張亞楠，申培立，牛丹丹，田康明，KUGEN PERMAUL，SUREN SINGH，王正祥*

1(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津，300457)2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)3(Department of Biotechnology and Food Technology,Faculty of Applied Sciences,Durban University of Technology,Durban,4001,South Africa)

普魯蘭酶(EC 3.2.1.41)是淀粉脫支酶之一，能專一性地水解淀粉分支點(diǎn)上的α-1,6糖苷鍵，釋放直鏈淀粉，有利于糖化酶的淀粉糖化與葡萄糖生成，從而顯著提升淀粉糖化效率與淀粉到葡萄糖的轉(zhuǎn)化率，是淀粉制糖工業(yè)中重要且不可或缺的輔助用酶[1-2]。

從20世紀(jì)80年代起，國外學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)與性能解析了多種不同來源的普魯蘭酶[3-5]。但是至今為止，在淀粉制糖工業(yè)中，僅Ⅰ型普魯蘭酶呈現(xiàn)出較好的與糖化酶復(fù)配或復(fù)合的作用[6]。其中，長野芽胞桿菌(Bacillusnaganoensis)普魯蘭酶(PulA)具有較高的催化活性，具備現(xiàn)實(shí)工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。但在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其最適作用溫度為55 ℃、最適作用pH為5.0，與黑曲霉糖化酶的最適作用溫度(60～62 ℃)和最適作用pH(pH 4.0～4.5)存在不一致性，是影響其在淀粉工業(yè)應(yīng)用的重要限制因素[6-8]。

分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于酶分子的定向進(jìn)化[9-10]。已有研究表明，通過多種分子進(jìn)化技術(shù)，可以有效改善普魯蘭酶的生化屬性[11-12]。例如，王兵波等[13]利用DNA混編技術(shù)獲得了在巴斯德畢赤酵母中高效表達(dá)的普魯蘭酶嵌合體WXP03，其最適作用溫度為55 ℃，最適作用pH為4.5，基本滿足糖化工藝的需求，但最適作用溫度還有待進(jìn)一步改進(jìn)。再如，PANG等[14]采用定點(diǎn)突變方法，在Anoxybacillussp.WB42普魯蘭酶分子的Thr 245和Ala 326及Trp 651和Val 707間引入2對(duì)二硫鍵，由此獲得普魯蘭酶突變體的最適作用溫度可提高到65 ℃，提高了約5 ℃，在67 ℃下的熱穩(wěn)定性得到顯著提升，其最適作用pH雖稍有降低但未獲得顯著改善。因此，通過現(xiàn)有酶分子進(jìn)化理論方法[15]，進(jìn)一步完善并優(yōu)化普魯蘭酶PulA的酶學(xué)性質(zhì)，使其具備與現(xiàn)有工業(yè)糖化酶的糖化條件的一致性，具有重要意義。

為此，本文通過定點(diǎn)突變PulA的N467并就酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，所獲得的N467G突變體的最適作用溫度和最適作用pH獲得明顯改善，有利于其與黑曲霉糖化酶的復(fù)配使用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109用于目的基因克隆，為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)CBBD302用于普魯蘭酶的分泌表達(dá)，為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保藏[16];pHY-WZX為表達(dá)載體，用于介導(dǎo)目的基因在芽胞桿菌的分泌表達(dá)[17];pWB-PulB攜帶來自長野芽胞桿菌 ATCC 53909的普魯蘭酶基因，為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保藏[7]。

1.1.2 酶與主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶及蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，美國Thermo Fisher Scientific公司；PyrobestTMDNA聚合酶，大連寶生物工程有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒，Omega Bio-tek；硫酸卡那霉素，上海生工生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，NaCl 10.0，加入20 mg/mL的瓊脂為固體培養(yǎng)基。必要時(shí)，培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度20 μg/mL硫酸卡那霉素。

普魯蘭酶鑒定培養(yǎng)基(g/L)：普魯蘭多糖12.0，蛋白胨5.0，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.1，加入20 mg/mL的瓊脂為固體培養(yǎng)基[18]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基于氨基酸序列折疊自由能差值和3D結(jié)構(gòu)模擬預(yù)測普魯蘭酶突變位點(diǎn)

基于氨基酸序列折疊自由能差值，按照文獻(xiàn)[19]介紹的方法進(jìn)行計(jì)算。基本過程為：設(shè)定pH為4.0、溫度為60 ℃的條件，依據(jù)普魯蘭酶氨基酸序列中氨基酸殘基改變形成的蛋白質(zhì)解折疊自由能的差值(ΔΔG)，借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)與計(jì)算獲得可能的突變氨基酸位點(diǎn)。PulA及其突變體的3D結(jié)構(gòu)模擬分析按照SWISS-MODEL方法[20]進(jìn)行。

1.2.2 分子克隆操作

大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取、酶切、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選等按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行[21]；地衣芽胞桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)[16]進(jìn)行；DNA純化按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 PulA定點(diǎn)突變

采用引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變方法進(jìn)行測定[21]?；静襟E為：以含有PulA編碼基因的重組質(zhì)粒pWB-PulB為模板，采用引物467F(5′-GGCCCTGACGGCGTAAAGAC-3′)和引物PulR(5′-CTATTTACCATCAGATGGGCTTACTT-3′)，以及引物PulF(5′-ATAGGATCCGATGGGAACACCACA-3′)和引物467R(5′-GTCTTTACACCGTCAGGGCC-3′)，分別擴(kuò)增出普魯蘭酶編碼基因部分片段；再以上述擴(kuò)增片段的混合物為模板，在引物PulF和PulR的介導(dǎo)下擴(kuò)增得到突變普魯蘭酶全長編碼基因；突變位點(diǎn)采用Sanger核苷酸序列測定法，經(jīng)核苷酸序列測定確認(rèn)。

1.2.4 普魯蘭酶突變體的表達(dá)與制備

將突變后的普魯蘭酶編碼基因片段用BamH I酶切后克隆到pHY-WZX的BamH I和SmaⅠ位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，構(gòu)建獲得含普魯蘭酶突變體基因序列的重組表達(dá)質(zhì)粒，重組質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化入地衣芽胞桿菌CBBD302中，在含20 μg/mL卡那霉素的普魯蘭酶鑒定平板上基于透明圈形成情況進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的初步篩選，根據(jù)普魯蘭酶酶活性進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒酶切進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)突變體的DNA進(jìn)行核苷酸序列測定，獲得正確的重組表達(dá)質(zhì)粒與重組菌。

普魯蘭酶突變體的制備，采用搖瓶發(fā)酵方法進(jìn)行。接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃和200 r/min條件下培養(yǎng)120 h，發(fā)酵結(jié)束后8 000 r/min離心10 min并收集上清液，為普魯蘭酶粗酶液。

1.2.5 普魯蘭酶突變體的純化與SDS-PAGE鑒定

將普魯蘭酶粗酶液經(jīng)50%～70%飽和硫酸銨溶液進(jìn)行分級(jí)沉淀后，進(jìn)一步使用AKTA Pure純化系統(tǒng)，以0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)為流動(dòng)相，采用Sephadex G-100凝膠柱(10 mm×500 mm)進(jìn)行色譜分離，洗脫速度為0.5 mL/min，對(duì)色譜洗脫峰進(jìn)行普魯蘭酶活力檢測，收集普魯蘭酶活性峰。酶蛋白的分離純度采用SDS-PAGE進(jìn)行分析，采用12%的分離膠和5%的濃縮膠[21]。酶蛋白濃度測定參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 普魯蘭酶酶活力測定

普魯蘭酶酶活力按照國標(biāo)GB 1886.174—2016方法[23]進(jìn)行測定。普魯蘭酶酶活力單位定義：在60 ℃，pH 4.5反應(yīng)條件下，1 mL酶液每1 min反應(yīng)產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol葡萄糖，即為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

1.2.7 最適作用溫度及熱穩(wěn)定性測定

在pH 4.5下，分別測定酶樣在45、50、55、60、65和70 ℃下的酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算其余溫度下的相對(duì)酶活力，確定最適作用溫度。將酶樣分別在45、50、55和60 ℃下熱處理1 h，每隔0.5 h取樣，按1.2.6小節(jié)中酶活力的測定方法測定殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶樣酶活力為100%，確定酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.8 最適作用pH及pH穩(wěn)定性測定

在最適反應(yīng)溫度下，用pH 3.5～7.0的緩沖液適當(dāng)稀釋酶液，測定對(duì)應(yīng)pH條件下的酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算其余pH條件下的相對(duì)酶活力，確定最適作用pH。將酶樣加入不同的pH緩沖液中室溫(25 ℃)放置1 h，然后按1.2.6小節(jié)中酶活力的測定方法測定殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶液酶活力為100%，確定其pH穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 PulA突變位點(diǎn)選擇

通過對(duì)普魯蘭酶氨基酸序列中氨基酸殘基改變形成的蛋白質(zhì)解折疊自由能的差值(ΔΔG)分析，發(fā)現(xiàn)PulA分子中第467位的天冬酰胺殘基突變可能會(huì)改變其酶學(xué)性質(zhì)及其耐熱耐酸性能。進(jìn)一步借助PulA 3D模擬結(jié)構(gòu)(圖1-a)，分析了PulA第467位的天冬酰胺殘基突變?yōu)楦拾彼岷蟮慕Y(jié)構(gòu)變化(圖1-b)，發(fā)現(xiàn)N467G突變后的普魯蘭酶分子，甘氨酸側(cè)鏈基團(tuán)為氫，是疏水基團(tuán)，可以與周圍氨基酸殘基形成疏水相互作用，并主要影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象熵，是蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)形成的驅(qū)動(dòng)力，通過降低蛋白質(zhì)表面的疏水性，增加內(nèi)部的疏水性來維持蛋白質(zhì)內(nèi)部的穩(wěn)定[24]。故第467位天冬酰胺殘基突變后有可能提升酶分子的耐熱性。

a-PulA；b-N467G突變體圖1 PulA第467位氨基酸位點(diǎn)突變前后結(jié)構(gòu)比較Fig.1 Deduced structure of PulA before and after mutation of the Asn467 residue注：a、b圖的左上角均為突變位點(diǎn)放大圖

2.2 N467G突變體的構(gòu)建與制備

基于以上分析，普魯蘭酶PulA的第467位天冬酰胺殘基突變對(duì)耐熱耐酸性能可能產(chǎn)生影響，對(duì)此氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得了相應(yīng)的突變體N467G，其在相應(yīng)宿主菌中具有普魯蘭酶活性。將此突變體編碼基因在地衣芽胞桿菌中進(jìn)行分泌表達(dá)，并通過搖瓶發(fā)酵進(jìn)行酶液的制備并進(jìn)一步純化，純化后的普魯蘭酶突變體N467G在SDS-PAGE圖譜上呈現(xiàn)單一條帶，條帶位置與其理論分子質(zhì)量大小101 kDa相吻合(圖2)，比酶活力較野生型PulA提高了約11%。

圖2 突變體N467G純化后的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE diagram of the purified mutant N467G

2.3 N467G突變體的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適作用溫度和最適作用pH

在pH 4.5的條件下，測定45～70 ℃范圍內(nèi)普魯蘭酶突變體N467G的酶活力，結(jié)果如圖3-a所示。

a-溫度；b-pH圖3 溫度和pH對(duì)普魯蘭酶突變體N467G活力的影響Fig.3 Effects of temperature and pH on the activity of the mutant N467G

突變體N467G在60 ℃時(shí)表現(xiàn)出最高酶活力，其最適作用溫度較PulA提高了5 ℃，最適作用溫度顯著提高；在黑曲霉糖化酶的最適作用溫度(60～62 ℃)附近，突變體N467G的相對(duì)酶活力為其最高水平，而此時(shí)PulA相對(duì)酶活力僅為70%左右，表明在作用溫度層面突變體N467G更適合與黑曲霉糖化酶的配合使用。進(jìn)一步評(píng)價(jià)了pH對(duì)普魯蘭酶突變體N467G酶活力的影響，結(jié)果如圖3-b所示。突變體N467G的最適作用pH為4.5，較PulA降低了0.5個(gè)pH；在pH 4.0～5.0之間N467G的酶活力均保持在80%以上，PulA同樣范圍內(nèi)僅有60%的酶活力，表明N467G比野生型更有利于在酸性條件下發(fā)揮催化作用。

2.3.2 熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

將酶液在55和60 ℃下保溫3 h，定時(shí)取樣分析剩余酶活力，結(jié)果如圖4-a所示。突變體N467G在55和60 ℃孵育1.5 h后保留80%以上的酶活力，2.5 h后仍保留70%和50%以上的酶活力，而PulA在各取樣點(diǎn)的相對(duì)酶活力均低于突變體N467G，在55和60 ℃下保溫2.5 h后，其酶活力僅保留50%和40%，突變體N467G的熱穩(wěn)定性較PulA顯著提升。進(jìn)一步將酶液在不同pH緩沖液中室溫放置1 h后測其剩余酶活力的結(jié)果如圖4-b所示。突變體N467G在pH 3.5～6.0，皆具有良好的穩(wěn)定性，酶活力均保留60%以上，N467突變后其分子的耐酸性得到了顯著提升。

a-熱穩(wěn)定性；b-pH穩(wěn)定性圖4 突變體N467G的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性Fig.4 The thermostability and pH stability of the mutant N467G

本研究通過對(duì)長野芽胞桿菌普魯蘭酶的氨基酸序列分析與預(yù)測，以定點(diǎn)突變方法改造酶分子并制備相應(yīng)的普魯蘭酶突變體，所獲得的突變體N467G的最適作用溫度較親本提高了5 ℃，最適作用pH降低了0.5，其最適作用條件與現(xiàn)有糖化酶作用條件相吻合。此外，該突變體的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性也有顯著提升?？梢姡狙芯揩@得的普魯蘭酶新突變體具備了與糖化酶復(fù)合使用的基本條件。

已有研究揭示，酶分子特定部位的天冬酰胺殘基在高溫條件下發(fā)生脫酰胺作用，是導(dǎo)致酶蛋白熱變性的重要原因之一[24]。本研究中普魯蘭酶PulA第467位的天冬酰胺殘基定點(diǎn)突變?yōu)楦拾彼岷?，因甘氨酸?cè)鏈?zhǔn)鞘杷鶊F(tuán)，可以與周圍氨基酸殘基通過疏水相互作用來維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而顯著提升了突變體的熱穩(wěn)定性。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，N467G突變后，其最適作用pH和pH穩(wěn)定性也發(fā)生期望的突變，這一變化的可能機(jī)理尚不清楚，將在后續(xù)進(jìn)一步闡明。

3 結(jié)論

通過對(duì)B.naganoensis普魯蘭酶第467位天冬酰胺殘基的定點(diǎn)突變，獲得了普魯蘭酶突變體，最適作用溫度為60 ℃，最適作用pH為4.5，與現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)中使用的糖化酶的最適作用條件相吻合，其應(yīng)用可改進(jìn)現(xiàn)有淀粉制葡萄糖生產(chǎn)工藝。