賴慧敏 黃敏聰? 樓招歡 謝 鋒 潘 偉徐 聰楊正標(biāo)秦 荔張立將

(1.浙江工業(yè)大學(xué)長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心,杭州 310014;2.杭州醫(yī)學(xué)院安全性評價研究中心,杭州 310053;3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,杭州 310053)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種主要累及直腸、結(jié)腸黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎癥性疾病,與克羅恩病統(tǒng)稱為炎癥性腸病。隨著人們生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變,我國UC 患病人數(shù)顯著增多,已成為我國消化系統(tǒng)常見疾病。目前臨床上UC 治療藥物主要有氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等,但其副作用較大,遠(yuǎn)期療效及安全性并不理想[1-2]。而中醫(yī)藥具有多組分、多靶點、從整體論治等特點在治療UC 等復(fù)雜慢性疾病方面具有獨特的優(yōu)勢。UC 在中醫(yī)中屬“腸澼”“痢疾”等疾病范疇[3],“健脾溫腎,行氣導(dǎo)滯”是中醫(yī)藥治療UC 的重要原則[4-5]。烏藥為樟科植物烏藥Lindera aggregata(Sims)Kosterm.的干燥塊根,屬理氣藥,具有“行氣止痛,溫腎散寒”的功效,傳統(tǒng)常用于胃腸道疾病的治療?，F(xiàn)代研究也已證實天臺烏藥對胃腸功能具有良好的調(diào)節(jié)作用[6-9],但迄今烏藥對UC 的藥效作用及機(jī)制仍未見研究報道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)烏藥能降低酒精性脂肪肝模型大鼠體內(nèi)炎性細(xì)胞因子含量[10-11],推測其可能具有改善UC 的作用。因此,本實驗采用TNBS 致UC 大鼠模型,以疾病癥狀及結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)等指標(biāo)為評價體系考察天臺烏藥對UC 的藥效作用,為后續(xù)進(jìn)一步研究提供治療依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SD 大鼠,36 只,SPF 級,體重180～200 g,7 周齡,購買于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2015-0005]。本研究實驗動物飼養(yǎng)于杭州醫(yī)學(xué)院安全性評價研究中心屏障系統(tǒng)[SYXK(浙)2017-0010]。本研究實驗動物的使用(動物數(shù)量、實驗設(shè)計及對動物的處理)通過了浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評價研究中心實驗動物管理和使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)審批(20160321)并嚴(yán)格按照審批的內(nèi)容實施,實驗過程中嚴(yán)格遵守3R 原則。整個實驗期間,動物飼養(yǎng)室溫度在21.5℃～25.0℃之間,相對濕度在40%～65%之間,中央空調(diào)集中通風(fēng)每小時≥15次,12 h 明暗交替。

1.2 主要試劑與儀器

2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS,批號:SLBK1620 V)購自美國Sigma 公司;羧甲基纖維素鈉(CMCNa,批號:20150210)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;柳氮磺胺吡啶腸溶片(SASP,國藥準(zhǔn)字H31020557)購自上海信誼天平藥業(yè)有限公司;大鼠IL-6 ELISA 試劑盒(批號:7179620)、大鼠TNF ELISA 試劑盒(批號:7109996)、FITC anti-rat CD3 抗體(批號:7026976)、APC anti-rat CD4 抗體(批號:7075558)、PerCP anti-rat CD8a 抗體(批號:7132557)、PE anti-rat CD45RA 抗體(批號:7216755) 和 FITC anti-rat CD25 抗體(批號:4027979)均購自美國BD 公司;PE Foxp3 抗體(批號:E12828-106)購自美國eBioscience 公司;髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO) 測試盒(批號:20160502)購自南京建成科技有限公司;谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST,批號:07349/00002881)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT,批號:07348/00002884)、尿素氮(BUN,批號:07402/00003240)、肌酐(CREA,批號:171037/50003231)、總膽固醇(TC,批號:07284/00002670)和甘油三脂(TG,批號:07236/00002245)檢測試劑均購自德國Diagnostio Systems Gmbh。

HITACHI 7180 全自動生化儀(日本日立公司);Synergy HT 全自動熒光酶標(biāo)儀(美國BioTek 公司);FACS Calibur 流式細(xì)胞儀(美國BD 公司);DM3000 顯微鏡等病理全套設(shè)備(德國Leica 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 烏藥醇提取物制備

烏藥,產(chǎn)地浙江天臺縣,由浙江省天臺山烏藥生物工程有限公司提供,經(jīng)該公司陳方標(biāo)藥師鑒定為樟科(Lauraceae)山胡椒屬(Lindera)植物烏藥Lindera aggregata(Sims) Kosterm.的干燥塊根。稱取烏藥切片100 g,加入10 倍量的70%乙醇,冷凝回流提取兩次,每次1.5 h。將兩次藥液合并,適當(dāng)真空減壓濃縮并干燥,得14.4 g 烏藥70%乙醇提取物(即1 g 提取物相當(dāng)于6.95 g 生藥材)。

1.3.2 分組、造模與給藥

SD 大鼠接收后立即對其進(jìn)行編號標(biāo)記并稱重,適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后再次稱重,并采用SPSS 軟件將其隨機(jī)分為6 組:正常對照組(NC)、模型對照組(TNBS)、陽性對照組(SASP)、烏藥低劑量組(WYL)、烏藥中劑量組(WY-M)和烏藥高劑量組(WYH),每組6 只,確保各組間大鼠體重?zé)o顯著性差異。

分組后大鼠禁食不禁水24 h 后,采用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg 劑量)麻醉。正常對照組按0.36 mL/100 g 體積灌腸給予生理鹽水,模型對照組及其余藥物干預(yù)組均按90 mg/kg 劑量經(jīng)灌腸給予TNBS 50%乙醇溶液。具體操作方法如下:將一直徑2 mm的橡膠管充分潤滑后由肛門輕緩插入深約8 cm,按90 mg/kg 劑量推入TNBS 50%乙醇溶液(濃度:25 mg/mL、灌腸體積:0.36 mL/100 g),完畢后緩慢拔出塑料膠管,用手捏住肛門,提起大鼠尾部,持續(xù)倒置1 min,使造模劑充分滲入大鼠腸腔內(nèi)。

正常對照組和模型對照組大鼠均按10 mL/kg體積灌胃給予0.5%的CMC-Na 溶液,陽性對照組灌胃給予柳氮磺胺吡啶(0.3 g/kg);烏藥低、中、高劑量組大鼠按10 mL/kg 給藥體積灌胃分別給予0.5、1、2 g/kg 生藥劑量的烏藥。自TNBS 造模次日開始給藥,每日一次,連續(xù)9 d。

1.3.3 指標(biāo)檢測

(1)一般體征觀察

試驗期間每天觀察并記錄各組大鼠的行為體征及生存狀況,觀測體重、糞便性狀及隱血情況。糞便性狀按正常(暗褐色,硬呈橢球形)記0 分,松軟記1 分,稀溏記2 分;潛血陰性記0 分,肉眼未見血便但潛血陽性記1 分,肉眼可見血便記2 分,上述兩項評分相加為糞便性狀指數(shù)。

(2)血清生化指標(biāo)和細(xì)胞因子的測定

末次給藥后禁食不禁水12 h 后,采用1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg 劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉大鼠,采用一次性負(fù)壓采血針從腹主動脈采血至非抗凝真空采血管中,離心收集上清并按需分裝。使用日本HITACHI 7180 全自動生化儀檢測大鼠血清中AST、ALT、BUN、CREA、TC、TG 等生化指標(biāo);采用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測大鼠血清中IL-6 和TNF-α 水平。

(3)外周血中淋巴細(xì)胞亞群的測定

剖解時從腹主動脈采血至EDTA-K 抗凝真空采血管中。分別吸取100 μL 血液樣本至兩根流式樣本管中,一管用于外周血中B 細(xì)胞、T 細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例以及CD4+T、CD8+T 細(xì)胞占T 細(xì)胞比例檢測,另一管用于外周血Treg 細(xì)胞檢測。

大鼠外周血B、T 等淋巴細(xì)胞亞群檢測具體方法如下:設(shè)置空白對照及單染對照管用于流式細(xì)胞儀補(bǔ)償?shù)葏?shù)調(diào)節(jié)。各樣本檢測管加入FITC antirat CD3、APC anti-rat CD4、PerCP anti-rat CD8 和PE anti-rat CD45RA 這四種熒光抗體進(jìn)行表面染色;經(jīng)溶血、PBS 洗滌等環(huán)節(jié)以制備樣本,隨后采用流式細(xì)胞儀檢測B 細(xì)胞(CD3-CD45RA+)、T 細(xì)胞(CD3+CD45RA-)、CD4+T 細(xì)胞(CD3+CD4+CD8-)及CD8+T細(xì)胞(CD3+CD4-CD8+)比例。大鼠外周血Treg 細(xì)胞檢測具體方法如下:各樣本檢測管先加入APC anti-rat CD4 和FITC anti-rat CD25 抗體進(jìn)行表面染色;然后用BD Transcription Factor 溶液進(jìn)行細(xì)胞固定和破細(xì)胞核膜;隨后加入PE anti-Foxp3 抗體進(jìn)行核內(nèi)染色;采用流式細(xì)胞儀檢測Treg 細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+)比例。

(4)大鼠腸道組織中MPO 的測定

剪取部分結(jié)腸組織并稱重,根據(jù)南京建成MPO檢測試劑盒說明進(jìn)行后續(xù)操作,加入系列試劑;使用酶標(biāo)儀于460 nm 波長檢測各樣本吸光度。MPO活力(U/g 組織濕重)=(A測定值-A對照值)/11.3×取樣量(g)。

(5)結(jié)直腸重量、長度及單位長度重量測定

動物剖解前稱量大鼠體重,剖解時摘取結(jié)腸,沿腸系膜剪開腸腔,用冰生理鹽水沖洗干凈,用濾紙將結(jié)腸吸干,測量總長度并稱重,計算單位長度重量及結(jié)腸指數(shù)。

(6)結(jié)腸組織大體觀察及病理學(xué)檢查

剖解時肉眼大體觀察結(jié)腸外觀形態(tài)變化(如色澤、水腫、腸壁擴(kuò)大粘連、潰瘍糜爛等);取病變部位組織置于福爾馬林溶液中,石蠟包埋后切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,應(yīng)用Graphpad Prism 8.0 軟件作圖,計量資料數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。選用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行顯著性分析;總體組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義時(P<0.05)時,進(jìn)行組間兩兩比較;當(dāng)方差齊性時,組間兩兩比較采用LSD 法分析,當(dāng)方差不齊時采用Games-Howell 法分析,P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對UC 模型大鼠疾病癥狀的影響

正常對照組大鼠行動活躍,毛發(fā)光澤,食欲良好,糞便質(zhì)地較硬,呈橢球形,暗褐色。與正常對照組比較,模型對照組大鼠自造模次日起即出現(xiàn)自主活動減少、食欲減退、精神萎靡、倦怠懶動同時伴有大便次數(shù)增多,腹瀉便血等癥狀,表明造模成功。造模后模型組大鼠體重明顯減輕,相對體重百分率始終低于正常對照組,陽性對照組、烏藥低、中、高劑量組大鼠的體重降低較少,相對體重百分率高于模型對照組。與模型對照組比較,陽性對照組、烏藥低、中、高劑量組大鼠糞便稀軟及便血程度較輕,糞便性狀指數(shù)明顯降低(見圖1)。上述實驗結(jié)果表明烏藥能夠在一定程度上減輕TNBS 造模引起的體重降低及便血等疾病癥狀,對TNBS 誘導(dǎo)的UC 模型大鼠具有一定的改善作用。

2.2 對UC 模型大鼠結(jié)腸組織大體觀的影響

正常對照組大鼠結(jié)腸粘膜表面光滑,未見明顯異常。與正常對照組比較,模型對照組大鼠腸道粘膜充血水腫、腸管縮短、腸壁增厚;并可見多處潰瘍,部分形成深大潰瘍,甚至與周圍組織粘連。模型對照組大鼠結(jié)直腸腸壁增厚且長度顯著縮短(P<0.01),結(jié)腸總重量以及單位長度重量顯著增加(P<0.01)。與模型對照組比較,陽性對照組、烏藥低、中、高劑量組大鼠結(jié)直腸重量及單位長度重量顯著降低(P<0.05,P<0.01);陽性對照組、烏藥中劑量組大鼠結(jié)直腸長度顯著增加(P<0.05)(見圖2)。上述實驗結(jié)果表明烏藥能夠改善TNBS 誘導(dǎo)的UC模型大鼠的結(jié)直腸病變。

2.3 對UC 模型大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

正常對照組大鼠結(jié)腸組織可見黏膜上皮細(xì)胞完整,隱窩結(jié)構(gòu)正常,腺體排列整齊,未見萎縮、壞死及炎性浸潤等病變。與正常對照組比較,模型對照組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)鏡檢可見結(jié)腸組織上皮細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷脫落、腺體破壞、潰瘍等病變,其潰瘍灶數(shù)量較多且面積較大(見圖3 中黑色箭頭標(biāo)注),并伴有大量的中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤。與模型對照組比較,陽性對照組、烏藥低、中、高劑量組大鼠腸道上皮細(xì)胞破壞程度有所減輕,潰瘍灶數(shù)量有所減少,潰瘍面積減小,中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤程度減輕(見圖3),表明烏藥能夠改善UC 模型大鼠的結(jié)直腸組織病理學(xué)改變。

2.4 對UC 模型大鼠血清生化指標(biāo)的影響

各組間大鼠血清中AST、ALT、BUN、CREA、TC和TG 等生化指標(biāo)均未見顯著性差異(見圖4)。

2.5 對UC 模型大鼠炎癥因子的影響

與正常對照組比較,模型對照組大鼠血清中IL-6、TNF-α 含量顯著升高(P<0.01),表明UC 模型大鼠體內(nèi)存在明顯的炎癥狀況。與模型對照組比較,陽性對照組、烏藥低、中、高劑量組IL-6 含量顯著降低(P<0.01);陽性對照組、烏藥低、中劑量組TNF-α含量顯著降低(P<0.05)(見圖5),提示烏藥可能具有一定的抗炎作用,能夠顯著改善UC 模型大鼠體內(nèi)炎癥狀況。

圖1 烏藥對UC 模型大鼠體重及糞便性狀的影響(n=6)Figure 1 Effects of LREE on body weight and stool features of UC model rats

2.6 對UC 模型大鼠腸道組織MPO 的影響

與正常對照組比較,模型對照組大鼠每克結(jié)腸組織中含有的MPO 活性顯著升高(P<0.01),表明經(jīng)TNBS 造模后模型對照組大鼠結(jié)腸組織損傷后伴有大量諸如中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤。與模型對照組比較,陽性對照組、烏藥低、中劑量組大鼠每克結(jié)腸組織中含有的MPO 活性顯著降低(P<0.05)(見圖5),表明烏藥能夠明顯減輕UC 模型大鼠結(jié)腸組織中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤程度,初步提示烏藥在一定程度上減輕了UC 模型大鼠的結(jié)腸組織中的炎癥狀況。

圖2 烏藥對UC 模型大鼠結(jié)直腸大體觀及長度的影響(n=6)Figure 2 Effect of LREE on the length and morphology of colon of UC model rats

圖3 烏藥對UC 模型大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響Note.The arrow in the pictures refer to the ulcer focus.Figure 3 Effect of LREE on histopathology of UC model rats

2.7 對UC 模型大鼠外周血Treg 細(xì)胞等淋巴細(xì)胞亞群的影響

與正常對照組比較,模型對照組大鼠外周血中Treg 占輔助性T 細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05);與模型對照組比較,陽性對照組以及烏藥醇提物低、中、高劑量組Treg 占輔助性T 細(xì)胞比例均有所升高,但未見統(tǒng)計學(xué)差異。各組間大鼠外周血中B 細(xì)胞、T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例以及CD4+T、CD8+T 細(xì)胞占T細(xì)胞比例均未見明顯變化(見圖6)。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計潰瘍性結(jié)腸炎既往多發(fā)于西方國家,但是隨著社會環(huán)境暴露、人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)等改變,UC 已成為我國消化系統(tǒng)常見疾病,且患病人數(shù)仍呈明顯增加趨勢[12-13]。潰瘍性結(jié)腸炎患者多為青壯年,且呈年輕化趨勢,臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、粘液血便等癥狀,目前UC 尚無特效藥物導(dǎo)致其病程遷延,常反復(fù)發(fā)作,嚴(yán)重影響社會生產(chǎn)力和個人生活質(zhì)量,甚至誘發(fā)癌變危及患者生命[14-15]。

中醫(yī)將潰瘍性結(jié)腸炎歸“腸澼”“痢疾”等疾病范疇,中醫(yī)藥治療潰瘍性結(jié)腸炎重在健脾溫腎,行氣導(dǎo)滯。烏藥主產(chǎn)于浙江、安徽、湖南、湖北等地,其中又以產(chǎn)于浙江天臺者色白、質(zhì)嫩、氣芳香,質(zhì)佳為道地藥材,稱“天臺烏藥”或“臺烏”,為“新浙八味”培育品種之一,常用于治療胃腸道諸證。試驗結(jié)果顯示,天臺烏藥低、中、高劑量均可不同程度緩解TNBS 誘導(dǎo)的UC 模型大鼠便血及體重降低等癥狀;明顯改善其結(jié)腸黏膜充血水腫、腸壁萎縮增厚、潰瘍粘連等病變,減少潰瘍灶數(shù)量、縮小潰瘍面積;顯著增加其結(jié)直腸長度、重量及單位長度重量(P<0.05)。表明天臺烏藥能改善TNBS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的疾病癥狀以及結(jié)腸病變,具有良好的抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥效作用。

圖5 烏藥對UC 模型大鼠血清細(xì)胞因子及腸道組織MPO 的影響(n=6)Figure 5 Effects of LREE on inflammatory cytokines and myeloperoxidase of UC model rats

圖6 烏藥對UC 模型大鼠外周血中Treg 等淋巴細(xì)胞亞群的影響(n=6)Figure 6 Effects of LREE on lymphocyte subsets in peripheral blood of UC model rats

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,UC 與腸道屏障受損導(dǎo)致腸道免疫過度激活甚至失衡密切相關(guān)[16]。不當(dāng)飲食或者諸如TNBS 等外界因素會損傷腸道上皮細(xì)胞,破壞腸道黏膜屏障,導(dǎo)致腸道通透性增加,促使腸道微生物及其代謝產(chǎn)物等侵入腸黏膜固有層組織,引起腸道中巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞過度激活,大量分泌如IL-6、TNF-α 等炎性細(xì)胞因子[17]。已有研究證實IL-6、TNF-α 等促炎性細(xì)胞因子是導(dǎo)致UC 發(fā)病的重要細(xì)胞因子,在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[18-19]。TNF-α 是由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要的炎性因子,不僅能夠通過與腫瘤壞死因子受體-1 結(jié)合誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞死亡,破壞腸道屏障,誘導(dǎo)UC 發(fā)生;還能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生IL-6 等細(xì)胞因子和趨化因子,誘導(dǎo)免疫細(xì)胞趨化、浸潤至腸道病灶部位,加劇腸道炎癥,促進(jìn)UC 發(fā)展[20]。IL-6 是由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞合成分泌的一種多效性細(xì)胞因子,能夠促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化,抑制調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Treg)分化,導(dǎo)致Th17/Treg 失衡。過度增殖活化的Th17 細(xì)胞能夠大量分泌TNF-α 等炎性細(xì)胞因子,誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞死亡,加劇組織損傷,如此惡性循環(huán)促進(jìn)UC 發(fā)展[18]。本試驗結(jié)果顯示TNBS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清中IL-6 和TNF-α 含量以及結(jié)腸組織中MPO 活性均顯著升高,外周血中Treg 占輔助性T 細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)。而天臺烏藥能夠降低模型大鼠結(jié)腸組織中MPO 活性以及血清中IL-6 和TNF-α 含量,表明其能夠減少中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤,抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生,有效改善結(jié)腸炎癥狀況。此外,天臺烏藥還能夠升高模型大鼠外周血中Treg 占輔助性T 細(xì)胞比例。綜上所述,天臺烏藥能夠改善TNBS 誘導(dǎo)的UC 模型大鼠的疾病癥狀和腸道組織病變,具有良好的抗UC 作用。該抗UC 作用可能與烏藥抑制IL-6 等炎性細(xì)胞因子分泌有關(guān),但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。