王生成 李 琪 蔡瀟陽 唐詠婕

(1.儋州市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,海南儋州 571700;2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,?？?570102)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種臨床常見呼吸系統(tǒng)疾病,好發(fā)于老年人,隨著我國老齡化人口加劇,COPD 發(fā)病率呈逐漸增加趨勢,嚴(yán)重威脅老年人的身體健康及生活質(zhì)量,并給家庭及社會帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。西維來司鈉(sivelestat sodium)又名ONO-5046,是一種小分子中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)抑制劑,可選擇性抑制彈性蛋白酶,抑制肺泡上皮炎性因子釋放及黏液分泌,減輕肺損傷[3-4]。氣道黏液高分泌是COPD 主要病理生理特征,是影響疾病進(jìn)展及預(yù)后的獨(dú)立危險因素,其在COPD 發(fā)病中的作用成為近來研究熱點(diǎn)之一[5]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulated protein,GRP)78/蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)/CCAAT

增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer binding protein homologous protein,CHOP)信號通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡一種重要途徑,ERS 與COPD 肺上皮細(xì)胞凋亡、氣道黏液分泌密切相關(guān)[6-7]。但西維來司鈉減輕COPD 氣道黏液高分泌是否與GRP78/PERK/CHOP 信號通路有關(guān)尚未見相關(guān)報道。本研究通過建立COPD 大鼠模型,擬初步探究不同濃度西維來司鈉對COPD 大鼠氣道高分泌及GRP78/PERK/CHOP 信號通路的影響,以期揭示其作用機(jī)制,為尋找COPD 氣道黏液高分泌的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級6 周齡雄性SD 大鼠60 只,體重210～230 g,購自南京君科生物工程有限公司[SCXK(蘇)2017-0005],動物飼養(yǎng)在南京君科生物工程有限公司[SYXK(蘇)2017-0033]。本研究符合動物倫理學(xué)3R 原則,實驗經(jīng)過儋州市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(IACUC20180901-02)。

1.2 主要試劑與儀器

西維來司鈉(批號:S7198,純度≥98%)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(批號:L2630)均購自美國Sigma-Aldrich 公司。

南京香煙(每支焦油含量8 mg、煙堿量0.8 mg、一氧化碳量7 mg)購自江蘇中煙南京卷煙廠;RNA提取試劑盒(批號:R0011)購自上海碧云天有限公司;PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:6210A)、TB Green?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)實時熒光定量PCR 試劑盒(批號:RR820A)均購自日本TaKaRa 公司;黏蛋白5AC(MUC5AC)單克隆抗體(批號:ab24071)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78) 單克隆抗體(批號:ab21685)、蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)單克隆抗體(批號:ab79483)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)單克隆抗體(批號:ab179823)、GAPDH 單克隆抗體(批號:ab9485)、羊抗鼠IgG 二抗(批號:ab205719)均購自英國Abcam 公司。

動物肺功能儀(型號:PONYFX)購自意大利科時邁公司;光學(xué)顯微鏡(型號:DM3000)購自德國徠卡公司;熒光定量PCR 儀(型號:7500)購自美國Thermo Fisher 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 COPD 模型制備

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]并結(jié)合預(yù)實驗改良情況建立COPD 大鼠模型。自制50 cm×50 cm×30 cm 動物煙熏箱,每次放入12 只大鼠,于造模第2～7 天、9 d～14 d,點(diǎn)燃香煙使大鼠被動吸煙,每天1 次,每次12支(煙霧濃度1.41×103mg/cm3,CO 濃度1.12×103mg/cm3,氧濃度21%),每次30 min,煙熏區(qū)側(cè)壁鉆孔適當(dāng)通風(fēng),以防大鼠CO 中毒。并分別于第1、8、15、21 天氣管滴注LPS 200 μg(1 mg/mL)。刺激1周期后20 d 成模。

1.3.2 實驗分組及給藥

成模大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為COPD 組及西維來司鈉干預(yù)組(低、中、高劑量),另取正常飼養(yǎng)大鼠為對照組(NC 組),每組12 只。西維來司鈉低、中、高劑量組分別于成模后第1 天起尾靜脈注射西維來司鈉2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg[8-9],NC 組、COPD 組注射等量生理鹽水,每天2 次,連續(xù)干預(yù)21 d。

1.3.3 標(biāo)本采集

干預(yù)結(jié)束后,腹腔注射麻醉處死大鼠,打開胸腔,暴露雙肺,取出右肺,暴露氣管,在氣管下段作小T 型切口,插入鈍鋼針頭,手術(shù)線固定,注射器注入8 mL 生理鹽水,反復(fù)抽吸3 次回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),重復(fù)3 次,收集BALF 約8 mL,于3000 r/min,有效離心半徑10 cm 離心10 min,留取上清分裝,置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。另取部分右肺組織分別于4%多聚甲醛固定及液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 肺功能指標(biāo)檢測

干預(yù)結(jié)束后,麻醉各組大鼠并進(jìn)行固定,切開頸部皮膚,分離皮下組織,在氣管肋骨間切口并插入接有三通的氣管插管,縫合固定氣管切口后將氣管插管另一端介入動物肺功能儀,檢測各組大鼠0.1 s 用力呼氣量(0.1 s forced expiratory volume,FEV0.1)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)水平。

1.3.5 肺組織病理學(xué)變化檢測

于4%多聚甲醛固定的右肺組織進(jìn)行石蠟包埋后,以4 μm 厚度連續(xù)切片,進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(HE 染色),于光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.3.6 大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡檢測

取大鼠肺組織石蠟切片,采用原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)檢測各組大鼠肺上皮細(xì)胞凋亡情況,具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,隨機(jī)選取5 個視野,于400 倍光鏡下計數(shù)肺泡上皮細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)取平均值。凋亡率=凋亡肺泡上皮細(xì)胞數(shù)/肺泡上皮總數(shù)×100%。

1.3.7 肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表達(dá)水平檢測

采用RNA 提取試劑盒提取肺組織總RNA,用紫外分光光度計檢測總RNA 濃度及純度(OD280/OD260:1.8～2.0)。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用實時熒光定量 PCR (Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)儀對肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海碧云天有限公司合成,引物序列見表1。采用20 μL 反應(yīng)體系:TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL,cDNA(50 ng/μL)2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件:95℃30 s;95℃ 5 s,60℃ 34 s,40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法對肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 相對表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。GAPDH 為內(nèi)參基因。

1.3.8 肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達(dá)量檢測

采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測各組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達(dá)。提取肺組織總蛋白,BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。取50 μg 蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜至聚偏氟丙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,分別滴加一抗MUC5AC(稀釋比1 ∶2000)、GRP78(稀釋比1 ∶1000)、PERK(稀釋比1∶1000)、CHOP(稀釋比1 ∶1000)、GAPDH(稀釋比1∶5000),4℃過夜,PBS 洗滌后添加羊抗鼠IgG 二抗(稀釋比1 ∶10000),室溫下封閉2 h,PBS 洗滌后使用化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)法(ECL)發(fā)光試劑盒顯影,分析各蛋白條帶灰度值,以β-actin 為內(nèi)參計算目的蛋白條帶的相對比值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較

與NC 組比較,COPD 組大鼠FEV0.1、FVC 水平顯著降低(P<0.05);與COPD 組比較,西維來司鈉低、中、高劑量組大鼠FEV0.1、FVC 水平依次升高(P<0.05),見表2。

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化情況

NC 組大鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)完整,無明顯病理改變。COPD 組大鼠肺組織支氣管壁增高,肺泡組織壁變薄,纖毛脫落、倒伏明顯,有大量炎性細(xì)胞浸潤。西維來司鈉各干預(yù)組大鼠肺組織病理改變均減輕,見圖1。

表1 RT-qPCR 引物Table 1 RT-qPCR primer

表2 各組大鼠肺功能指標(biāo)FEV0.1、FVC 水平比較(mL,n=12,)Table 2 Comparison of pulmonary function indexes FEV0.1 and FVC levels in each group

表2 各組大鼠肺功能指標(biāo)FEV0.1、FVC 水平比較(mL,n=12,)Table 2 Comparison of pulmonary function indexes FEV0.1 and FVC levels in each group

注:與NC 組比較,aP<0.05;與COPD 組比較,bP<0.05;與西維來司鈉低劑量組比較,cP<0.05;與西維來司鈉中劑量組比較,dP<0.05。Note.Compared with the NC group,aP<0.05.Compared with the COPD group,bP<0.05.Compared with the sivelestat sodium low dose group,cP<0.05.Compared with the sivelestat sodium middle dose group,dP<0.05.

2.3 各組大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡率比較

與NC 組比較,COPD 組大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05);與COPD 組比較,西維來司鈉低、中、高劑量組大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡率依次降低(P<0.05),見表3。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化(HE 染色)Figure 1 Pathological changes of lung tissue in each group(HE staining)

表3 各組大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡率比較(n=12,)Table 3 Comparison of apoptosis rate of alveolar epithelial cells in each group

表3 各組大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡率比較(n=12,)Table 3 Comparison of apoptosis rate of alveolar epithelial cells in each group

注:與NC 組比較,aP<0.05;與COPD 組比較,bP<0.05;與西維來司鈉低劑量組比較,cP<0.05;與西維來司鈉中劑量組比較,dP<0.05。Note.Compared with the NC group,aP<0.05.Compared with the COPD group,bP<0.05.Compared with the sivelestat sodium low dose group,cP<0.05.Compared with the sivelestat sodium middle dose group,dP<0.05.

2.4 各組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表達(dá)水平比較

與NC 組比較,COPD 組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 水平顯著增加(P<0.05);與COPD 組比較,西維來司鈉低、中、高劑量組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表達(dá)水平依次降低(P<0.05),見表4。

2.5 各組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達(dá)量比較

與NC 組比較,COPD 組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白量顯著增加(P<0.05);與COPD 組比較,西維來司鈉低、中、高劑量組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達(dá)量依次降低(P<0.05),見表5、圖2。

表4 各組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表達(dá)水平比較(n=12,)Table 4 Comparison of expression levels of MUC5AC,GRP78,PERK and CHOP mRNA in lung tissues of rats in each group

表4 各組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表達(dá)水平比較(n=12,)Table 4 Comparison of expression levels of MUC5AC,GRP78,PERK and CHOP mRNA in lung tissues of rats in each group

注:與NC 組比較,aP<0.05;與COPD 組比較,bP<0.05;與西維來司鈉低劑量組比較,cP<0.05;與西維來司鈉中劑量組比較,dP<0.05。Note.Compared with the NC group,aP<0.05.Compared with the COPD group,bP<0.05.Compared with the sivelestat sodium low dose group,cP<0.05.Compared with the sivelestat sodium middle dose group,dP<0.05.

表5 各組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達(dá)量比較(n=12,)Table 5 Comparison of MUC5AC,GRP78,PERK and CHOP protein expression in lung tissue of rats in each group

表5 各組大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達(dá)量比較(n=12,)Table 5 Comparison of MUC5AC,GRP78,PERK and CHOP protein expression in lung tissue of rats in each group

注:與NC 組比較,aP<0.05;與COPD 組比較,bP<0.05;與西維來司鈉低劑量組比較,cP<0.05;與西維來司鈉中劑量組比較,dP<0.05。Note.Compared with the NC group,aP<0.05.Compared with the COPD group,bP<0.05.Compared with the sivelestat sodium low dose group,cP<0.05.Compared with the sivelestat sodium middle dose group,dP<0.05.

圖2 Western blot 檢測大鼠肺組織MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達(dá)Note.A,NC group.B,COPD group.C,Sivelestat sodium low dose group.D,Sivelestat sodium middle dose group.E,Sivelestat sodium high dose group.Figure 2 Western blot detection of MUC5AC,GRP78,PERK,CHOP protein expression in rat lung

3 討論

COPD 是一種常見的以持續(xù)氣流受限為特征的可以預(yù)防和治療的疾病,氣流受限進(jìn)行性發(fā)展,與氣道和肺臟對有毒顆?；驓怏w的慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān),其中煙草是COPD 重要致病原因,LPS 是一種細(xì)菌內(nèi)毒素,二者聯(lián)合刺激大鼠氣道黏膜可激活多種炎癥、應(yīng)激信號通路,與氣道黏液高分泌調(diào)控密切相關(guān)[10-12]。因此本研究采用煙熏結(jié)合LPS 刺激建立COPD 大鼠模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NC 組比較,COPD 組大鼠肺組織支氣管壁增高,肺泡組織壁變薄,纖毛脫落、倒伏明顯,有大量炎性細(xì)胞浸潤,FEV0.1、FVC 水平顯著降低,符合COPD 典型臨床特征,提示COPD 大鼠模型制備成功,可用于后續(xù)實驗。

正常氣道黏膜表面覆蓋少量黏液,可保護(hù)氣道、潤滑上皮、防御外來刺激物和細(xì)菌等。氣道黏液由杯狀細(xì)胞、黏膜下腺體細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞分泌,氣道黏蛋白(mucoprotein,MUC)是氣道黏液高分泌大分子的主要組成成分,是產(chǎn)生氣道彈性與黏性的主要原因,其中MUC5AC 是支氣管上皮產(chǎn)生的主要呼吸道MUC,在病理情況下可顯著增加,其表達(dá)水平可代表氣道黏液分泌強(qiáng)度[13-14]。西維來司鈉是一種NE 抑制劑,可競爭性抑制中性粒細(xì)胞活化及浸潤,減少自由基產(chǎn)生及釋放,發(fā)揮抗炎、抗氧化等作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NC 組比較,COPD組大鼠肺組織MUC5AC mRNA 及蛋白量顯著增加,提示COPD 大鼠存在氣道黏液高分泌。而西維來司鈉可呈劑量依賴性減輕大鼠肺組織病理學(xué)改變、改善肺功能及抑制MUC5AC mRNA 及蛋白表達(dá),提示西維來司鈉可能對COPD 大鼠氣道黏液高分泌癥狀具有一定緩解及治療作用,可能與抑制COPD 早期炎癥反應(yīng)有關(guān)[15-16]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛存在于真核細(xì)胞中,是蛋白質(zhì)合成、折疊及Ca2+儲存的主要場所。在毒物或氧化應(yīng)激刺激等調(diào)解下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)出現(xiàn)未折疊或錯誤折疊蛋白的積累和Ca2+平衡失衡,導(dǎo)致ERS[17]。適度ERS 有助于通過未折疊蛋白反應(yīng)(protein response,UPR)促進(jìn)蛋白質(zhì)加工的恢復(fù),而嚴(yán)重和持續(xù)的ERS可觸發(fā)相關(guān)細(xì)胞的凋亡。GRP78/PERK/CHOP 信號通路是ERS 介導(dǎo)的一種重要細(xì)胞凋亡通路,ERS發(fā)生時,GRP78 表達(dá)升高,PERK 發(fā)生磷酸化,進(jìn)而CHOP 表達(dá)增多,CHOP 蛋白是ERS 介導(dǎo)細(xì)胞凋亡程度的標(biāo)志蛋白[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NC 組比較,COPD 大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡率、肺組織GRP78、PERK、CHOP mRNA 及蛋白量顯著增加,而西維來司鈉可呈劑量依賴性降低COPD 大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡率、肺組織GRP78、PERK、CHOP mRNA及蛋白表達(dá),可能因為氣道上皮細(xì)胞在維系上皮結(jié)構(gòu)完整性及功能中發(fā)揮重要作用,氣道上皮損傷、凋亡和黏液高分泌會加重氣道損害,促進(jìn)疾病進(jìn)展,提示西維來司鈉可減輕氣道黏液高分泌,可能與抑制GRP78/PERK/CHOP 信號通路激活,抑制COPD 肺組織上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)[19-20]。

綜上所述,西維來司鈉可減輕COPD 大鼠氣道黏液高分泌,可能與抑制GRP78/PERK/CHOP 信號通路激活,抑制COPD 肺組織上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。但關(guān)于西維來司鈉減輕COPD 氣道黏液高分泌機(jī)制是否還涉及其他炎癥相關(guān)等通路共同參與,有待進(jìn)一步深入探究。