范 師,楊 城,吳玲芳,何金芳,沈劍聞

(杭州中美華東制藥江東有限公司,浙江 杭州 310014)

生物素又稱VH和輔酶R,通常會與酶結(jié)合參與微生物體內(nèi)二氧化碳的固定和羧化過程,與重要代謝過程如丙酮酸羧化而轉(zhuǎn)變成為草酰乙酸,乙酰輔酶A羰化成為丙二酰輔酶A等糖及脂肪代謝中的主要生化反應(yīng)有關(guān)[1-2],并且生物素為所有微生物所必需的生長因子,其用量對菌體的代謝、生長及繁殖等生命過程有較顯著的影響,同時直接關(guān)系到細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變及細(xì)胞膜通透性[3]。冬蟲夏草作為名貴真菌類中藥,具有治療腎虛、腰膝酸痛、久咳虛弱以及免疫調(diào)節(jié)等方面的功效。而中國被毛孢是冬蟲夏草公認(rèn)的無性型存在形式,幾乎具有與冬蟲夏草一樣的藥效和藥性。由于天然冬蟲夏草受制于季節(jié)、環(huán)境和地域等因素,產(chǎn)量較低,無法滿足市場的巨大需求。因此,目前多采用深層低溫發(fā)酵方式培養(yǎng)其菌絲體,以解決現(xiàn)有蟲草藥源匱乏的問題。

在實際工業(yè)化生產(chǎn)中,冬蟲夏草菌發(fā)酵存在多種影響因素,其中氮源對菌體代謝影響尤為突出。經(jīng)過長期的生產(chǎn)追蹤和研究分析,筆者發(fā)現(xiàn)氮源中酵母膏成分對蟲草菌的影響最大,為此需要探究酵母膏中潛在的主要影響因素。通過文獻查閱,酵母膏作為蟲草菌發(fā)酵的主要氮源之一,其不僅是重要的有機氮源,而且也是生物素的主要來源[4]。因此將生物素作為研究對象,同時在追溯酵母膏原料制備過程中,發(fā)現(xiàn)其原料來源、處理方法及生產(chǎn)工藝的不同,會使得不同批次間生物素質(zhì)量濃度存在較大差異。鑒于生物素的重要生理功能,這種差異會對菌體生長產(chǎn)生較大影響,所以需要通過實驗優(yōu)化該物質(zhì)的質(zhì)量濃度,在酵母膏物料中建立有關(guān)參數(shù)指標(biāo),提高蟲草菌的產(chǎn)量和質(zhì)量水平。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 菌 種

冬蟲夏草菌中國被毛孢(Hirsutellasinensis),保藏編號CCTCC NO.M 2018108,為華東醫(yī)藥自主篩選。

1.1.2 培 養(yǎng) 基

自制斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基。

由于酵母膏中營養(yǎng)成分較為復(fù)雜,含有豐富的生物活性物質(zhì),為了減少對實驗結(jié)果的干擾和判斷,故培養(yǎng)基配方中均不加入酵母膏成分。

1.2 儀器與設(shè)備

R300抽濾泵;TS-100C搖床;DGG-9036A烘箱;HSY-22169坩堝;HH-4恒溫水浴鍋;SS-325型全自動滅菌鍋;SW-CJ-1D超凈臺;FA2204B電子天平;BS-IE恒溫恒濕培養(yǎng)箱;HYQ-310S醫(yī)用冷藏箱;UV-5200紫外分光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)與發(fā)酵

1)菌種斜面保存

將制備的斜面放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱,15 ℃培養(yǎng)30 d至菌絲成熟后,從恒溫恒濕培養(yǎng)箱中收取,放醫(yī)用冷藏箱保存。

2)菌種搖瓶活化

于無菌室中,將斜面菌塊接入已準(zhǔn)備好的搖瓶培養(yǎng)液中,每個搖瓶接入1支斜面,用4層紗布包好,將搖瓶棉塞塞回,在搖瓶機上15 ℃,100 r/min培養(yǎng)14 d。

3)生物素質(zhì)量濃度梯度試驗

先準(zhǔn)備12個500 mL的錐形瓶,每個裝200 mL左右的培養(yǎng)基,分別標(biāo)記為1～6號,其中1號和2號瓶作為空白對照。3～6號瓶依次按50,100,300,500 μg/L配制出相應(yīng)質(zhì)量濃度的生物素溶液。以此作為基本溶液配制培養(yǎng)基,全部封口后,121 ℃滅菌30 min,冷卻備用,為減少誤差,每個實驗組安排2個平行對照,記錄實驗數(shù)據(jù)并繪制柱狀圖。

4)菌種搖瓶發(fā)酵

在嚴(yán)格無菌條件下進行培養(yǎng),其中菌體為適宜培養(yǎng)天數(shù)的活化種子液,以3%接菌量轉(zhuǎn)接入備好的錐形瓶中,培養(yǎng)結(jié)束后,測菌體干質(zhì)量、pH及甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。通過分析實驗組和對照組中3個參考指標(biāo)之間的差異性,判斷生物素潛在的應(yīng)用與開發(fā)價值。

1.3.2 指標(biāo)測定

1)菌體干質(zhì)量測定

通過量筒準(zhǔn)確量取150 mL發(fā)酵液,放入烘箱中干燥5 h,稱重后計算干質(zhì)量質(zhì)量濃度,其計算式為

2)殘渣和甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

按照藥典[5]說明,甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用高碘酸鹽氧化法定量分析檢測。

3)pH測定

梅特勒pH電極在線檢測,pH精密試紙輔助矯正。

4)溫度測定

溫度電極在線檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)取3次實驗的平均值。單因素方差分析之后Dunnettt檢驗確定數(shù)據(jù)差異的顯著性(P<0.05,差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

利用單因素試驗,以生物素質(zhì)量濃度為自變量,pH為因變量,選擇不同適宜生物素濃度,跟蹤對應(yīng)發(fā)酵pH的變化情況,形成的對應(yīng)關(guān)系如圖1所示。據(jù)文獻報道[6-9],適量生物素可以促使菌體合成更多的磷脂分子,進而有效地增加谷氨酸和天冬氨酸在菌體內(nèi)的積累,限制其向胞外滲透擴散;而滯留在菌體內(nèi)的酸性氨基酸隨著濃度的提高,會對相應(yīng)脫氫酶形成順序反饋抑制,減少丙酮酸脫氫進入三羧酸循環(huán)。從圖1中可見:相比于對照組,在添加生物素后,搖瓶pH值有明顯回升的趨勢,且在實驗質(zhì)量濃度50～500 μg/L范圍內(nèi),伴隨生物素添加量的降低而升高。即菌體的產(chǎn)酸在不斷減少,培養(yǎng)液的pH值下降趨勢放緩。其中當(dāng)生物素質(zhì)量濃度維持在50 μg/L(P<0.05)左右時,胞外分泌的有機酸最少,此時溶液pH達到最大值。生物素質(zhì)量濃度達到100 μg/L左右時,對應(yīng)的pH=6.07,比對照組高出2%,雖然增幅不大,但是同樣對實際生產(chǎn)會產(chǎn)生較明顯的正面影響?；诖罅可a(chǎn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,pH值與蟲草菌粉指紋存在必然關(guān)系,若pH<5,各核苷類物質(zhì)的峰面積波動較大。對于pH介于5左右的發(fā)酵批次,小幅度的提高也會對指紋數(shù)據(jù)帶來一定程度的積極影響。

圖1 生物素添加量對發(fā)酵pH值的影響

利用單因素試驗,以生物素質(zhì)量濃度為自變量,干質(zhì)量為因變量,選擇不同適宜生物素質(zhì)量濃度,跟蹤對應(yīng)批次菌體干質(zhì)量的變化情況,形成的對應(yīng)關(guān)系如圖2所示。幾乎所有的菌體在進行自身干物質(zhì)合成并積累過程中,都離不開生化酶的協(xié)助和引導(dǎo)。其中用于CO2固定的關(guān)鍵酶主要有磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化酶[10]與丙酮酸羧化酶,而這兩種羧化酶均需要由生物素激活與調(diào)節(jié),通過蛋白三維結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)生物素與羧化酶幾乎鑲嵌在一起[11],所以生物素在促進菌體合成代謝方面具有非常重要的應(yīng)用價值。圖2結(jié)果顯示:生物素的適量使用的確有較顯著的效果,隨著生物素質(zhì)量濃度的依次遞減,菌體的干質(zhì)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,說明兩者之間存在一定的規(guī)律性和關(guān)聯(lián)性。當(dāng)生物素質(zhì)量濃度趨近100 μg/L時,菌體干質(zhì)量質(zhì)量濃度達到最大值(P<0.05),為7.43 g/L。生物素質(zhì)量濃度的繼續(xù)提升,則不利于菌體干物質(zhì)質(zhì)量的積累。但是相比于對照組,干質(zhì)量仍然有所增加,說明生物素有利于促進菌體的生長代謝。

圖2 生物素添加量對菌體產(chǎn)量的影響

利用單因素試驗,以生物素質(zhì)量濃度為自變量,甘露醇為因變量,選擇不同適宜生物素質(zhì)量濃度,跟蹤對應(yīng)批次甘露醇的變化情況,形成的對應(yīng)關(guān)系如圖3所示。生物素有利于提高菌體的產(chǎn)量和質(zhì)量,尤其對于菌體代謝合成甘露醇等醇類物質(zhì)方面,作為相應(yīng)代謝途徑中己糖激酶的主要輔酶[12],在協(xié)助和刺激生化酶發(fā)揮特定功能中扮演著舉足輕重的角色,并且在一定程度上,通過各種途徑,幾乎影響著整個菌體的生命代謝過程。由圖3可見:當(dāng)生物素質(zhì)量濃度超過300 μg/L時,相比于對照組,甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)雖然有一定程度的提高,但是增幅效果幾乎不明顯。而隨著生物素濃度的不斷降低,菌體內(nèi)甘露醇合成量逐漸上升,當(dāng)生物素質(zhì)量濃度接近100 μg/L,胞內(nèi)甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達最大值(P<0.05),為0.58%。生物素質(zhì)量濃度進一步降低,對應(yīng)甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)則開始同步下降。同樣地,相比對照組,不同生物素質(zhì)量濃度都能有效促進并刺激菌體合成甘露醇。

圖3 生物素添加量對甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖1～3可知:生物素質(zhì)量濃度介于50～500 μg/L,菌體質(zhì)量濃度隨生物素添加量的提高,表現(xiàn)為先升后降的趨勢,與甘露醇變化情況一致,而pH值則是平穩(wěn)下降。另外,當(dāng)生物素質(zhì)量濃度接近100 μg/L時,菌體質(zhì)量濃度和干質(zhì)量及甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)依舊有增長的趨勢。

3 結(jié) 論

基于對產(chǎn)量和質(zhì)量水平影響的充分考量,初步確定生物素適宜質(zhì)量濃度為100 μg/L。從整體實驗反饋結(jié)果來看,如果合理地控制酵母膏中生物素質(zhì)量濃度,不僅能提升蟲草菌的產(chǎn)量,還能提高甘露醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。因此,通過建立該指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn),提升冬蟲夏草菌的生長代謝能力,從而提高生產(chǎn)水平和質(zhì)量。由于酵母膏中活性成分非常復(fù)雜,除了生物素之外,類似其他B族維生素等生長因子的影響同樣存在,后續(xù)進一步進行實驗研究,以建立更多參數(shù)指標(biāo),為發(fā)酵冬蟲夏草菌粉產(chǎn)量和質(zhì)量提供更加強有力的保障。