張敏，張鵬，趙洪禮,3

(1.沈陽(yáng)大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，城市有害生物治理與生態(tài)安全遼寧省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110044；2.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110163；3.沈陽(yáng)百發(fā)科技有限公司，沈陽(yáng) 110163)

金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是廣泛存在于動(dòng)植物和微生物組織中的一類(lèi)能螯合大量金屬離子的小分子蛋白質(zhì)，具有極強(qiáng)的清除活性氧與抗氧化能力，在體內(nèi)主要具有參與微量元素代謝、重金屬解毒、清除羥基自由基、拮抗電離輻射及參與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)、增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗不良狀態(tài)的適應(yīng)能力等多種作用[1-3]。MT可在眼睛中大量表達(dá)[4-5]。MTs(特別是MT-1，MT-2，MT-3)的積累是視網(wǎng)膜變性疾病的重要保護(hù)機(jī)制，如年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)和視網(wǎng)膜色素變性[6-7]。氧化應(yīng)激和/或鋅毒性是這些疾病的一種共同途徑[6]。作為抗氧化劑，MT可在防御視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，如可保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)免于光輻射損傷[8-14]。研究MTs的表達(dá)模式和功能可以拓寬對(duì)這些疾病引發(fā)的內(nèi)源性分子響應(yīng)的理解，并有助于開(kāi)發(fā)新的治療策略[6,12,15]。

目前AMD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能是氧化應(yīng)激、炎癥、基因和環(huán)境等多因素相互作用的結(jié)果[16]。AMD可分為干性(地圖萎縮樣，85%～90%)和濕性(脈絡(luò)膜新生血管，10%～15%)兩種。玻璃膜疣是干性AMD的主要特征，是其最早期的眼底表現(xiàn)，與AMD的進(jìn)展密切相關(guān)[16-17]。研究[17-19]表明：玻璃膜疣形成起始階段為在RPE下層以含膽固醇的脂滴為核心，微小羥基磷灰石球粒沉積，而其外層被Aβ、玻連蛋白、補(bǔ)體因子H等蛋白質(zhì)包被覆蓋。有學(xué)者[18-19]在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過(guò)程中重建了僅依賴(lài)于RPE細(xì)胞的玻璃膜疣生物發(fā)生過(guò)程，表明了RPE細(xì)胞可能是細(xì)胞外玻璃膜疣形成的起始和調(diào)控關(guān)鍵位置。所以RPE功能異?？赡芗仁遣Ａゐ嘈纬珊髮?duì)RPE影響的結(jié)果，也可能是玻璃膜疣形成的主要因素。本研究利用玻璃膜疣形成起始階段的主要成分膽固醇培養(yǎng)人RPE細(xì)胞，分析RPE細(xì)胞中金屬硫蛋白轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)上的變化，初步探索人RPE細(xì)胞金屬硫蛋白與玻璃膜疣形成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞株購(gòu)自北納生物(細(xì)胞系)；膽固醇(≥99%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；總金屬硫蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；熒光染料使用美國(guó)Roche公司的light cycler 480 SYBR Green I Master。

1.2 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19 細(xì)胞培養(yǎng)

將ARPE-19細(xì)胞系解凍離心后接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。生長(zhǎng)至大部分細(xì)胞接近融合狀態(tài)時(shí)使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。第3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 ARPE-19 細(xì)胞培養(yǎng)處理

設(shè)置正常對(duì)照組：正常培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)0，6，12，24，48，72 h不同細(xì)胞周期的ARPE-19細(xì)胞離心取細(xì)胞，液氮速凍后做好標(biāo)記?80 ℃保存。

膽固醇處理組：以膽固醇濃度2.5 mg/mL培養(yǎng)(血液中的膽固醇濃度大約是200 mg/dL左右，也就是2 mg/mL)，分別在培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)0，6，12，24，48，72 h取細(xì)胞樣，PBS緩沖液漂洗3次后，液氮速凍做好標(biāo)記?80 ℃保存。

不同處理組光學(xué)顯微鏡下觀察取圖，記錄好培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞變化。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平的變化

吸去細(xì)胞原培養(yǎng)液，PBS 洗1 次，用胰酶消化細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，PBS重懸細(xì)胞，1000 r/min離心5 min棄上清。采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit進(jìn)行RNA提取，以gDNA Eraser與RNA溶液混合在42 ℃共浴2 min去除基因組DNA，之后反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得mRNA。采用熒光定量PCR(quantitative real time-PCR，qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平變化，以Tubulin為內(nèi)參，利用SYBR Green I熒光染料反應(yīng)、循環(huán)數(shù)Ct 值法在ABI熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上檢測(cè)分析。內(nèi)參Tubulin和3個(gè)金屬硫蛋白基因hMT1a，hMT2a，hMT3的引物序列見(jiàn)表1。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

提取細(xì)胞總蛋白，以BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白含量。以SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)PVDF模后一抗和二抗孵育，以蛋白質(zhì)印跡法比較不同處理下的蛋白表達(dá)量變化。凝膠系統(tǒng)觀察取圖，以Tubulin蛋白為標(biāo)準(zhǔn)參照，用Image J軟件對(duì)圖片結(jié)果進(jìn)行灰度掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 膽固醇對(duì)RPE細(xì)胞金屬硫蛋白轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響

通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)正常培養(yǎng)對(duì)照組和加入玻璃膜疣主要成分膽固醇(2.5 mg/mL)處理0，6，12，24，48，72 h不同時(shí)間段ARPE-19細(xì)胞中三個(gè)金屬硫蛋白hMT1a，hMT2a，hMT3轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。結(jié)果表明：在正常培養(yǎng)條件下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，hMT1a，hMT2a，hMT3 mRNA表達(dá)略有變化，但變化不明顯，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1)。加入膽固醇培養(yǎng)后，與對(duì)照組相比，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，hMT1a，hMT2a，hMT3 mRNA表達(dá)都呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)，都是在12 h明顯增高，在24 h增高達(dá)到頂峰，48 h mRNA表達(dá)低于24 h但也是上調(diào)，在72 h時(shí)其表達(dá)略低于對(duì)照組但變化不顯著。其中hMT1a轉(zhuǎn)錄水平最高上調(diào)了4.9倍，hMT2a轉(zhuǎn)錄水平最高上調(diào)了17倍，hMT3轉(zhuǎn)錄水平最高上調(diào)了35倍。這些結(jié)果表明膽固醇處理下以hMT1a，hMT2a，hMT3為代表的金屬硫蛋白轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)上調(diào)，并且hMT3的變化最大。

2.2 膽固醇對(duì)RPE 細(xì)胞金屬硫蛋白蛋白水平表達(dá)的影響

通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)正常培養(yǎng)和2.5 mg/mL膽固醇處理0，6，12，24，48，72 h不同培養(yǎng)時(shí)間ARPE-19細(xì)胞中總金屬硫蛋白的蛋白表達(dá)情況(圖2)。結(jié)果表明：在正常培養(yǎng)時(shí)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)金屬硫蛋白表達(dá)略有增多，膽固醇處理24 h后金屬硫蛋白含量明顯增多(圖2A)。為定量比較兩組蛋白表達(dá)的變化，對(duì)蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果進(jìn)行了灰度分析。對(duì)照組金屬硫蛋白的蛋白含量變化無(wú)明顯趨勢(shì)，到12 h略有降低，繼續(xù)培養(yǎng)到48 h含量增多，之后在72 h出現(xiàn)回落。加入膽固醇培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞中金屬硫蛋白的蛋白含量隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷增多，在24 h開(kāi)始增多，48 h和72 h時(shí)增加倍數(shù)最大，最高增多了約4倍(圖2B)。與轉(zhuǎn)錄水平相比，膽固醇處理組MT蛋白水平表達(dá)增多時(shí)間上略有延遲。mRNA水平是從12 h開(kāi)始上調(diào)，到24 h水平最高，在48 h開(kāi)始回落(圖1)。這些結(jié)果表明：膽固醇處理下金屬硫蛋白的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。

圖1 膽固醇對(duì)(A) hMT1a，(B) hMT2a，(C) hMT33個(gè)基因mRNA表達(dá)水平的影響Figure 1 The effect of cholesterol treatment on the mRNA expression levels of the three genes (A) hMT1a,(B) hMT2a,(C) hMT3

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)膽固醇對(duì)總金屬硫蛋白表達(dá)水平的影響Figure 2 Western blot detection of the effect of cholesterol treatment on the protein expression levels of total metallothionein

3 討論

雖然MT在疾病發(fā)生的機(jī)制方面有待深入，但其在研究疾病研究中所顯現(xiàn)出來(lái)的重要作用得到了許多科研工作者的重視[2-3]。MT結(jié)合金屬離子及清除氧自由基的功能使其在抗衰老、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-3,12]。MT在許多疾病中的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)可以作為疾病檢測(cè)的標(biāo)志蛋白，或者可能成為新的治療方法的靶點(diǎn)[6,20]。在大鼠眼部組織中，MT可明顯表達(dá)于角膜上皮細(xì)胞、晶狀體、視網(wǎng)膜色素上皮層、視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等，在神經(jīng)纖維層也見(jiàn)表達(dá)[4]。在AMD患者的RPE細(xì)胞中檢測(cè)到MT的表達(dá)，并且過(guò)量表達(dá)MT3可能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)來(lái)抑制激光誘導(dǎo)的小鼠脈絡(luò)膜新生血管的進(jìn)程[5,20]。因此視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中MT的檢測(cè)可能有利于AMD的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療。但是目前對(duì)于MT與AMD特別是干性AMD發(fā)展進(jìn)程的關(guān)系尚不清楚。

在本研究中，以干性AMD的標(biāo)志物玻璃膜疣形成起始階段的主要成分膽固醇作用于RPE細(xì)胞，檢測(cè)金屬硫蛋白轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)膽固醇暴露使hMT1a，hMT2a，hMT3的mRNA表達(dá)上調(diào)，其中hMT3的表達(dá)上調(diào)倍數(shù)最大。在蛋白水平上，總金屬硫蛋白表達(dá)量明顯增多。這些結(jié)果表明RPE細(xì)胞金屬硫蛋白可能受到玻璃膜疣形成起始階段脂質(zhì)積累的刺激，特別是hMT3。金屬硫蛋白家族主要有4種類(lèi)型，其中MT1和MT2在所有組織大量表達(dá)，MT3主要在神經(jīng)系統(tǒng)包括視網(wǎng)膜中表達(dá)，MT4在皮膚上皮細(xì)胞中特異表達(dá)[1-2,4]。在小鼠中，MT3在RPE中的表達(dá)水平可能低于MT1a和MT2a[12]。但與MT1/MT2缺失相比，MT3缺失加劇了光暴露下小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷和活性氧產(chǎn)生，表明MT3可能比MT1/MT2在視網(wǎng)膜中發(fā)揮了更大作用[13]。而在本研究中受膽固醇刺激，金屬硫蛋白表達(dá)量明顯增多，但其中hMT3變化最明顯，表明相比于hMT1a和hMT2a可能hMT3與玻璃膜疣形成起始階段關(guān)系更加密切，值得深入探討。

AMD早期最顯著的特征是眼底黃斑玻璃膜疣，對(duì)早期AMD患者，觀察黃斑區(qū)玻璃疣的特征及發(fā)展，對(duì)AMD的早期診斷和預(yù)后具有重要價(jià)值[16]。金屬硫蛋白可在玻璃膜疣形成初期出現(xiàn)表達(dá)上的變化，表明其可能與玻璃膜疣的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能成為早期AMD中玻璃膜疣生物發(fā)生新的標(biāo)志物。但金屬硫蛋白是否可作為AMD的早期檢測(cè)的標(biāo)志物或影響玻璃膜疣形成進(jìn)程尚需進(jìn)一步探討。