李 雪， 耿學(xué)斯， 程一乘， 劉 薇， 劉立陽， 劉仍海

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院肛腸科；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)廈門醫(yī)院肛腸科；4.中日友好醫(yī)院肛腸科

功能性疾病所致的便秘通常分為正常傳輸型便秘、慢傳輸型便秘、排便障礙型便秘、混合型便秘。其中排便障礙型便秘在慢性便秘中最常見，占25%～74%，其特點是直腸排出受阻，表現(xiàn)為直腸推進力不足和(或)排出阻力增加[1]。普遍認為功能性排便障礙(functional defecation disorder，F(xiàn)DD)的發(fā)生可能與腸道動力異常、內(nèi)臟感覺異常、精神心理及社會因素、腸道感染等因素相關(guān)。但目前對FDD的生理機制仍不清楚，給臨床診斷及治療帶來較大困難。近年來國內(nèi)外在大鼠、豚鼠、家兔等動物體內(nèi)利用止瀉劑、抗動力劑、瀉劑、手術(shù)的方法建立了不同類型的便秘模型，在其病理生理研究、藥理研究、新藥開發(fā)等方面取得了較大的進展，但尚缺乏對于FDD動物模型的構(gòu)建方法。低纖維飲食便秘模型常用于結(jié)腸功能失調(diào)相關(guān)的致便秘機制研究中，亞甲藍能夠阻止神經(jīng)興奮傳導(dǎo)，對神經(jīng)末梢具有可逆性麻痹作用，所以本研究嘗試利用低纖維飲食聯(lián)合亞甲藍肛門注射法構(gòu)建動物模型，通過對大鼠排便情況、排便功能檢測、行為學(xué)檢測、組織形態(tài)學(xué)、血清及直腸組織中腦腸肽含量的觀察對該模型進行評價，以期模擬一種具有針對性的FDD動物模型，為該疾病進一步的基礎(chǔ)研究及臨床治療方法開發(fā)提供載體。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD雄性大鼠36只，SPF級，8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證編號：SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度22～25 ℃，濕度50%～70%，晝夜光照恒定12 h/12 h。動物實驗處理均嚴格遵循動物福利原則及北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會的要求。

1.2 實驗試劑與儀器亞甲藍注射液(濟川藥業(yè)集團)；2%利多卡因注射液(哈藥集團三精制藥公司)。大鼠5-HT、P物質(zhì)、乙酰膽堿(acetylcholin, Ach)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AchE)ELISA試劑盒均由Solarbio公司提供。EG1150型石蠟包埋儀、RM2235型石蠟切片機、DM3000型正置熒光顯微鏡、G1150H型均為德國Leica公司產(chǎn)品；loveq-va5型直腸壓力測試計(韓國OMOMED公司)。

1.3 動物模型的制備、分組及給藥36只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，采用隨機數(shù)字表法隨機分為空白對照組、低纖維飲食組、利多卡因組、亞甲藍低劑量組、亞甲藍中劑量組、亞甲藍高劑量組，每組6只。空白對照組采用普通繁殖飼料飼養(yǎng)，其余各組均采用低纖維飼料飼養(yǎng)；低纖維飲食配方為：41.5%玉米淀粉，24.5%牛奶酪蛋白，10.0%蔗糖，10.0%糊精，7.0%礦物混合物，6.0%玉米油，1%纖維素混合物[由科澳協(xié)力飼料有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2014-0010]。各組均自由飲水，飼養(yǎng)第63天，對利多卡因組、亞甲藍低劑量組、亞甲藍中劑量組、亞甲藍高劑量組分別予以2 ml 2%利多卡因、0.05%亞甲藍注射液、0.1%亞甲藍注射液、0.2%亞甲藍注射液(由2%利多卡因溶液配制)，肛周及直腸周圍間隙注射1次，實驗第77天取材。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 一般行為表現(xiàn)及排便情況：每日觀察各組大鼠精神狀態(tài)、活動情況、進食量、飲水量、毛發(fā)光澤程度等情況。記錄大鼠24 h糞便總質(zhì)量。

1.4.2 胃腸傳輸功能檢測：大鼠禁食水12 h，給予各組大鼠10%碳素墨水混懸液2 ml灌服，30 min后以10%水合氯醛0.2 ml/100 mg腹腔注射麻醉，取幽門到直腸末端全部腸道，在松弛狀態(tài)下測量腸道的全長及碳素墨水混懸液在腸道內(nèi)推進的長度，并計算碳素墨水混懸液推進長度與腸道全長的比值。碳墨推進比值=墨汁前端到幽門的距離(cm)/腸道總長度(cm)。

1.4.3 排便功能檢測：采用模擬球囊排出法和肛管直腸壓力測定法檢測。分別于實驗前及實驗后第62天、第69天、第76天測定，測定前需輔助大鼠排盡直腸內(nèi)糞便，并將大鼠固定。選取直徑4～5 mm干黃豆，經(jīng)石蠟油潤滑后將干黃豆置入直腸內(nèi)2 cm處，記錄黃豆排出時間。肛管內(nèi)置入8 Fr導(dǎo)尿管并與直腸壓力測試儀連接，測量大鼠肛管直腸靜息壓。

1.4.4 行為學(xué)檢測：于實驗第69、76天進行高架十字迷宮實驗檢測。將實驗動物放入迷宮中央?yún)^(qū)，頭朝開臂。同時開啟攝像監(jiān)控器記錄5 min內(nèi)大鼠開臂進入次數(shù)(OE)、閉臂進入次數(shù)(CE)、開臂滯留時間(OT)、閉臂滯留時間(CT)。開臂進入次數(shù)百分比(OE%)=OE/(OE+CE)×100%，開臂滯留時間百分比(OT%)=OT/(OT+CT)×100%。

1.4.5 組織形態(tài)學(xué)觀察：于實驗第77天，大鼠經(jīng)麻醉后脫頸處死，各組大鼠腹主動脈取血后取結(jié)腸、直腸組織，一部分固定于10%甲醛溶液中用于制備石蠟切片，另一部分置于-80 ℃冰箱中待用。大鼠組織經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色后，光鏡下觀察大鼠組織形態(tài)學(xué)病理學(xué)變化并使用IPP 6.0圖像分析軟件，每個標本選3張切片進行拍照保存。

1.4.6 大鼠外周血中5-HT、P物質(zhì)、Ach的含量情況：采用ELISA法檢測。大鼠取血后，室溫靜置2 h后，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，分裝于EP管中，置于-80 ℃冰箱保存；實驗時血清樣本室溫復(fù)融，混勻后嚴格按照5-HT、P物質(zhì)、Ach試劑盒說明書步驟進行測定。

1.4.7 大鼠直腸組織中CGRP、AchE的含量情況：采用ELISA法檢測。各組取6只大鼠，取組織勻漿，嚴格按照CGRP、AchE試劑盒說明書步驟進行測定。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般行為表現(xiàn)及排便情況空白對照組實驗前后飲水、進食情況良好，毛發(fā)光澤良好，精神狀態(tài)佳，未見精神萎靡或躁動，排便及排尿情況可，無死亡，活動無異常；其余各組大鼠實驗后較空白對照組進食量減少，毛發(fā)光澤度差，脫毛情況嚴重，精神狀態(tài)較差，未見精神躁動，活動量減少；注射后，利多卡因組和亞甲藍各劑量組較低纖維飲食組大鼠，毛發(fā)更為稀疏，且偶有躁動。

如表1所示，實驗前各組大鼠糞便呈褐色，糞便質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗第62天，空白對照組大鼠糞便質(zhì)量升高，低纖維飲食組、利多卡因組及亞甲藍各劑量組糞便呈深褐色，與空白對照組比較，糞便質(zhì)量降低(P均<0.05)。肛周注射后(實驗第69、76天)，與空白對照組比較，低纖維飲食組、利多卡因組及亞甲藍各劑量組大鼠糞便出現(xiàn)不同程度的變干變硬，低纖維飲食組和利多卡因組糞便呈深褐色，亞甲藍各劑量組糞便呈黑褐色，糞便質(zhì)量均明顯降低(P<0.05)；與低纖維飲食組比較，利多卡因組糞便性狀變化不大，亞甲藍各劑量組大鼠糞便更為干硬，體積小，但糞便質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。其中，肛周注射第1周(實驗第69天)，亞甲藍中劑量組糞便質(zhì)量最低；與低纖維飲食組相比，亞甲藍中劑量組、亞甲藍高劑量組在肛周注射后糞便質(zhì)量減輕，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與利多卡因組比較，亞甲藍各劑量組大鼠糞便質(zhì)量均降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠糞便質(zhì)量Tab 1 Stool weight of rats in each group g)

2.2 各組大鼠胃腸傳輸功能情況各組大鼠碳墨推進比值相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠碳墨推進比值Tab 2 Carbon-ink propulsion ratio in each group

2.3 各組大鼠排便功能變化情況

2.3.1 各組大鼠模擬球囊排出情況：如表3所示，肛周注射前各組大鼠黃豆排出時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與空白對照組相比，肛周注射1周，利多卡因組和亞甲藍各劑量組黃豆排出時間增加(P<0.05)，而低纖維飲食組無顯著變化；肛周注射第2周，低纖維飲食組仍無顯著變化，利多卡因組和亞甲藍各劑量組黃豆排出時間增加，但較注射1周時略有減少。與低纖維飲食組比較，肛周注射后，利多卡因組及亞甲藍各劑量組排出時間均有不同程度的增加，但只有亞甲藍各劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與利多卡因組比較，肛周注射1周，亞甲藍各劑量組排出時間增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；肛周注射2周，亞甲藍各劑量組排出時間增加，亞甲藍中劑量組和亞甲藍高劑量組與利多卡因組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠模擬球囊排出時間Tab 3 Simulated balloon expulsion time of rats in each group s)

2.3.2 各組大鼠肛管直腸靜息壓情況：如表4所示，肛周注射前，各組大鼠肛管靜息壓無顯著變化。與空白對照組比較，肛周注射后，低纖維飲食組無顯著變化，利多卡因組及亞甲藍各劑量組肛管靜息壓下降(P<0.05)，但注射2周較注射1周肛管靜息壓略有回升。肛周注射后，與低纖維飲食組比較，利多卡因組及亞甲藍各劑量組肛管靜息壓均有不同程度下降(P<0.05)。與利多卡因組對比，肛周注射后，亞甲藍各劑量組肛管靜息壓降低(P<0.05),其中亞甲藍中劑量組在注射1周后肛管直腸靜息壓最低。

表4 各組大鼠肛管直腸靜息壓情況Tab 4 Comparison of the resting pressure of anorectal canal of rats in each group cmH2O)

2.4 各組大鼠行為學(xué)變化情況如表5所示，與空白對照組比較，肛周注射后，低纖維飲食組大鼠OT%和OE%差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，利多卡因組及亞甲藍各劑量組OT%、OE%均顯著下降(P<0.01)。與低纖維飲食組比較，肛周注射后，利多卡因組及亞甲藍各劑量組OT%、OE%下降(P<0.05)。與利多卡因組對比，肛周注射后，亞甲藍各劑量組OT%及OE%差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表5 各組大鼠高架十字迷宮檢測情況Tab 5 Elevated plus-maze test of rats in each %)

2.5 各組大鼠組織病理結(jié)果如圖1～2所示，空白對照組：結(jié)、直腸組織中腺體排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，未見明顯充血、水腫，無明顯炎性細胞浸潤；低纖維飲食組：腺體排列欠整齊，固有層及黏膜下層出現(xiàn)少量的炎性浸潤；利多卡因組：固有層有少量炎性細胞外，黏膜肌層和黏膜下層均存在大量炎性浸潤，且伴有明顯的血管擴張充血；亞甲藍低劑量組：固有層可見大量的炎性細胞浸潤，黏膜下層可見血管擴張；亞甲藍中劑量組：固有層可見少量炎性細胞，黏膜肌層及下層則見大量炎性細胞浸潤，血管擴張；亞甲藍高劑量組：黏膜下層出現(xiàn)大量的淋巴細胞浸潤，并伴血管擴張。

注：A:空白對照組；B:低纖維飲食組；C:利多卡因組；D:亞甲藍低劑量組；E:亞甲藍中劑量組；F:亞甲藍高劑量組。圖1 各組大鼠結(jié)腸組織學(xué)變化(HE染色，100×)Fig 1 Histological changes of rats colon tissue in each group (HE staining, 100×)

注：A:空白對照組；B:低纖維飲食組；C:利多卡因組；D:亞甲藍低劑量組；E:亞甲藍中劑量組；F:亞甲藍高劑量組。圖2 各組大鼠直腸組織學(xué)變化(HE染色，100×)Fig 2 Histological changes of rats rectal tissue in each group (HE staining, 100×)

2.6 各組大鼠血清腦腸肽的含量情況如表6所示，與空白對照組對比，低纖維飲食組、利多卡因組、亞甲藍各劑量組大鼠血清5-HT含量水平明顯降低(P<0.05)，其中亞甲藍中劑量組下降最多；與低纖維飲食組對比，利多卡因組及亞甲藍各劑量組含量水平均降低(P<0.05)；與利多卡因組對比，亞甲藍低劑量組含量水平略有回升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，亞甲藍中劑量組、亞甲藍高劑量組含量水平下降(P<0.05)。與空白對照組對比，低纖維飲食組、利多卡因組及亞甲藍各劑量組大鼠血清P物質(zhì)含量水平均有不同程度的降低，其中只有亞甲藍中劑量組、亞甲藍高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，亞甲藍中劑量組下降最多；與低纖維飲食組對比，利多卡因組及亞甲藍低劑量組含量水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，亞甲藍中劑量組、亞甲藍高劑量組含量水平降低(P<0.05)；與利多卡因組對比，亞甲藍各劑量組含量水平均有下降，其中亞甲藍中劑量組、亞甲藍低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與空白對照組對比，低纖維飲食組、利多卡因組及亞甲藍各劑量組大鼠血清Ach含量水平均有不同程度的降低，其中只有亞甲藍各劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且亞甲藍中劑量組下降最多；與低纖維飲食組對比，亞甲藍各劑量組含量水平降低(P<0.05)，利多卡因組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與利多卡因組對比，亞甲藍各劑量組含量水平均有下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表6 各組大鼠血清腦腸肽的含量情況Tab 6 Brain-gut peptide contents in serum of rats in each group pg/ml)

2.7 各組大鼠直腸組織中CGRP、AchE的含量情況

如表7所示，與空白對照組對比，低纖維飲食組、利多卡因組及亞甲藍各劑量組大鼠直腸組織中CGRP含量升高，AchE含量下降。其中，亞甲藍各劑量組CGRP含量較空白對照組升高(P<0.05)；利多卡因組及亞甲藍各劑量組AchE含量較空白對照組降低(P<0.05)；與低纖維飲食組對比，亞甲藍中劑量組CGRP含量升高，AchE含量降低(P<0.05)；與利多卡因組對比，亞甲藍中劑量組、亞甲藍高劑量組CGRP含量升高(P<0.05)，亞甲藍中劑量組AchE含量較利多卡因組降低(P<0.05)。

表7 各組大鼠直腸組織中CGRP、AchE含量情況Tab 7 Contents of CGRP and AchE in rats rectal tissue in each group pg/ml)

3 討論

FDD是一類以功能型便秘(長期的排便困難、排便不暢、排便次數(shù)減少、糞便干結(jié)及量少)為主要臨床表現(xiàn)，伴見矛盾的肛門收縮、不完全肛門松弛、直腸推力不足或低敏感性的功能性疾病。其診斷標準需滿足便秘及特征性排便功能下降的條件。目前便秘的造模方法多樣，以往模擬慢傳輸型便秘、便秘型腸易激綜合征、瀉藥性便秘的動物模型在基礎(chǔ)研究中得到了廣泛應(yīng)用，然而尚無公認的FDD動物模型[2]。國內(nèi)研究中，有研究通過使用直腸縮窄法構(gòu)建出口梗阻型便秘模型的報道，但出口梗阻型便秘并不能完全解釋FDD[3]。低纖維飲食便秘模型能夠模擬人類不良飲食習(xí)慣引起的非病理性因素便秘，由于該造模方法不但簡單易行，且能夠避免藥物對大鼠產(chǎn)生的一系列的不良反應(yīng)，常被用于結(jié)腸功能失衡相關(guān)的便秘機制研究[4]。實驗中我們發(fā)現(xiàn)，低纖維飲食大鼠在實驗開始1周后，1/3大鼠開始出現(xiàn)糞便干結(jié)、變細，顏色變深，實驗第4周，半數(shù)大鼠糞便出現(xiàn)干結(jié)，實驗第8周后，各組大鼠糞便干結(jié)，呈深褐色，糞便質(zhì)量明顯低于空白對照組，體質(zhì)量增長速度明顯減慢。其結(jié)、直腸組織形態(tài)學(xué)及血清5-HT的含量水平也與功能型便秘更為貼近，但排便功能、行為學(xué)方面與空白對照組大鼠差異均無統(tǒng)計學(xué)意義[5]。

《羅馬Ⅳ》中認為排便功能的異常主要包括不協(xié)調(diào)排便或排便推進力不足。不協(xié)調(diào)排便主要指大腦在接受排便指令后調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉，使肛提肌、肛門括約肌等排便肌肉在有規(guī)律的松弛或緊張的過程中，出現(xiàn)肌肉矛盾運動；排便推進力不足主要指控制排便的肌群在接受排便指令后能夠松弛，但無法維持足夠排便壓，無力將大便排出，同時也可伴見直腸靜息壓下降等表現(xiàn)[6]。在構(gòu)建大鼠FDD模型的過程中，由于控制排便的肌肉和神經(jīng)涉及多個肌群，且大鼠肛門括約肌薄弱，構(gòu)建多肌群矛盾運動較為困難。由于大鼠直腸壓力主要由肛門括約肌維持，我們認為對大鼠肛門括約肌周圍神經(jīng)進行緩慢阻滯可以降低直腸壓力，從而模擬排便推進力不足。利多卡因是短效、局部麻醉藥，具有較好的鎮(zhèn)痛作用，實驗中我們發(fā)現(xiàn)，盡管局部肛周注射利多卡因，與低纖維飲食組大鼠對比，其糞便重量、排便功能、行為學(xué)及血清、直腸中腦腸肽含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但大鼠的配合度較高，注射后無明顯弓背、狂躁等表現(xiàn)。亞甲藍是一種吩噻嗪鹽，具有親神經(jīng)性，其肛周皮膚及括約肌注射后可以緩慢麻痹肛門括約肌，不至于瞬間麻痹排便肌肉而導(dǎo)致失禁；且作為可逆性神經(jīng)肌肉阻滯劑，正常劑量不會對肛門括約肌造成永久性損傷，與FDD盆底肌功能障礙的可習(xí)得、可治愈的生理表現(xiàn)相似[7]。因此，我們將亞甲藍與2%利多卡因配比稀釋進行大鼠肛周注射。注射后，相對于低纖維飲食組，糞便質(zhì)量及結(jié)、直腸組織形態(tài)學(xué)方面并無明顯的改變，但出現(xiàn)了排便功能的異常(球囊排出時間延長、直腸靜息壓力下降)，這些與臨床實驗中的結(jié)果具有一致性[8]。

腸神經(jīng)系統(tǒng)、腸神經(jīng)遞質(zhì)的紊亂可能引起嚴重的便秘，便秘患者常表現(xiàn)出腦腸肽表達水平的下調(diào)[5，9-10]。因此，除了排便功能及行為學(xué)的檢測，我們對大鼠血清及直腸中腦腸肽含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)大鼠在注射亞甲藍前除5-HT外，均無明顯變化，注射亞甲藍后，亞甲藍各劑量組血清及直腸腦腸肽含量與低纖維飲食組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中亞甲藍中劑量組最為顯著，提示大鼠注射亞甲藍后存在腸神經(jīng)調(diào)節(jié)的紊亂。此外，我們也檢測了各組大鼠胃腸傳輸情況，發(fā)現(xiàn)各組大鼠結(jié)腸碳墨推進比值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示該模型對胃腸動力未有改變，這與《羅馬Ⅳ》及《中國慢性便秘專家共識意見(2019，廣州)》對于FDD的診斷標準一致[6，11]。綜上，低纖維飲食聯(lián)合亞甲藍肛周注射法從糞便性狀、肛門動力學(xué)、行為學(xué)方面能夠較好地模擬FDD發(fā)病情況，操作簡便，可重復(fù)性較高，可以作為FDD的動物模型，進行進一步的基礎(chǔ)研究。