物陽陵泉+配穴、關(guān)元、照海+申脈針灸穴位處取穴電針刺激,將針灸針分別連接電針儀,電壓2～4 V,頻率2/100 Hz、脈沖寬度0.5 ms、疏波4 Hz,逐漸加大強(qiáng)度直至大鼠出現(xiàn)輕微顫抖為度,留針30 min,每天一次,7 d為一個(gè)療程,連續(xù)進(jìn)行兩個(gè)療程。模型組、假手術(shù)組不進(jìn)行任何處理,飼養(yǎng)相同天數(shù)。

1.3.3 Longa 評分評價(jià)電針對腦卒中大鼠行為學(xué)的影響

Longa 評分法[6]評價(jià)大鼠模型成功和電刺激后評價(jià)大鼠神經(jīng)損傷程度。

1.3.4 電針對腦卒中大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉大鼠,每組隨機(jī)取6 只,迅速處死大鼠,取全腦組織,4%多聚甲醛灌注固定,取腦組織損傷處切片(5 μm),免疫熒光染色小膠質(zhì)細(xì)胞,Iba1(1 ∶500)和ED-1(1 ∶200)混合(1 ∶1)稀釋,4℃過夜,添加抗羊(1 ∶1000)、抗兔(1 ∶200)熒光二抗混合液,室溫孵育2 h,PBS 清洗,抗熒光猝滅液(含DAPI)封片后熒光顯微鏡下觀察,其中Iba1 染色紅色,代表小膠質(zhì)細(xì)胞;ED-1 染色綠色,代表被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞。

1.3.5 電針對腦卒中大鼠神經(jīng)元形態(tài)的影響

取1.3.4 中切片,尼氏染色觀察神經(jīng)元形態(tài),石蠟切片梯度乙醇復(fù)染、二甲苯脫蠟、梯度乙醇浸潤,切片進(jìn)入A 液(cresyl violet stain)中56℃染色60 min,PBS 漂洗,置于B 液(Nissl differentiation)分色數(shù)秒至2 min 直至背景色接近無色,晾干,無水乙醇脫水,二甲苯透明,樹膠封片,顯微鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)、尼氏小體情況。

1.3.6 Tunel 染色觀察電針對腦卒中大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

取1.3.4 中切片脫蠟處理,滴加2%蛋白酶K室溫孵育20 min,PBS 清洗后滴加50 μL Tunel 反應(yīng)混合溶液,濕盒孵育60 min,抗熒光猝滅液(含DAPI)封片后熒光顯微鏡下觀察,其中綠色熒光顯示凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量。

1.3.7 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測觀察電針對腦卒中大鼠NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白的影響

其余大鼠麻醉后迅速處死,模型組部分取腦卒中組織,假手術(shù)組取腦組織相同部位,蛋白提取試劑盒提取總蛋白,每孔上樣20 μL 測定樣本中NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平,一抗NLRP3(1/100000)、pro-caspase-1(1/2000)、caspase-1(1/100000)、GADPH(1/5000),4℃孵育過夜;加入對應(yīng)二抗,室溫孵育1 h。DAB 顯色試劑盒顯色,蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()描述,多組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q法檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05 時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對腦卒中大鼠行為學(xué)影響

與假手術(shù)組比較,模型組Longa 評分升高(P<0.05)。與模型組相比,陽陵泉+配穴組、關(guān)元組、照海+申脈組Longa 評分降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 電針對腦卒中大鼠Longa 評分的影響Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Compared with the sham operation group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 1 Effect of electroacupuncture on Longa score of stroke rats

2.2 電針對腦卒中大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

假手術(shù)組小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)“雙極或單極”狀態(tài),伴隨細(xì)長突起,細(xì)胞形狀類似。模型組小膠質(zhì)細(xì)胞突起明顯增多,Iba1/ED-1 顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)。電針刺激后,陽陵泉+配穴組、關(guān)元組、照海+申脈組較模型組小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù),突起逐漸恢復(fù),Iba1/ED-1 顯著低于模型組(P<0.05)。見圖2。

2.3 電針對腦卒中大鼠神經(jīng)元形態(tài)的影響

假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則,結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞內(nèi)可見豐富的尼氏小體。模型組神經(jīng)元出現(xiàn)明顯皺紋,形狀不規(guī)則、染色較淺,尼氏小體數(shù)量顯著少于假手術(shù)組(P<0.05)。電針刺激后,陽陵泉+配穴組、關(guān)元組、照海+申脈組較模型組神經(jīng)形態(tài)有所改善,神經(jīng)元形態(tài)較飽滿,尼氏小體數(shù)量顯著多于模型組(P<0.05)。見圖3。

圖2 電針對對腦卒中大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1/ED-1 的影響Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Arrows indicated prominent parts.Asterisks indicated normal nerve cells.Compared with the sham operation group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 2 Effect of electroacupuncture on Iba1/ED-1 of microglia in rats with stroke

2.4 電針對腦卒中大鼠腦組織NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平的影響

與假手術(shù)組相比,模型組腦組織中NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平升高(P<0.05)。電針刺激后,與模型組相比,陽陵泉+配穴組、關(guān)元組、照海+申脈組腦組織中NLRP3、caspase-1、procaspase-1 蛋白水平降低(P<0.05)。見圖4。

2.5 電針對腦卒中大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

與假手術(shù)組相比,模型組Tunel 陽性細(xì)胞數(shù)升高(P<0.05)。電針刺激后,與模型組相比,陽陵泉+配穴組、關(guān)元組、照海+申脈組Tunel 陽性細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)。見圖5。

圖3 電針對腦卒中大鼠神經(jīng)元形態(tài)的影響(尼氏染色)Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Compared with the sham operation group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 3 Effect of electroacupuncture on neuron morphology in stroke rats (Nissl staining)

圖4 電針對腦卒中大鼠腦組織NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平的影響Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Compared with the sham operation group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 4 Effect of electroacupuncture on the levels of NLRP3,caspase-1 and pro-caspase-1 protein in brain tissue of stroke rats

圖5 電針對腦卒中大鼠神經(jīng)元凋亡的影響Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Green,Tunel positive cell number.Blue,DAPI(Tunel staining).Compared with the sham operation group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 5 Effect of electroacupuncture on neuron apoptosis in stroke rats

3 討論

腦卒中可激活小膠質(zhì)細(xì)胞,加快神經(jīng)毒素的產(chǎn)生;可快速改變神經(jīng)元活動和突觸功能,改變本身作用,產(chǎn)生神經(jīng)毒素和改變神經(jīng)元功能均加重疾病[9-10],因此緩解小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)、減緩神經(jīng)元凋亡可能緩解疾病。本文以Longa 線栓法改良建立缺血性腦卒中模型,研究發(fā)現(xiàn)建模后小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞突起增多,Iba1/ED-1 升高;神經(jīng)元出現(xiàn)形狀不規(guī)則、明顯皺紋、尼氏染色較淺現(xiàn)象,尼氏小體數(shù)量減少、Tunel 陽性細(xì)胞數(shù)升高,而尼氏小體正常情況下能被堿性染料染成藍(lán)紫色,當(dāng)神經(jīng)元受到刺激時(shí),尼氏小體數(shù)量減少,可反映神經(jīng)元受刺激程度;Tunel陽性細(xì)胞數(shù)反映神經(jīng)元凋亡數(shù)量,細(xì)胞數(shù)越多凋亡越嚴(yán)重。提示腦卒中模型中小膠質(zhì)細(xì)胞被激活、突起改變,神經(jīng)元刺激嚴(yán)重,出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,小膠質(zhì)細(xì)胞原本結(jié)構(gòu)破壞、神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡。

腦卒中中醫(yī)屬“中風(fēng)”范疇,東漢張仲景提出“絡(luò)脈空虛”,氣血兩虛、淤血阻絡(luò)是病機(jī)之本,養(yǎng)陰益氣、活血化瘀是治療方案[11]。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為,針灸是一種刺激,作用于腧穴,疏通經(jīng)絡(luò)、清淤散結(jié)、驅(qū)散陰寒,達(dá)回陽救逆、強(qiáng)身健體、預(yù)防疾病之功效[12]。本研究采用三種不同針刺方法探究對對腦卒中大鼠的影響,發(fā)現(xiàn)陽陵泉聯(lián)合配穴、關(guān)元、照海聯(lián)合申脈均可改善小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和神經(jīng)形態(tài),同時(shí)使神經(jīng)元由激活狀態(tài)轉(zhuǎn)化為正常狀態(tài),緩解神經(jīng)元凋亡,從而改善腦卒中病情。

NLRP3 炎癥小體被激活可直接與效應(yīng)分子pro-caspase-1 結(jié)合形成炎癥小體和成熟的caspase1,其中caspase1 可影響小膠質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞凋亡從而影響疾病進(jìn)程[13];激活caspase1 蛋白可引發(fā)細(xì)胞凋亡,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡,加快急性和慢性腦部疾病發(fā)生發(fā)展[14]。本研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,模型組腦組織中NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平升高,提示腦卒中腦組織中NLRP3/caspase1 處于激活狀態(tài),可進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞,從而改變小膠質(zhì)細(xì)胞突觸功能、促進(jìn)神經(jīng)元凋亡,影響疾病進(jìn)程。而電針刺激后腦組織中NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平降低,可能電針刺激抑制NLRP3/caspase1 通路的激活,進(jìn)而減弱通路對小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的作用,從而減緩疾病。

綜上所述,電針分別刺激腦卒中大鼠陽陵泉+配穴、關(guān)元、照海+申脈處,均可使小膠質(zhì)細(xì)胞突起減少、形態(tài)逆轉(zhuǎn),神經(jīng)元形態(tài)緩解、凋亡降低,可能是抑制NLRP3/caspase-1 通路實(shí)現(xiàn)的。但電針作用腦卒中大鼠機(jī)制復(fù)雜,也可能影響其他通路從而影響小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元,需在以后研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其機(jī)制,更加深入探討其關(guān)系。