齊 磊歐陽欣于明帥劉 梅張 科

(成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院?核工業(yè)四一六醫(yī)院,成都 610051)

腦血管疾病是全球高致死率和高致殘率發(fā)生的主要原因之一[1-2]。腦缺血灌注再損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)是引發(fā)多種腦血管疾病的主要病理機(jī)制,而CIRI 病理生理過程極為復(fù)雜,且臨床上仍缺乏治療CIRI 的有效藥物,故尋找和開發(fā)治療CIRI 有效藥物,一直是目前臨床研究的熱點之一[3]?；謴?fù)腦組織血液供應(yīng)是CIRI 主要治療目的,但機(jī)體恢復(fù)血供時,勢必會損傷腦組織及神經(jīng)功能,而目前臨床上仍缺乏腦組織及神經(jīng)保護(hù)的有效措施及藥物[4]。蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)/環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)通路在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、神經(jīng)元細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用,且其與腦損傷過程中神經(jīng)突觸傳導(dǎo)、重塑及學(xué)習(xí)、記憶等功能密切相關(guān)[5-6]。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)PKA/CREB 通路與CIRI過程神經(jīng)功能改善關(guān)系密切,并逐漸受到臨床研究的重視[7-8]。丙泊酚為短效靜脈麻醉藥,也是臨床上腦損傷外科手術(shù)中常用麻藥,其可使腦血流量減少,腦耗氧量及顱內(nèi)壓降低,近年來,大量研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚對CIRI 過程中腦損傷具有保護(hù)作用[9]。但丙泊酚對CIRI 過程中神經(jīng)功能的改善作用及對PKA/CREB 通路的影響,鮮見報導(dǎo),本研究通過構(gòu)建大鼠CIRI 模型,并進(jìn)行探討,為臨床用藥提供一定指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級SD 雄性大鼠62 只,6～8 周齡,體重200～220 g,由成都醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供[SCXK(川)2020-0027]。所有大鼠于成都醫(yī)學(xué)院科研實驗中心SPF 級實驗動物中心動物房中飼養(yǎng)[SYXK(川)2020-0918],飼養(yǎng)條件:溫度25℃,相對濕度50%,噪音<80 分貝,自然光照,動物房環(huán)境/鼠籠清潔、透氣。經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)(LL-20200917)后實施本實驗;實驗動物符合3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

丙泊酚(H20030115,四川國瑞藥業(yè)有限公司,規(guī)格:200 mg);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(0765,上海研卉生物科技有限公司);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(G1120,北京索萊寶科技有限公司);甲苯胺藍(lán)(Nissl)染色試劑盒(6586-045,Sigma 公司);Tunel 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(11684795910,Roche 公 司);PKA 抗 體(ab236855)、磷酸化 CREB (p-CREB) 抗體(ab32096)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) 抗體(ab226843)均購自美國abcam 公司;BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶(P0768、P0231,美國Pierce)。手動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2125RTS,德國Leica);半干轉(zhuǎn)膜儀、蛋白電泳儀(Trans-Blot SD、1659001,美國Bio-Rad);凝膠成像儀(GIS-500,Miulab)光學(xué)顯微鏡(SMZ745,日本尼康)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 CIRI 模型建立及分組

按文獻(xiàn)[10]采用改良線栓法建立大鼠局灶性CIRI 模型:將50 只SD 大鼠禁食禁水12 h 后,以3%戊巴比妥鈉麻醉,固定(取仰臥位),于頸部正中切口,鈍性分離并暴露左側(cè)頸總動脈以及頸內(nèi)、頸外動脈,將尼龍線從頸外動脈插入至頸內(nèi)動脈,夾閉左側(cè)頸內(nèi)動脈,缺血2 h 后拔除線栓恢復(fù)缺血再灌注,縫合組織,并給予20 萬U 青霉素肌內(nèi)注射(術(shù)后連續(xù)使用3 d 以手術(shù)預(yù)防感染)。待大鼠蘇醒后放入籠中觀察。再灌注24 h 后,依據(jù)大鼠神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)評分[11]對大鼠感覺、運(yùn)動、反射、平衡等方面損傷情況進(jìn)行評定,將評分在大于7分以上大鼠納入實驗研究。48 只大鼠造模成功,隨機(jī)分為丙泊酚[11-12]低、中、高(10、25、50 mg/kg)劑量組及模型組(CIRI 組),每組12 只。另取12 只大鼠。除不插線夾閉左側(cè)頸內(nèi)動脈外,其余操作同模型組,大鼠蘇醒后,作為假手術(shù)組。各組大鼠于缺血再灌注24 h 后,開始給藥。丙泊酚用生理鹽水配制成1 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL 的溶液,丙泊酚各劑量組均按10 mL/kg 的劑量經(jīng)腹腔注射予相應(yīng)劑量的丙泊酚溶液,假手術(shù)組及模型組按10 mL/kg的劑量經(jīng)腹腔注射予生理鹽水。各給藥組連續(xù)給藥4 周,每天1 次。

1.3.2 神經(jīng)功能缺損評分(mNSS 評分)及腦梗死體積檢測

各組大鼠末次給藥12 h 后,參照文獻(xiàn)[13]用mNSS 評分對各組大鼠神經(jīng)缺損情況進(jìn)行評定,評分越高表明神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。完成mNSS 評分之后,各組均隨機(jī)取6 只大鼠,麻醉,取腦,于-20℃中冰凍。組織凍硬后,于冰上制備大腦冠狀切片。將切片置于2% TTC 染液中,37℃避光染色。白色是梗死灶,紅色是正常組織。4%多聚甲醛固定,4℃過夜,拍照。使用Image J 1.41 軟件統(tǒng)計腦切片的正常組織/梗死面積,計算梗死體積百分比:V %=(Al+A2+…+An)/(BI+B2+…+Bn)(n 為腦片序號,A 表示每個腦切片梗死區(qū)域面積,B 表示每個腦切片梗死側(cè)大腦半球面積)。

1.3.3 大鼠腦皮層組織Nissl 染色觀察

各組大鼠末次給藥12 h 后,取各組剩下6 只大鼠,麻醉后斷頭取腦,取0.5 g 腦皮層組織,于-80℃冰箱保存,剩余組織用4%多聚甲醛固定,經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后取4 μm 冠狀切片,根據(jù)試劑盒進(jìn)行Nissl 染色,在顯微鏡下觀察腦皮層組織神經(jīng)元細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)變化情況,采用變性細(xì)胞指數(shù)(損傷細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%)表示神經(jīng)元細(xì)胞受損程度。

1.3.4 Tunel 染色觀察腦皮層組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

將腦皮層組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、脫水、封閉后添加Tunel 工作液室溫下孵育1 h,隨后加入抗熒光猝滅劑進(jìn)行封片,在共聚焦顯微鏡下觀察切片中細(xì)胞凋亡情況,采用Image-pro plus 定量分析神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 Western blot 法檢測腦皮層組織PKA、pCREB、BNDF 蛋白相對表達(dá)水平

取1.3.3 中凍存的腦皮層組織,解凍,勻漿,分離出上清液,用蛋白提取試劑盒提取蛋白,蛋白定量BCA 試劑盒測定蛋白總濃度,上樣,電泳、轉(zhuǎn)膜,清洗,5%脫脂牛奶封閉1 h,清洗,加一抗(PKA、pCREB、BNDF、β-actin(內(nèi)參))抗體,4℃過夜,加入HRP 羊抗兔二抗,37℃孵育1 h,顯色,拍照,分析各組PKA、pCREB、BNDF 蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠mNSS 評分結(jié)果

與假手術(shù)組相比,丙泊酚各劑量組及模型組大鼠mNSS 評分升高(P<0.05);與模型組相比,丙泊酚低、中、高劑量組mNSS 評分降低(P<0.05),且丙泊酚各劑量組mNSS 評分呈劑量依賴性降低,見下表1。

2.2 各組大鼠腦梗死體積檢測結(jié)果

假手術(shù)組大鼠,TTC 染色顯示大腦組織呈均勻淡紅色,無腦梗死病灶;與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦梗死部位被染成白色,且梗死體積增大(P<0.05);與模型組相比,丙泊酚低、中、高劑量組組腦梗死體積呈劑量依賴性減小(P<0.05),見圖1,表2。

2.3 各組大鼠腦皮層組織神經(jīng)細(xì)胞變性指數(shù)及細(xì)胞凋亡率比較

假手術(shù)組大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞排列整齊,核仁清晰,細(xì)胞核周圍尼氏體顆粒多。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)不完整、細(xì)胞核皺縮,尼氏小體數(shù)量減少,且神經(jīng)細(xì)胞變性指數(shù)升高(P<0.05)。與模型組相比,丙泊酚各劑量組腦皮層神經(jīng)細(xì)胞上述結(jié)構(gòu)損傷程度逐漸減少,且細(xì)胞變性指數(shù)呈劑量依賴性降低(P<0.05);與模型組相比,丙泊酚各劑量組腦皮層組織中細(xì)胞凋亡率降低,且呈劑量依賴(P<0.05)。見圖2,表3。

2.4 各組大鼠腦組織PKA、pCREB、BNDF 蛋白表達(dá)結(jié)果

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦皮層組織PKA、pCREB、BNDF 蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與模型組相比,丙泊酚低、中、高劑量組腦皮層組織PKA、pCREB、BNDF 蛋白表達(dá)呈劑量依賴性升高(P<0.05),見圖3,表4。

表1 各組大鼠mNSS 評分比較(,n=12)Table 1 Comparison of MNSs scores of rats in each group

表1 各組大鼠mNSS 評分比較(,n=12)Table 1 Comparison of MNSs scores of rats in each group

注:與假手術(shù)組相比,?P<0.05;與模型組相比,△P<0.05;與丙泊酚低劑量組相比,#P<0.05;與丙泊酚中劑量組相比,?P<0.05。Note.Compared with the sham operation group,?P<0.05.Compared with the model group of propofol,△P<0.05.Compared with the low dose group of propofol,#P<0.05.Compared with the middle dose group of propofol,?P<0.05.

圖1 各組大鼠TTC 染色腦梗死圖Figure 1 TTC staining of cerebral infarction in each group

圖2 各組大鼠腦皮層組織Nissl 染色圖Figure 2 Nissl staining of cerebral cortex in each group

表2 各組大鼠腦梗死體積比較(,n=6)Table 2 Volume comparison of cerebral infarction in each group

表2 各組大鼠腦梗死體積比較(,n=6)Table 2 Volume comparison of cerebral infarction in each group

注:與假手術(shù)組相比,?P<0.05;與模型組相比,△P<0.05;與丙泊酚低劑量組相比,#P<0.05;與丙泊酚中劑量組相比,?P<0.05。Note.Compared with the sham operation group,?P<0.05.Compared with the model group of propofol,△P<0.05.Compared with the low dose group of propofol,#P <0.05.Compared with the middle dose group of propofol,?P<0.05.

圖3 各組大鼠腦皮層組織PKA、pCREB、BNDF 蛋白表達(dá)免疫印跡圖Note.A,Sham operation.B,Model.C,Low dose propofol.D,Middle dose propofol.E,High dose propofol.Figure 3 Western blot of PKA,pCREB and bndf protein expression in cerebral cortex of rats in each group

表3 各組大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞變性指數(shù)及細(xì)胞凋亡率比較(,n=6)Table 3 Comparison of degeneration index and apoptosis rate of neurons in cerebral cortex of rats 50 μm in each group

表3 各組大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞變性指數(shù)及細(xì)胞凋亡率比較(,n=6)Table 3 Comparison of degeneration index and apoptosis rate of neurons in cerebral cortex of rats 50 μm in each group

注:與假手術(shù)組相比,?P<0.05;與模型組相比,△P<0.05;與丙泊酚低劑量組相比,#P<0.05;與丙泊酚中劑量組相比,?P<0.05。Note.Compared with the sham operation group,?P<0.05.Compared with the model group of propofol,△P<0.05.Compared with the low dose group of propofol,#P<0.05.Compared with the middle dose group of propofol,?P<0.05.

表4 各組大鼠腦皮層組織PKA、pCREB、BNDF 蛋白表達(dá)比較(,n=6)Table 4 Protein expression comparison of PKA,pCREB and BNDF in cerebral cortex of rats in each group

表4 各組大鼠腦皮層組織PKA、pCREB、BNDF 蛋白表達(dá)比較(,n=6)Table 4 Protein expression comparison of PKA,pCREB and BNDF in cerebral cortex of rats in each group

注:與假手術(shù)組相比,?P<0.05;與模型組相比,△P<0.05;與丙泊酚低劑量組相比,#P<0.05;與丙泊酚中劑量組相比,?P<0.05。Note.Compared with the sham operation group,?P<0.05.Compared with the model group of propofol,△P<0.05.Compared with the low dose group of propofol,#P<0.05.Compared with the middle dose group of propofol,?P<0.05.

3 討論

CIRI 過程中,腦缺血后恢復(fù)血流供應(yīng),神經(jīng)細(xì)胞損傷、凋亡,尼氏小體變性、數(shù)量減少甚至消失,導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷。孫亞蒙等[14]發(fā)現(xiàn)CIRI 過程,缺血預(yù)處理,可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和神經(jīng)功能損傷。本研究采用線栓法制備大鼠CIRI 模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比,模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦梗死體積顯著升高,大鼠腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂,神經(jīng)元細(xì)胞變性、核溶解、固縮等病理損傷嚴(yán)重,尼氏小體數(shù)量變少,且變性細(xì)胞指數(shù)及腦皮層細(xì)胞凋亡率升高,提示模型大鼠腦組織出現(xiàn)病理損傷,神經(jīng)功功能損傷,與文獻(xiàn)[14]腦缺血再灌注損傷動物模型表現(xiàn)一致,表明大鼠CIRI 模型制備成功。

丙泊酚是一種全身靜脈麻醉藥,具有起效快、蘇醒迅速且完全、不良反應(yīng)少等特點,被廣泛應(yīng)用于多種短小手術(shù)的麻醉和鎮(zhèn)靜。近年研究證實,丙泊酚在呼吸、循環(huán)、泌尿等多種系統(tǒng)中發(fā)揮器官保護(hù)作用,而其對腦保護(hù)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用,也受到了特別重視和廣泛關(guān)注[9]。薛青等[15]及趙晶等[16]研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可通過抑制腦細(xì)胞凋亡、改善血腦屏障來發(fā)揮CIRI 腦保護(hù)作用;張熙等[17]研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可改善CIRI 大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及學(xué)習(xí)認(rèn)知功能。本研究顯示,丙泊酚各劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積、神經(jīng)元細(xì)胞變性指數(shù)及凋亡率低于模型組,尼氏小體數(shù)量多于模型組,腦皮層病理損傷輕于模型組,表明丙泊酚可抑制CIRI 大鼠腦損傷,減輕神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,有助于提高CIRI 大鼠神經(jīng)功能。但丙泊酚腦保護(hù)作用的機(jī)制復(fù)雜,可能涉及多通路、多位點,其對神經(jīng)功能保護(hù)途徑及分子生物學(xué)機(jī)制不甚明確,本研究繼續(xù)探究丙泊酚對CIRI 過程中神經(jīng)功保護(hù)作用的分子機(jī)制,以期闡明丙泊酚發(fā)揮腦保護(hù)的其他分子生物學(xué)機(jī)制,具有一定的臨床意義。

突觸是神經(jīng)元間信息交流的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)有賴于突觸結(jié)構(gòu)和功能的完整[18]。而CIRI 過程中,低灌注和缺氧導(dǎo)致的皮層神經(jīng)元損傷、腦內(nèi)突觸信息傳遞的完整性和準(zhǔn)確性破壞,是導(dǎo)致患者神經(jīng)功能受損、甚至致殘的主要原因[19]。因此提高缺血損傷后神經(jīng)突觸的重塑,是改善神經(jīng)功能損傷的重要途徑之一。PKA 介導(dǎo)的信號通路與突觸形成、信號傳遞及維持起重要作用[20]。PKA可磷酸化下游蛋白CREB,上調(diào)突觸受體的表達(dá),發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)作用;活化的CREB 又可調(diào)控下游靶蛋白BNDF 表達(dá),進(jìn)而維持和促進(jìn)神經(jīng)元存活、分化,促進(jìn)突觸形成、重塑,并能維持突觸的傳遞效能,從而保護(hù)神經(jīng)[21]。本研究顯示,模型組大鼠腦皮層組織PKA、p-CREB、BNDF 蛋白表達(dá)低于假手術(shù)組,表明模型組大鼠腦皮層組織中PKA/CREB/BNDF 信號通路被抑制,可能與神經(jīng)元及突觸功能受損有關(guān)。近年亦有其它研究發(fā)現(xiàn),PKA/CREB/BNDF 信號通路參與腦缺血損傷過程中神經(jīng)保護(hù)的調(diào)控作用,Bai 等[7]研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可上調(diào)PKA、p-CREB、BNDF 蛋白表達(dá),改善CIRI 中神經(jīng)功能損傷及腦損傷作用;官俏兵等[22]發(fā)現(xiàn)丁苯酞可上調(diào)p-CREB、BNDF 蛋白表達(dá),改善小鼠CIRI 認(rèn)知障礙。而丙泊酚是否影響CIRI 過程中的PKA/CREB/BNDF 信號通路尚未見報道。本研究中丙泊酚各劑量組大鼠腦皮層PKA、p-CREB、BNDF 蛋白呈劑量依賴性增高,且高于模型組,表明丙泊酚可激活CIRI 大鼠腦皮層組織中PKA/CREB/BNDF 通路蛋白表達(dá),可能是其改善神經(jīng)功能損傷的作用機(jī)制。

綜上所述,丙泊酚可激活CIRI 大鼠腦皮層PKA/CREB/BNDF 通路蛋白表達(dá),改善神經(jīng)功能損傷,可能為闡明丙泊酚治療CIRI 和發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用提供一定參考。但本研究僅對腦CIRI 過程PKA/CREB 通路蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究,未設(shè)置通路抑制劑進(jìn)行驗證,且發(fā)揮腦保護(hù)和神經(jīng)保護(hù)功能的靶點和通路亦具有多樣性,丙泊酚發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的具體生物學(xué)機(jī)制仍需繼續(xù)研究。