王 貝 趙雨航 王樂(lè)偉 潘順基 石 見 王冬梅?

(1.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471023;2.杭州醫(yī)學(xué)院,杭州 310051;3.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南洛陽(yáng) 471023)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病,其臨床表現(xiàn)以進(jìn)行性、退行性大腦認(rèn)知,識(shí)別功能障礙為特征,明顯記憶力降低并伴隨個(gè)性和行為的改變[1-4]。AD 環(huán)境下Aβ 寡聚體持續(xù)激活小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子和神經(jīng)毒性炎癥因子,促使小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)突觸過(guò)度吞噬和清除,引起突觸損傷和認(rèn)知障礙[5]。多項(xiàng)研究表明,小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活以及M1/M2 型極化失衡,在AD 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6]。

二氫黃酮柚皮苷(naringin)具有抗炎、降脂和抗氧化等多種藥理作用的藥物[7]。柚皮苷在預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病方面具有良好的中樞神經(jīng)系統(tǒng)滲透性和顯著的治療效果[8]。研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷能夠緩解硝基丙酸誘導(dǎo)的大鼠亨廷頓癥的行為異常[9],改善紅藻氨酸毒性引起的神經(jīng)行為[10]。柚皮苷通過(guò)抑制膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)炎癥,對(duì)腦缺血再灌注損傷[11]以及LPS 誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥相關(guān)的腦損傷具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[12]。我們前期研究報(bào)道100 mg/kg 柚皮苷能夠緩解APPswe/PS1dE9 小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力[13],AD 環(huán)境下,柚皮苷對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換以及其吞噬功能的調(diào)節(jié),至今未見報(bào)道。本文將探究AD 模型中柚皮苷對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的極化調(diào)節(jié)效應(yīng),以及該效應(yīng)對(duì)認(rèn)知功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3 月齡清潔級(jí)APPswe/PS1dE9 轉(zhuǎn)基因雄性小鼠20 只,體重20～25 g;清潔級(jí)同窩非轉(zhuǎn)基因C57BL/6J 雄性小鼠20 只,體重20～25 g,均購(gòu)自北京華阜康公司[SCXK(京)2019-0008],所有實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于武漢賽維爾生物科技有限公司[SYXK(鄂)2018-0101],飼養(yǎng)溫度18℃～22℃,光照12 h,相對(duì)濕度50%～60%,自由攝食飲水。本研究過(guò)程的所有操作符合本院動(dòng)物倫理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)和要求(2019-03011),并按3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

柚皮苷購(gòu)自美國(guó)Selleck 公司(CAS:10236-47-2;貨號(hào):S2329);兔抗IbA-1 抗體購(gòu)自Abcam 公司(貨號(hào):ab178846);鼠抗Aβ 抗體購(gòu)自CST 公司(貨號(hào):15126);熒光二抗羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG 均購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group 公司(貨號(hào):SA00006-2,SA00006-3);PCR 引物從上海生工訂購(gòu);cDNA 合成試劑盒和q-PCR 試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司(貨號(hào):D7170,D7260);TB(總膽紅素)、ALT(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶)、AST(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)、Cr(肌酐)、BUN(尿素氮)ELISA 試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所(貨號(hào):C019-1-1,C009-2-1,C010-2-1,C011-2-1,C013-2-1);PCR 儀(Effendorf);凝膠圖像分析系統(tǒng)(Tannon);Leica 冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);熒光顯微鏡(Olympus,日本);酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理

3 月齡APPswe/PS1dE9 轉(zhuǎn)基因雄性小鼠作為模型組(APPswe/PS1dE9) 和治療組(APPswe/PS1dE9+柚皮苷100 mg/(kg·d)),并選擇同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠作為對(duì)照組和柚皮苷單獨(dú)給藥組(柚皮苷100 mg/(kg·d)),這些小鼠年齡體重匹配。對(duì)照組及模型組小鼠給予常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)鼠糧,柚皮苷治療組和柚皮苷單獨(dú)給藥組在常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)鼠糧中加入100 mg/(kg·d)的柚皮苷治療16 周,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)是在一個(gè)邊長(zhǎng)為40 cm×40 cm×40 cm 白色不透明的亞克力材料場(chǎng)地中進(jìn)行的,實(shí)驗(yàn)期間保持安靜;第1 天為適應(yīng)期,第2 天為熟悉期:箱內(nèi)一端放入兩個(gè)顏色材料完全相同的物體(邊長(zhǎng)為3 cm的立方體),距物體等距離處將小鼠放入箱內(nèi)并熟悉5 min。熟悉期4 h 之后為測(cè)試期:將箱內(nèi)的一個(gè)物體替換成形狀和顏色不同的物體(直徑、高均為3 cm),位置不變,小鼠放入箱內(nèi)并由箱體上方的攝像機(jī)記錄小鼠5 min 內(nèi)對(duì)新、舊兩個(gè)不同物體的探究時(shí)間TN 和TF。小鼠對(duì)物體的識(shí)別能力應(yīng)用識(shí)別指數(shù)(discrimination index,DI)表示,計(jì)算公式為:DI=(TN-TF)/(TN+TF)×100%。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)

將樣本徹底研碎,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書使用TRIzol 法對(duì)樣品進(jìn)行RNA 提取,用紫外吸收法對(duì)提取的RNA 進(jìn)行純度和濃度的測(cè)定,利用碧云天公司試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA 為模板,對(duì)管家基因和目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min,95℃變性15 s,60℃退火15 s,60℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán);對(duì)各個(gè)樣本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)并分析結(jié)果。引物序列見表1。

1.3.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

預(yù)冷的4%多聚甲醛心臟灌注取腦,浸泡過(guò)夜后,30%蔗糖溶液沉糖,包埋后,-20℃快速冠狀連續(xù)切片(20 μm),取腦片,封閉1 h,棄去封閉液,一抗4℃過(guò)夜,復(fù)溫,PBS 漂洗3 次,每次5 min,熒光標(biāo)記二抗,室溫1 h,PBS 漂洗3 次,每次5 min,DAPI 染色5 min,PBS 漂洗3 次,抗熒光淬滅劑封片,拍照,Image J 分析特定區(qū)域平均熒光強(qiáng)度。

1.3.5 生化指標(biāo)檢測(cè)

待行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,動(dòng)物禁食6 h,采用眼眶取血法,根據(jù)試劑說(shuō)明書操作,檢測(cè)血清中的TB,ALT,AST,Cr,BUN。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。組間比較應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA),方差齊時(shí)采用LSD 法,方差不齊者采用Dunnett 檢驗(yàn),以P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對(duì)APP/PS1 模型小鼠認(rèn)知功能的影響

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是評(píng)估動(dòng)物非空間工作記憶能力的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法;本實(shí)驗(yàn)治療組分為柚皮苷低劑量(50 mg/(kg·d)),高劑量(100 mg/(kg·d)),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型組相比,低劑量治療組小鼠識(shí)別指數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05),而高劑量治療組小鼠識(shí)別指數(shù)明顯增加(P<0.05),因此,本研究采用高劑量柚皮苷(100 mg/(kg·d))進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。表2 結(jié)果所示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠識(shí)別指數(shù)顯著降低(P<0.05),而柚皮苷(100 mg/(kg·d))治療能夠顯著增加模型組小鼠的識(shí)別指數(shù)(P<0.05),結(jié)果提示柚皮苷(100 mg/(kg·d))能夠緩解模型組小鼠的認(rèn)知功能障礙。

2.2 柚皮苷對(duì)CD16,TNF-α,iNOS,MCP-1 和CD206,TGF-β,Arg1,YM-1 以上標(biāo)記物mRNA 的影響

如圖1 所示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠腦組織M1 標(biāo)記物(CD16、TNF-α、iNOS、MCP-1)mRNA 表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05),而M2 型標(biāo)記物(CD206、TGF-β、Arg1、YM-1)mRNA 表達(dá)均顯著降低(P<0.05),表明模型組小鼠腦組織中,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞主要為M1 促炎表型;與模型組相比,柚皮苷治療的APPswe/PS1dE9 小鼠,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞主要為M2 抗炎表型。

表2 柚皮苷對(duì)APPswe/PS1dE9 模型小鼠認(rèn)知功能的影響(,n=10)Table 2 Effects of naringin on the cognitive function of APPswe/PS1dE9 model mice

表2 柚皮苷對(duì)APPswe/PS1dE9 模型小鼠認(rèn)知功能的影響(,n=10)Table 2 Effects of naringin on the cognitive function of APPswe/PS1dE9 model mice

注:與對(duì)照組相比較,#P<0.05;與模型組相比較,?P <0.05。Note.Compared with control group,#P <0.05.Compared with model group,?P <0.05.

2.3 柚皮苷通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化促進(jìn)對(duì)Aβ的吞噬和清除

小鼠大腦冠狀切面免疫熒光結(jié)果顯示,與模型組相比,柚皮苷治療組小鼠皮層和海馬區(qū)域內(nèi)圍繞及吞噬Aβ 的小膠質(zhì)細(xì)胞增加了76.3%。結(jié)果提示柚皮苷促進(jìn)了小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ 的吞噬。見圖2。

2.4 柚皮苷抑制APPswe/PS1dE9 模型小鼠腦組織Aβ 的聚集和沉積

熒光結(jié)果分析數(shù)據(jù)顯示,與模型組相比,柚皮苷治療的APPswe/PS1dE9 小鼠海馬區(qū)域Aβ 熒光強(qiáng)度降低了35.7%,免疫陽(yáng)性面積減少了46.9%;皮層區(qū)域Aβ 熒光強(qiáng)度降低了41.5%,陽(yáng)性面積減少了57.3%。見圖3。

2.5 柚皮苷對(duì)小鼠肝腎功能的影響

表3 結(jié)果顯示,對(duì)照組和模型組小鼠肝腎功能各參數(shù)值無(wú)顯著性差異(P>0.05)。柚皮苷100 mg/(kg·d)給藥16 周后,各參數(shù)值與對(duì)照組和模型組相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05),表明柚皮苷100 mg/(kg·d)持續(xù)給藥16 周后對(duì)小鼠肝腎功能無(wú)明顯影響。

圖1 柚皮苷對(duì)CD16,TNF-α,iNOS,MCP-1 和CD206,TGF-β,Arg1,YM-1 以上標(biāo)記物mRNA 的影響Note.Four groups of bars in the figure show the mRNA content of various markers in the brain tissues of mice.Compared with control group,?P<0.05,??P <0.01.Compared with model group,#P <0.05,##P<0.01.Figure 1 Effects of naringin on mRNA levels of CD16,TNF-α,iNOS,MCP-1 and CD206,TGF-β,Arg1,YM-1

圖2 APPswe/PS1dE9、APPswe/PS1dE9+Nar 組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和Aβ 斑塊免疫熒光圖Note.A,Microglial cells and Aβ plaque,using anti-Iba1(green) and anti-Aβ(red) immunofluorescence staining images.B,Quantitative analysis of microglia within 20 μm of amyloid plaque (n=90～100 amyloid plaque/group).Compared with model group,?P<0.05,??P <0.01.Figure 2 Immunofluorescence of microglia cells and Aβ plaque in APPswe/PS1dE9 and APPswe/PS1dE9+Nar mice groups

圖3 Control、APPswe/PS1dE9、APPswe/PS1dE9+Nar 組小鼠腦組織Aβ 免疫熒光染色Note.A,Hippocampus and cortex Aβ immunofluorescence staining.B,Aβ immunofluorescence intensity and area analysis.Compared with model group,?P <0.05,??P <0.01.Figure 3 Aβ immunofluorescence staining of mouse brain tissue in Control、APPswe/PS1dE9、APPswe/PS1dE9+Nar groups

表3 各組小鼠肝腎功能指標(biāo)(,n=10)Table 3 Liver and kidney function indexes of mice in each group

表3 各組小鼠肝腎功能指標(biāo)(,n=10)Table 3 Liver and kidney function indexes of mice in each group

注:TB:總膽紅素;ALT:丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶;AST:天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶;Cr:肌酐;BUN:尿素氮。與對(duì)照組相比,#P >0.05。Note.TB,Total bilirubin.ALT,Alanine aminotransferase.AST,Aspartate aminotransferase.Cr,Creatinine.BUN,Urea nitrogen.Compared with control group,#P >0.05.

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞,在神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡、突觸清除與修剪、神經(jīng)可塑性和學(xué)習(xí)認(rèn)知等方面發(fā)揮重要作用,小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)分為M1 型(促炎)和M2 型(抗炎)[14-18]。在AD 患者和AD 動(dòng)物模型腦組織中,小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活,并且向M1 型極化[6]。與此相一致,我們的研究中發(fā)現(xiàn)APPswe/PS1dE9 模型小鼠腦組織M1型標(biāo)志物顯著增加,M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物顯著降低,小膠質(zhì)細(xì)胞向M1 型極化。過(guò)度活化的M1 型細(xì)胞釋放分泌高水平的促炎因子及細(xì)胞毒性物質(zhì),進(jìn)一步加重神經(jīng)炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)毒性,在死亡神經(jīng)元和急性炎癥之間建立一個(gè)惡性循環(huán)[19]。多項(xiàng)研究顯示,通過(guò)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的亞型分化,促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎的M2 型轉(zhuǎn)化,能夠緩解AD 患者和AD 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的認(rèn)知功能損傷[6]。柚皮苷具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能,本研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷能夠降低M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá),增加M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá),調(diào)控活化的小膠質(zhì)細(xì)胞由M1 向M2 型極化。

研究表明Aβ 異常沉積和聚集能夠觸發(fā)神經(jīng)毒性和神經(jīng)炎癥,誘導(dǎo)神經(jīng)退行性病變,在AD 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18-20]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),100 mg/kg 柚皮苷治療能夠抑制APPswe/PS1dE9模型小鼠腦組織Aβ 的生成[13]。為了研究柚皮苷對(duì)Aβ 的清除作用,本研究通過(guò)免疫熒光共染小膠質(zhì)細(xì)胞和Aβ 檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ 的吞噬作用,結(jié)果顯示,與模型組相比,柚皮苷治療組小鼠皮層和海馬區(qū)域圍繞及侵噬老年斑的小膠質(zhì)細(xì)胞顯著增加,表明柚皮苷促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ 的吞噬。為了進(jìn)一步驗(yàn)證柚皮苷對(duì)Aβ 聚集和沉積的抑制作用,我們采用免疫熒光染色觀察小鼠腦內(nèi)的老年斑,結(jié)果顯示,柚皮苷顯著減少APPswe/PS1dE9 模型小鼠大腦皮層和海馬老年斑的面積。柚皮苷通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)極化從而促進(jìn)了Aβ 的吞噬和清除,并有效抑制腦組織內(nèi)Aβ 的聚集和沉積。而抑制Aβ 的生成以及促進(jìn)Aβ 的清除,能夠顯著改善AD行為學(xué)異常。

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)(novel objective recognition,NOR)是評(píng)估內(nèi)嗅皮層和海馬功能依賴的非空間短期工作記憶能力[21]。NOR 實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在自由活動(dòng)狀態(tài)下的學(xué)習(xí)記憶能力,顯著優(yōu)于電刺激下檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物非空間短期記憶的避暗實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)。我們之前研究報(bào)道100 mg/(kg·d)的柚皮苷能夠顯著緩解APPswe/PS1dE9 模型小鼠在避暗實(shí)驗(yàn)的空間記憶能力[13],與此相一致,本研究發(fā)現(xiàn),柚皮苷能夠促進(jìn)APPswe/PS1dE9 模型小鼠的非空間短期工作記憶能力,提示內(nèi)嗅皮層和海馬功能的改善。

在AD 治療中,中藥單體具有靶點(diǎn)明確,特異性強(qiáng)等顯著優(yōu)勢(shì),但隨著劑量的增加,通常伴隨著明顯的肝腎毒副作用。為了探究100 mg/(kg·d)的柚皮苷給藥16 周后對(duì)小鼠是否有肝腎毒副作用,我們選擇臨床和實(shí)驗(yàn)研究中常用的中藥肝腎毒性損傷指標(biāo),用于評(píng)價(jià)各組小鼠的肝腎功能狀況,結(jié)果顯示各組小鼠肝腎功能無(wú)顯著差異。

綜上,柚皮苷通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞由M1 型向M2 型極化,增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ 的吞噬,抑制Aβ的聚集和沉積,進(jìn)而緩解APPswe/PS1dE9 模型小鼠的非空間短期工作記憶能力,并且100 mg/(kg·d)的柚皮苷對(duì)小鼠無(wú)肝腎毒性。