吳力亞，吳天祥，汪玲

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025)2(貴州食品工程職業(yè)學(xué)院，貴州 貴陽，550025)

灰樹花(Grifolafrondosa)是一種藥食兩用真菌[1-2]，含有豐富的生物活性成分，如多糖、黃酮、多酚、蛋白質(zhì)、麥角甾醇、真菌SOD酶等[3-5]，尤其多糖組分具有很高的藥用價(jià)值，如抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、降血糖[8]、降血脂[8-9]、提高機(jī)體免疫活性[6,10]等。利用中藥與真菌進(jìn)行共發(fā)酵是一種新的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，趙亮等[11]在灰樹花發(fā)酵體系中，添加苦蕎的乙醇提取液，對灰樹花生物量和次級代謝產(chǎn)物有一定的促進(jìn)作用；楊海龍等[12]探究篩選了不同中藥提取液對靈芝深層發(fā)酵的影響；盧紅云等[13]通過向灰樹花液體培養(yǎng)基中加入天麻醇提物，促進(jìn)了灰樹花纖維素酶、淀粉酶、漆酶等酶的活性，其活性的大小與灰樹花的生長和代謝產(chǎn)物積累具有一定的關(guān)聯(lián)。本課題組前期研究顯示，添加一定比例的天麻醇提物能夠顯著地提高灰樹花生物量和多糖的產(chǎn)量，并且與未添加組相比，能夠顯著提高多糖的生物活性[6,14]，如抗氧化、降血糖、降血脂、提高機(jī)體免疫力等[15]。

茯苓為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，含β-茯苓聚糖和三萜類化合物(乙酰茯苓酸、茯苓酸、3β-羥基羊毛甾三烯酸)[3,16-18]。LI 等[19]喂食小鼠茯苓粗提物及茯苓三萜類化合物，能夠改善糖尿病小鼠的血糖水平;TIAN 等[20]的研究表明，茯苓多糖能夠通過調(diào)節(jié)TLR4/TRAF6/NF-κB信號通路進(jìn)而表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)的目的是向灰樹花液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同比例、不同溶劑提取的茯苓提取物，探究對灰樹花生物量及次級代謝產(chǎn)物的影響，以期探究一種茯苓提取物的最適添加比例，進(jìn)而為茯苓參與真菌液態(tài)深層發(fā)酵提供思路及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花(Grifolafrondosa，菌種編號：5.404)，中國普通微生物菌種保藏管理中心；茯苓，北京同仁堂參茸中藥制品有限公司；蘆丁標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)、牛血清白蛋白標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)、考馬斯亮藍(lán)G-250，北京索萊寶生物科技有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水硝酸鋁、亞硝酸鈉，上海阿拉丁試劑有限公司；其他試劑均為市售分析純。

斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基。

液體種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 30，KH2PO40.5，蛋白胨 2，MgSO4·7H2O 0.5，酵母膏 6，pH 自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 50，KH2PO40.5，蛋白胨 5，MgSO4·7H2O 2，酵母膏 10，pH 自然。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-30 R型立式滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE—2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SW-CJ-1D型凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機(jī)，長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；ZWY-C2112 B型雙層旋轉(zhuǎn)式可編程恒溫恒濕搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；CTFD-12S型真空冷凍干燥機(jī)，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 灰樹花菌種培養(yǎng)方法

斜面種子培養(yǎng)：從母種試管中挑取黃豆粒大小菌絲塊接種于PDA培養(yǎng)基斜面中部，25 ℃恒溫培養(yǎng)，至菌絲長滿整個(gè)斜面，轉(zhuǎn)置4 ℃保存。

液體種子培養(yǎng)：用接種勺在斜面菌種管中刮取1勺細(xì)小菌絲體,接種于液體種子培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝液量為100 mL種子液，加入少許細(xì)小玻璃珠，于25 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)6 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：無菌條件下，按體積分?jǐn)?shù)為10%的接種量，移取10 mL種子液接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL三角錐形瓶裝液量為100 mL發(fā)酵液,于25 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)12 d。

1.3.2 茯苓提取液的制備

茯苓粉的制備：取茯苓菌核，50 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎機(jī)粉碎，過80目篩。

茯苓水提液的制備：取20 g茯苓粉末，加200 mL蒸餾水，90 ℃條件下回流提取4 h，抽濾得上清液，粉末繼續(xù)回流提取，重復(fù)3次，合并上清液，減壓濃縮蒸發(fā)至200 mL，即得0.1 g/mL的茯苓水提液。

茯苓醇提液的制備：取20 g茯苓粉末，加200 mL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，70 ℃條件下回流提取4 h，抽濾得上清液，粉末繼續(xù)回流提取，重復(fù)3次，合并上清液，減壓濃縮蒸發(fā)至200 mL，即得0.1 g/mL的茯苓醇提液。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量的測定

灰樹花生長以其菌絲體生物量為指標(biāo)。將發(fā)酵培養(yǎng)后的培養(yǎng)基用濾紙過濾，收集菌絲體，蒸餾水沖洗3次并于60 ℃烘箱中烘干至恒重，稱取質(zhì)量，即為菌絲體生物量。

1.4.2 多糖含量的測定[21]

(1) 胞外多糖的測定：取5 mL上述濾液，加入4倍體積的95%乙醇，于4 ℃冰箱中靜置24 h，6 000 r/min離心15 min后收集沉淀，用95%乙醇重復(fù)洗滌，最后于60 ℃烘干，加蒸餾水復(fù)溶，作為待測樣品溶液，用苯酚硫酸法測定胞外多糖的含量。

(2) 胞內(nèi)多糖的測定：精確稱取1 g菌絲體粉末，加入50 mL蒸餾水，超聲提取5 h，過濾收集濾液，加蒸餾水定容到50 mL，作為待測樣品溶液，用苯酚硫酸法測定胞內(nèi)多糖含量。

1.4.3 蛋白含量的測定[22]

(1) 胞外蛋白含量的測定：取100 mL上述濾液，濃縮后并加蒸餾水定容到10 mL，作為待測樣品溶液，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。

(2) 胞內(nèi)蛋白含量的測定：精確稱取1 g菌絲體粉末，加入50 mL蒸餾水，超聲提取5 h，過濾收集濾液，加蒸餾水定容到50 mL，作為待測樣品溶液，用考馬斯亮藍(lán)法測定胞內(nèi)蛋白含量。

1.4.4 總黃酮含量的測定[23]

(1) 胞外總黃酮含量的測定：取100 mL上述濾液，減壓濃縮并加蒸餾水定容到10 mL，作為待測樣品溶液，采用NaNO2、Al(NO3)3顯色法測量，總黃酮含量以蘆丁當(dāng)量表示。

(2) 胞內(nèi)總黃酮含量的測定：精確稱取1 g菌絲體粉末，加入50 mL 70%的乙醇，超聲提取5 h，過濾收集濾液，加70%乙醇定容50 mL作為待測樣品溶液。

1.4.5 發(fā)酵液還原糖[24]及pH的測定

取1 mL上述過濾后的濾液，用蒸餾水定容至50 mL，取1 mL稀釋液于25 mL的具塞比色皿中，加1 mL蒸餾水，再加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，搖勻后，沸水浴加熱5 min，冷卻至室溫定容至25 mL，于540 nm處測定吸光值。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n±SD)表示(n=3)。使用Origin 10 軟件畫圖，SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用單因素方差分析(ANOVA)和t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茯苓提取物添加量對灰樹花菌絲體的影響

向灰樹花液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同比例的茯苓醇提物和水提物，兩者添加比例對灰樹花生物量的影響如圖1所示。隨著添加物質(zhì)量濃度的增加，生物量表現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在茯苓醇提液添加量為5 g/L和茯苓水提液為7 g/L時(shí)對其生物量影響顯著(P<0.05)，達(dá)到最大生物量，分別為(1.505±0.03)g/L和(1.573±0.06)g/L，相較于空白組分別提高了24.28%和29.04%，說明一定質(zhì)量濃度的茯苓醇提物和水提物參與灰樹花發(fā)酵能夠促進(jìn)灰樹花的生長。

圖1 不同茯苓提取物添加量對灰樹花生物量的影響Fig.1 Effect of different additions of Poria cocos extract on the biomass of Grifola frondosa注：**P<0.05,##P<0.05;表示與空白組(0 g/L)相比具有顯著差異

2.2 不同添加量的茯苓提取物對灰樹花胞外和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

由圖2可知，不同茯苓提取物的添加比例，對灰樹花胞外多糖的分泌及胞內(nèi)多糖的產(chǎn)生具有先升高后降低的趨勢。

圖2 不同茯苓提取物添加量對灰樹花多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different additions of Poria cocos extract on the yield of polysaccharide of Grifola frondosa注：**P<0.05,##P<0.05,++P<0.05,分別表示與空白組(0 g/L)相比具有顯著差異

在茯苓醇提物為5 g/L時(shí)，對灰樹花胞內(nèi)和胞外多糖的產(chǎn)生均有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，且醇提物的促進(jìn)作用高于水提液，分別達(dá)到最大多糖產(chǎn)量[胞內(nèi)(4.15±0.079)%和胞外(1.434±0.02) g/L]，相較于空白組[胞內(nèi)(3.19±0.066)%和胞外(1.217±0.016) g/L)]分別提高了30.09%和17.8%，多糖產(chǎn)量的增加可能是茯苓提取液中的某些成分影響了參與灰樹花多糖合成代謝酶的活性，也可能是灰樹花產(chǎn)生的胞外酶對提取液主要成分進(jìn)行了分解，作為營養(yǎng)物質(zhì)，提供自身生長代謝的需求。由于茯苓中含有大量的多聚糖，為了降低茯苓多糖對多糖檢測造成干擾，故不把茯苓水提液作為影響胞外多糖產(chǎn)量的一個(gè)因素。茯苓水提物在7 g/L添加量時(shí)對胞內(nèi)多糖分泌具有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為(3.88±0.106)%，與空白組(3.24±0.032)%相比提高了19.8%，所以適宜質(zhì)量濃度的茯苓提取物參與灰樹花發(fā)酵時(shí)，均能夠促進(jìn)多糖的產(chǎn)生，高質(zhì)量濃度的茯苓提取物對其多糖產(chǎn)生具有抑制作用，這與本課題組的研究課題天麻參與灰樹花液態(tài)發(fā)酵的促進(jìn)趨勢相類似[25]。

2.3 不同添加量的茯苓提取物對灰樹花胞外和胞內(nèi)蛋白產(chǎn)量的影響

由圖3可知，茯苓提取物對灰樹花胞外、胞內(nèi)蛋白的產(chǎn)量均有一定的影響，與黃忠等[26]采用天麻參與灰樹花發(fā)酵趨勢相似。醇提物在5 g/L時(shí)與空白組相比，對其胞外和胞內(nèi)蛋白產(chǎn)量均有最顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，胞外和胞內(nèi)蛋白產(chǎn)量分別為(55.28±0.219)mg/L和(4.597±0.172)%，相較于空白組胞內(nèi)和胞外蛋白(50.03±0.006)mg/L和(4.17±0.056)%分別提高了10.49%和10.24%。水提液在添加量為7 g/L和9 g/L時(shí)，分別對胞外和胞內(nèi)蛋白的產(chǎn)量具有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，在水提液最適添加量時(shí)，胞外和胞內(nèi)蛋白的最佳產(chǎn)量為(55.152±0.029)mg/g和(4.536±0.029)%,相較于空白組胞內(nèi)和胞外(50.026±0.014) mg/L和(4.17±0.056)%分別提高了10.24%和8.78%?？傮w來說，茯苓水提物促進(jìn)效果略低于茯苓醇提物的效果，可能原因是茯苓里的藥用活性成分更容易溶于有機(jī)溶劑，活性成分含量高于茯苓水提物。

圖3 不同茯苓提取物添加量對灰樹花蛋白產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different additions of Poria cocos extract on the yield of protein of Grifola frondosa注：**P<0.05,##P<0.05,++P<0.05,aa P<0.05,分別表示與空白組(0 g/L)相比具有顯著差異(下同)

2.4 不同添加量的茯苓提取物對灰樹花胞外和胞內(nèi)總黃酮產(chǎn)量的影響

由圖4可知，在茯苓提取物添加量在0～11 g/L范圍內(nèi)，對灰樹花胞外和胞內(nèi)總黃酮的產(chǎn)量均有一定的促進(jìn)作用(P<0.05)，且隨著添加物質(zhì)量濃度的升高，促進(jìn)作用表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢?？傮w看來，在醇提物添加量為5 g/L時(shí)，對灰樹花胞外和胞內(nèi)總黃酮具有顯著的促進(jìn)效果(P<0.05)，分別為胞外和胞內(nèi)(11.279±0.473)mg/L和(2.5±0.02)%,相較于空白對照組胞外和胞內(nèi)(10.413±0.278) mg/L和(2.27±0.03)%，分別提高了8.32%和10.13%。水提物在添加量為7 g/L時(shí)，對灰樹花胞外和胞內(nèi)總黃酮具有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，分別為胞外和胞內(nèi)(10.55±0.03) mg/L和(2.47±0.01)%，相較于空白對照組胞外和胞內(nèi)(10.227±0.09) mg/L和(2.26±0.07)%,分別提高了3.16%和9.29%，與醇提物在添加量為5 g/L時(shí)的促進(jìn)作用相比，略低于5.16%和0.84%。

圖4 不同茯苓提取物添加量對灰樹花總黃酮產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different additions of Poria cocos extract on the production of total flavonoids of Grifola frondosa

2.5 不同添加量的茯苓提取物對灰樹花發(fā)酵液還原糖和pH的影響

由以上研究結(jié)果可知，茯苓醇提物和茯苓水提高物在添加量分別為5和7 g/L時(shí)，對灰樹花生物量和胞外、胞內(nèi)次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量具有顯著的促進(jìn)作用，因此，分別選擇這2種添加比例作為研究對象，對茯苓提取物參與灰樹花液態(tài)深層發(fā)酵過程中發(fā)酵液中還原糖含量和pH的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行測定，可更好地反映灰樹花在整個(gè)生長代謝過程中對外界營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用狀況，為探究其代謝產(chǎn)物積累的條件提供一定的參考。由圖5可知，在灰樹花0～12 d的整個(gè)發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的還原糖含量始終是減少的，且茯苓提取物添加組還原糖的減少速度略慢于空白對照組，可能是茯苓提取物的某些成分在其發(fā)酵過程中作為一部分碳源被菌絲吸收利用，從而減緩了發(fā)酵液中還原糖的利用。總的來看，在發(fā)酵初期(0～3 d)，還原糖的降低趨勢緩慢，說明在此段時(shí)間，菌絲體處于環(huán)境適應(yīng)期，對葡萄糖的利用程度很小，在發(fā)酵的4～8 d，還原糖含量降低趨勢加快，說明在此段時(shí)間，菌絲體處于快速生長階段，此時(shí)是活性代謝產(chǎn)物積累最大的時(shí)期。在發(fā)酵的9～12 d，還原糖含量降低趨勢緩慢，基本無變化，且發(fā)酵液開始變渾濁，部分菌絲體開始發(fā)生自溶現(xiàn)象，說明在此段時(shí)間，灰樹花生長達(dá)到衰退期，對葡萄糖基本無吸收。

圖5 5 g/L的茯苓提取物添加量對發(fā)酵液還原糖含量的影響Fig.5 Effect of 5 g/L Poria cocos extract on the reducing sugar content of fermentation broth

如圖6所示，發(fā)酵液的pH變化趨勢與還原糖變化趨勢具有一定的相關(guān)性。原因是，灰樹花利用還原糖進(jìn)行自身生長代謝合成代謝產(chǎn)物時(shí)，通過糖酵解途徑產(chǎn)酸(主要為乳酸、有機(jī)酸)，使得發(fā)酵液酸度增大，pH值降低。外界pH通過影響細(xì)胞的膜滲透對細(xì)胞的生長代謝具有一定的影響效果[27-28]，通過對灰樹花發(fā)酵過程pH的動(dòng)態(tài)監(jiān)測，可以通過調(diào)節(jié)其發(fā)酵過程中pH值變化，更好地促進(jìn)菌絲的生長和代謝產(chǎn)物的積累。

圖6 5 g/L的茯苓提取物添加量對發(fā)酵液pH的影響Fig.6 Effect of 5 g/L Poria cocos extract on the pH of fermentation broth

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將中藥茯苓的不同溶劑提取物和不同添加比例加入到真菌灰樹花的液態(tài)深層發(fā)酵液中，參與灰樹花的生長代謝過程，將中藥與藥用真菌有機(jī)結(jié)合并探究茯苓對灰樹花活性代謝產(chǎn)物積累的促進(jìn)作用。結(jié)果表明,茯苓醇提物在5 g/L的添加比例及茯苓水提液在7 g/L的添加比例時(shí)對灰樹花生物量、多糖、總黃酮、蛋白具有最顯著的促進(jìn)作用，其中多糖的增加率較高，而總黃酮和蛋白的增加率較低。具體為5 g/L醇提物添加條件下灰樹花胞外多糖、胞內(nèi)多糖、胞外黃酮、胞內(nèi)黃酮、胞外蛋白、胞內(nèi)蛋白與空白組相比具有顯著促進(jìn)作用(P<0.05),分別提高了17.8%、30.29%、8.32%、10.13%、10.49%和10.24%。7 g/L水提液添加條件下，灰樹花胞內(nèi)多糖、胞外黃酮、胞內(nèi)黃酮、胞外蛋白、胞內(nèi)蛋白與空白組相比具有顯著促進(jìn)作用(P<0.05),分別提高了19.8%、3.16%、9.29%、10.24%和8.78%。本文驗(yàn)證了茯苓提取物在適宜的添加比例下能在一定程度上促進(jìn)灰樹花某些活性產(chǎn)物的含量，為中藥參與食用菌液態(tài)深層發(fā)酵促進(jìn)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提供理論指導(dǎo)，促進(jìn)中醫(yī)藥新藥制劑的創(chuàng)新和食用菌產(chǎn)業(yè)的深加工發(fā)展。后期將主要對茯苓提取物的具體化學(xué)組分參與灰樹花深層發(fā)酵的機(jī)理及茯苓提取物參與灰樹花發(fā)酵是否提高其代謝產(chǎn)物的生物活性方面進(jìn)行研究。