魏榮省,李旭嬌,李會會,李心怡,韓守暖,朱兵峰

(1.魯南制藥集團股份有限公司,山東 臨沂 273400;2.魯南新時代生物技術(shù)有限公司,山東 臨沂 273400;3.哺乳動物細胞高效表達國家工程實驗室,山東 臨沂 273400)

紐莫康定(Pneumocandins)是由Zalerionarboricola[1-5]產(chǎn)生的一類天然抗真菌藥物,對多種念珠菌、地方性真菌、曲霉及卡氏肺囊蟲均有效,受到人們的廣泛關(guān)注。其主要作用機理是能夠非競爭性的抑制真菌細胞壁中β-1,3-葡聚糖合成酶的活性,引起細胞壁裂解以及細胞內(nèi)外滲透壓的改變,從而將真菌細胞殺死。按照其結(jié)構(gòu)中脯氨酸上取代基的不同主要分為紐莫康定A0(3-羥基-4-甲基脯氨酸)、紐莫康定B0(3-羥基脯氨酸)和紐莫康定C0(4-羥基脯氨酸)3大類[6],其中紐莫康定B0脫側(cè)鏈后的環(huán)狀六肽母核是合成棘白菌素類藥物醋酸卡泊芬凈[7](Caspofungin acetate)的中間體。醋酸卡泊芬凈由默克公司原研,屬廣譜抗真菌藥物,對包括曲霉和念珠菌屬在內(nèi)的真菌均有良好的抗菌作用。紐莫康定B0與紐莫康定C0屬于同分異構(gòu)體,兩者的差別僅在于脯氨酸殘基上的一個羥基的位置不同,在通常條件下很難實現(xiàn)分離,而紐莫康定C0為紐莫康定B0生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵雜質(zhì),會通過合成路線逐步傳遞到終產(chǎn)品醋酸卡泊芬凈原料藥中,并生成非藥效成分類卡泊芬凈,影響產(chǎn)品質(zhì)量。目前,各國藥典雖然還未收錄紐莫康定和醋酸卡泊芬凈相關(guān)質(zhì)量標準,但是各生產(chǎn)廠家均已將紐莫康定C0列入質(zhì)量標準加以控制。因此,開發(fā)一種能同時準確檢測紐莫康定B0和紐莫康定C0質(zhì)量濃度的方法對于控制紐莫康定乃至醋酸卡泊芬凈的產(chǎn)品質(zhì)量非常重要。

反相HPLC法[8-10]測定紐莫康定B0的文獻報道雖然較多,但此類方法只能實現(xiàn)紐莫康定A0的分離,紐莫康定B0和紐莫康定C0峰完全重疊;通過正相HPLC法,雖然能夠?qū)崿F(xiàn)紐莫康定B0和紐莫康定C0的同時檢測,但使用的二氯甲烷、乙酸乙酯等試劑毒性較大,雜質(zhì)檢出少且峰響應(yīng)值偏低。親水作用色譜法HILIC模式[11]為新興的色譜技術(shù),使用兩性離子填料[12]能夠同時檢測紐莫康定B0和紐莫康定C0,但此填料柱效差,鍵合相流失快,色譜柱壽命短,且要求使用等度洗脫,殘留雜質(zhì)可能會影響下一樣品的檢測;使用氨基填料不能分離紐莫康定B0和紐莫康定C0;使用聚合多氨填料能夠同時檢測紐莫康定B0和紐莫康定C0,但柱壽命只比氨基柱延長50%左右,同樣壽命短。筆者使用三鍵鍵合酰胺填料,建立了HILIC模式的梯度方法,既能同時快速準確測定紐莫康定B0和紐莫康定C0,又大大延長柱壽命,也解決了樣品批處理的殘留問題,為有效控制紐莫康定生產(chǎn)質(zhì)量提供了一條有效途徑。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀(VWD-DAD)、Agilent 1290 2DLC-6540B QTOF LC-MS、Thermo Evolution 3000紫外分光光度計、METTLER TOLEDO XS105DU分析天平、METTLER TOLEDO MS 205 DU分析天平。

1.2 材 料

紐莫康定B0對照品(質(zhì)量分數(shù)95.56%,批號16001,大同市礦區(qū)風華生物科技有限公司),紐莫康定C0對照品(質(zhì)量分數(shù)95.11%,批號16002,大同市礦區(qū)風華生物科技有限公司);紐莫康定B0發(fā)酵液(F 301180301 F,自制),紐莫康定B0粗品(F 301170401 Ⅰ,自制),紐莫康定B0凍干粉(F 301180501 K,自制);乙腈、甲醇和乙醇均為色譜純,鹽酸、雙氧水和氫氧化鈉均為分析純,水為純化水。

2 方法與結(jié)果

發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一系列紐莫康定類似物,其中3個主要紐莫康定結(jié)構(gòu)類似物結(jié)構(gòu)式為

本方法主要是針對其中同分異構(gòu)體紐莫康定B0和C0進行的研究。

2.1 色譜條件

色譜柱Waters XBridge?Amide柱(4.6 mm×250 mm,3.5 μm),檢測波長220 nm,流速1 mL/min,柱溫40 ℃,進樣量10 μL;流動相為V(A)∶V(B)(其中:A為純水;B為乙腈),梯度洗脫(0～10 min,B 93%～84%;10～18 min,B 84%;18～19 min,B 84%～50%;19～28 min,B 50%;28～29 min,B 50%～93%;29～35 min,B 93%)。

2.2 溶液配制

2.2.1 紐莫康定B0對照品溶液

取紐莫康定B0對照品約20 mg,精密稱定,置于50 mL容量瓶中,加乙醇超聲溶解后,稀釋至刻度,搖勻,制得質(zhì)量濃度為400 mg/L的紐莫康定B0對照品溶液。

2.2.2 紐莫康定C0對照品溶液

取紐莫康定C0對照品約20 mg,精密稱定,置于50 mL容量瓶中,加乙醇超聲溶解后,稀釋至刻度,搖勻;精密量取上述溶液1 mL,置于10 mL容量瓶中,用乙醇稀釋至刻度,搖勻,制得質(zhì)量濃度為40 mg/L的紐莫康定C0對照品溶液。

2.2.3 紐莫康定B0發(fā)酵液

準確量取紐莫康定發(fā)酵液20 mL,加乙醇80 mL,勻漿10 min,過濾,取濾液適量離心(4 000 r/min)10 min,取上清液,用0.45 μm濾膜過濾,即得。

2.2.4 紐莫康定B0粗品溶液

取粗品約20 mg,精密稱定,置于50 mL容量瓶中,加乙醇超聲溶解后,稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.2.5 紐莫康定B0凍干粉溶液

取紐莫康定B0凍干粉約20 mg,精密稱定,置于50 mL容量瓶中,用乙醇超聲后,稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 波長的確定

實驗分別采用紫外分光光度計和二極管陣列檢測器對紐莫康定B0對照品溶液、紐莫康定C0對照品溶液分別進行UV全波長掃描,掃描紐莫康定B0乙醇溶液UV光譜圖如圖1所示。結(jié)果顯示:在乙醇溶液中紐莫康定B0的UV吸收和紐莫康定C0的UV吸收光譜圖完全一致,在波長220 nm處可以看到有較強吸收,且響應(yīng)相對平緩,波長耐用性較好。因此,筆者選用220 nm作為紐莫康定B0和紐莫康定C0質(zhì)量濃度的檢測波長。

圖1 紐莫康定B0乙醇溶液UV光譜圖

2.3.2 梯度洗脫優(yōu)化

與甲醇水體系相比,乙腈水體系各雜質(zhì)檢出個數(shù)和峰形均較好,故選用乙腈水體系進行優(yōu)化。首先通過等度洗脫方法摸索,V(純水)∶V(乙腈)=8∶92為紐莫康定B0、紐莫康定C0洗脫的臨界比例。為增加樣品洗脫效果,保證紐莫康定B0、紐莫康定C0與前后雜的基線分離,選擇V(純水)∶V(乙腈)=7∶93為梯度洗脫初始比例,V(純水)∶V(乙腈)=16∶84為主峰洗脫比例。由于樣品中殘留雜質(zhì)會影響下一針樣品的準確度,經(jīng)不同梯度摸索,得出V(純水)∶V(乙腈)=50∶50能夠?qū)悠返碾s質(zhì)進行完全洗脫,所以選用V(純水)∶V(乙腈)=50∶50進行雜質(zhì)洗脫,為保證批處理樣品時,連續(xù)進樣系統(tǒng)的穩(wěn)定性,增加V(純水)∶V(乙腈)=7∶93系統(tǒng)平衡,用時6 min。

2.4 LC-MS鑒定

取紐莫康定B0粗品溶液,按照2.1項中色譜條件采用分流法進行LC-MS分析,其結(jié)果如圖2所示,紐莫康定B0和紐莫康定C0保留時間分別為9.04 min和10.16 min,m/z均為1 064[13-14]。

圖2 LC-MS圖

2.5 分析方法驗證

筆者對本方法耐用性、系統(tǒng)適用性、專屬性、線性、檢測限、定量限、準確度、重復(fù)性和溶液穩(wěn)定性進行了相應(yīng)驗證,具體驗證結(jié)果匯總?cè)绫?所示。

表1 方法驗證結(jié)果匯總

2.5.1 耐用性試驗

通過改變流速(0.8,1.2 mL/min)、柱溫(35,45 ℃)、進樣量(5,15 μL)、色譜柱(Waters XBridge?Amide柱其他批次和月旭Ultimate?HILIC Amide柱),考察方法耐用性。經(jīng)試驗,以上色譜條件變化均能滿足最新版中國藥典對系統(tǒng)適用性試驗的要求,提示該方法耐用性良好。

2.5.2 系統(tǒng)適用性試驗

取粗品溶液,按照2.1項中色譜條件進行測定,連續(xù)進樣6針,記錄色譜圖如圖3所示。結(jié)果顯示:紐莫康定B0色譜峰的保留時間與峰面積的RSD均小于0.5%,理論塔板數(shù)大于90 000;紐莫康定C0色譜峰的保留時間與峰面積的RSD均小于0.5%,理論塔板數(shù)大于80 000,紐莫康定B0與紐莫康定C0色譜峰分離度大于2.4。

圖3 典型色譜圖

2.5.3 專屬性試驗

稀釋劑色譜乙醇對紐莫康定B0和紐莫康定C0檢測無干擾,溶解性良好,進樣量30 μL以內(nèi)無溶劑效應(yīng)。液相DAD檢測器顯示紐莫康定B0和紐莫康定C0峰純度因子均大于990。破壞試驗測定結(jié)果如表2所示。

表2 破壞試驗結(jié)果

破壞出的雜質(zhì)對紐莫康定B0檢測有干擾,對紐莫康定C0檢測無干擾,主要降解雜質(zhì)經(jīng)LC-MS鑒定,m/z為1 064。

對品種最大單雜B0絲氨酸同系物進行定位,發(fā)現(xiàn)B0絲氨酸同系物與紐莫康定B0保留時間一致。

2.5.4 線性試驗

分別精密量取紐莫康定B0和紐莫康定C0對照品溶液1,2,4,6,8,10 mL,置于6個10 mL容量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,定容,搖勻,制成6個不同質(zhì)量濃度的線性溶液[15-16],加定量限溶液共7個點,按照2.1項中色譜條件,分別進樣,記錄色譜圖。以對照品溶液中各組分質(zhì)量濃度C為橫坐標,色譜峰面積A為縱坐標,進行紐莫康定B0和紐莫康定C0的線性回歸,得線性方程分別為

AB0=2.614 2C-8.392 2,r=0.999 2

AC0=2.510 3C-7.464 7,r=0.999 5

2.5.5 定量限、檢測限試驗

分別將紐莫康定B0和紐莫康定C0對照品溶液逐步稀釋,按照2.1項中色譜條件進樣測定,以信噪比約等于3的質(zhì)量濃度為各組分的檢測限,信噪比約等于10的質(zhì)量濃度為各組分的定量限。測定結(jié)果如表3所示。

表3 定量限和檢測限

2.5.6 準確度試驗

各取紐莫康定B0對照品溶液和發(fā)酵液上清液0.5 mL混合(相當于100%水平的質(zhì)量濃度400 mg/L)6份樣品作為紐莫康定B0加標回收率供試品溶液[17],另各取紐莫康定C0對照品溶液和發(fā)酵液上清液0.5 mL混合(相當于100%水平的質(zhì)量濃度40 mg/L)6份樣品作為紐莫康定C0加標回收率供試品溶液,按照2.1項中色譜條件分別進樣測定,按外標法以峰面積計算紐莫康定B0和紐莫康定C0的回收率。結(jié)果可得:紐莫康定B0和紐莫康定C0的平均回收率分別為99.2%,98.9%;相對標準偏差RSD分別為1.68%,1.71%。

2.5.7 重復(fù)性試驗

精密稱定粗品6份,按照2.2項中溶液配制方法配制供試品溶液,按照2.1項中色譜條件進樣測定,按外標法以峰面積計算6份供試品中紐莫康定B0和紐莫康定C0質(zhì)量濃度,計算紐莫康定B0和紐莫康定C0質(zhì)量濃度的相對標準偏差RSD分別為0.39%,0.42%。

2.5.8 溶液穩(wěn)定性試驗

取紐莫康定B0對照品溶液、紐莫康定C0對照品溶液、發(fā)酵液、粗品溶液和紐莫康定B0凍干粉溶液,室溫放置,于0,2,4,8,12,24 h分別進樣測定,計算得紐莫康定B0對照品溶液主峰面積的RSD為0.75%,紐莫康定C0對照品溶液主峰面積的RSD為0.81%,發(fā)酵液中紐莫康定B0和紐莫康定C0峰面積的RSD分別為1.39%和1.44%,粗品溶液中紐莫康定B0和紐莫康定C0峰面積的RSD分別為1.27%和1.36%,紐莫康定B0凍干粉溶液峰面積的RSD為0.77%。結(jié)果表明對照品溶液和供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

雜質(zhì)研究及控制是藥品質(zhì)量保證的關(guān)鍵因素,而異構(gòu)體的控制是產(chǎn)品質(zhì)量控制的難點。本實驗同時檢測紐莫康定樣品中同分異構(gòu)體紐莫康定B0和紐莫康定C0質(zhì)量濃度的HPLC方法,并分別檢測了紐莫康定發(fā)酵液、粗品和凍干粉。結(jié)果表明:樣品中紐莫康定B0和紐莫康定C0的分離度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。此方法具有操作簡單、穩(wěn)定性強、靈敏度高和耐用性好等特點,為有效控制紐莫康定產(chǎn)品質(zhì)量提供了保障。