汪 敏 ， 徐子恒 ， 王 粲 ， 梁競臻 ， 周辰瑜 ， 張遠(yuǎn)琴 ， 楊耀炎 ， 韋 平

(廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病研究所 ， 廣西 南寧 530000)

近年來，規(guī)?；B(yǎng)雞場發(fā)展迅速，但在養(yǎng)殖過程中，雞關(guān)節(jié)炎病凸顯，盡管該病的死亡率不高，但能導(dǎo)致病雞生長遲緩、生產(chǎn)性能下降、淘汰率增高[1]，對(duì)養(yǎng)殖場造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雞關(guān)節(jié)炎病是一類由病毒、細(xì)菌或支原體引起的以關(guān)節(jié)發(fā)炎、腫脹、站立困難、行走障礙等為特征的局部性疾病，主要病原有禽呼腸孤病毒(Avian reovirus,ARV)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaurous,S.aurous)、沙門菌(Salmonellaspp.)、滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae,MS)等[2-4]。研究顯示[5-6]，MS主要以水平傳播的方式導(dǎo)致雞群間感染，病原攜帶雞為主要的傳染源，此外還可經(jīng)垂直傳播感染下一代，產(chǎn)生病原攜帶者，成為全球家禽養(yǎng)殖業(yè)的一種重要的致病性病原體。目前報(bào)道的金黃色葡萄球菌和滑液囊支原體混合感染引起的雞關(guān)節(jié)炎病較為少見，本試驗(yàn)通過對(duì)廣西某蛋雞場關(guān)節(jié)炎發(fā)病雞群進(jìn)行病原鑒定及對(duì)滑液囊支原體陽性樣品進(jìn)行vlhA基因序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，旨在為由葡萄球菌和滑液囊支原體混合感染引起雞關(guān)節(jié)炎病的診斷和研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 廣西某養(yǎng)雞場有96日齡的海蘭灰蛋雞共50 000只，轉(zhuǎn)群后不少雞只于90日齡時(shí)開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、跗關(guān)節(jié)著地、臥地不起、行動(dòng)不便等癥狀，且腫脹部位手觸發(fā)熱有波動(dòng)感。每天以0.2%的增長率發(fā)病、死亡，淘汰率達(dá)0.3%。雞場曾針對(duì)雞群發(fā)病癥狀投以鹽酸頭孢噻呋和大觀林可霉素，但治療效果不佳。

1.2 主要試劑 革蘭染色液及常規(guī)生化試劑盒，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；17種常規(guī)藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；DNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒，均購自北京天根生化科技有限公司；pMD-18T載體，購自TaKaRa;DL-2 000 DNA Marker,購自南京諾維贊生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基,購自BIOLOGICAL INDUSTRIES;血平板和ddH2O，均由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 檢測方法

1.3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 用無菌接種環(huán)分別采集病雞的病變部位、骨髓及關(guān)節(jié)液，并劃線于血平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。挑取單個(gè)可疑菌落進(jìn)行革蘭染色觀察，并將其劃線于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。

1.3.2 生化鑒定 將上述1.3.1中的分離株接種于生化常規(guī)微量鑒定管中，并置于37 ℃培養(yǎng)24～72 h；同時(shí)進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)試管法，置于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.3.3 菌株16S rRNA 序列鑒定 用加熱煮沸法提取上述1.3.1中的菌株DNA并對(duì)其進(jìn)行16S rRNA序列鑒定。引物為16S rRNA基因通用引物，序列為F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R：5′-GGTCAGGTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增體系：GreenTaqMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 2 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性1 min，56 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再用DNA回收試劑盒進(jìn)行膠回收。將膠回收產(chǎn)物送至華大基因公司測序。將測序結(jié)果上傳至GenBank中進(jìn)行比對(duì)。

1.3.4 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn) 從血平板上挑取單個(gè)菌落接種于普通營養(yǎng)瓊脂板上37 ℃純化培養(yǎng)24 h，采取K-B紙片擴(kuò)散法[7]對(duì)純化后的分離株進(jìn)行17種常見抗菌藥的敏感性試驗(yàn)，并參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行判定。

1.3.5 MS的鑒定及vlhA基因測序 無菌取病雞關(guān)節(jié)滲出物置于DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，按照DNA提取試劑盒操作步驟提取DNA，并參照Ghaniei[9]建立的MS檢測方法對(duì)vlhA基因進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物序列為F：5′-TACTATTAGCAGCTAGTGC-3′，下游引物序列為R：5′-AGTAACCGATCCGCTTAAT-3′，擴(kuò)增目的條帶長度約為399 bp。PCR擴(kuò)增體系為25 μL：上、下游引物各0.5 μL，GreenTaqMix 12.5 μL，DNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并觀察結(jié)果。將陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后按膠回收試劑盒說明書步驟進(jìn)行膠回收，將其連接至pMD-18T載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。最后將篩選出的陽性菌液送至北京華大基因有限公司進(jìn)行測序。

1.3.6 序列進(jìn)化樹的構(gòu)建分析 使用 DNASTAR對(duì)測序序列進(jìn)行編輯以及同源性分析，并將其與 GenBank中參考序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)化樹由MAGE 6軟件制作完成。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀 病雞精神沉郁、羽毛蓬亂、消瘦、雞冠蒼白、關(guān)節(jié)腫大、單側(cè)或雙側(cè)跛行、無法站立、不愿走動(dòng)。

2.2 病理變化 剖檢發(fā)現(xiàn)病雞跗關(guān)節(jié)腫脹，大部分病變關(guān)節(jié)腔內(nèi)有干酪樣滲出物，少部分病變處有膿液，其他內(nèi)臟器官無明顯病變。

2.3 血平板分離培養(yǎng)及鏡檢 本試驗(yàn)的分離株在血平板上生長為濕潤、光滑、圓形、凸起的菌落，菌落較大，且在菌落周圍有β溶血環(huán)。革蘭染色后經(jīng)顯微鏡觀察，只存在藍(lán)紫色的球菌，初步確定其為葡萄球菌。5只病雞中有3只分離到葡萄球菌，分離率為60%(3/5)。

2.4 生化試驗(yàn) 由表1可知，本試驗(yàn)中分離到的葡萄球菌可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖，對(duì)凝固酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶呈陽性，不可發(fā)酵尿素、木糖醇、衛(wèi)矛醇、西蒙氏櫞酸鹽、硫化氫。

表1 分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Biochemical test results

2.5 16S rRNA鑒定 由圖1可知，分離菌株經(jīng)16S rRNA 通用引物PCR擴(kuò)增后，得到1 500 bp左右的條帶。將測序結(jié)果與GenBank中已有的金黃色葡萄球菌16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明，分離到的菌株與參考株金黃色葡萄球菌MK780062.1的同源性相近，為99%，說明本試驗(yàn)分離得到的葡萄球菌為金黃色葡萄球菌。

圖1 分離株的16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of the 16S rRNA PCR amplification of the isolationM.DL-2 000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：金黃色葡萄球菌； 2：陽性對(duì)照； 3：陰性對(duì)照M.DL-2 000 DNA marker； 1:S. aurous； 2:Positive control； 3:Negative control

2.6 藥敏試驗(yàn) 分離株對(duì)磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、萘啶酸、鏈霉素、四環(huán)素均不敏感；對(duì)環(huán)丙沙星敏感；對(duì)阿莫西林、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、甲氧芐胺嘧啶、慶大霉素、卡那霉素、呋喃妥因、氟苯尼考和丁胺卡那等不同類別抗菌藥均表現(xiàn)不同程度的敏感性。

2.7 MS檢測 由表2可知，5份樣品中有4份經(jīng)vlhA基因PCR擴(kuò)增出條帶，大小約為399 bp，與預(yù)期目的片段大小相符，表明擴(kuò)增樣品為MS陽性。目的片段測序結(jié)果經(jīng) MegAlign 分析，顯示其與GenBank中已上傳的 MS 序列的同源性在94%左右，表明該陽性樣品確實(shí)為滑液囊支原體。

表2 金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Staphylococcus aureus to 17 kinds of antibiotics

圖2 MS vlhA基因的PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR amplification of MS vlhA geneM:DL-2 000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1:MS陰性對(duì)照; 2:MS陽性對(duì)照; 3～4,6～7:陽性樣品MS引物基因的擴(kuò)增; 5:陰性樣品MS引物基因的擴(kuò)增M:DL-2 000 DNA marker; 1:MS negative control; 2:MS positive control; 3-4,6-7:MS gene fragment of positive samples; 5:MS gene fragment of negative samples

2.8 序列分析 由圖3可知，陽性樣品MS-1基于vlhA基因的保守區(qū)域的氨基酸殘基與國外參考株存在明顯的遺傳進(jìn)化差異，與國內(nèi)的參考株幾乎都處于同一分支上，未呈現(xiàn)出明顯的地域性，除與KU572366株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，據(jù)悉KU572366株屬于E基因群，而其余國內(nèi)參考株屬于K基因群。MS-1的序列與MS-H疫苗株序列(CP021129)的遺傳距離遠(yuǎn)，處在不同的進(jìn)化分支上，且CP021129與KU72366株的遺傳關(guān)系近。所以可判定本試驗(yàn)檢測到的MS陽性樣品不是由疫苗株感染所致，且不屬于E基因群。

圖3 基于vlhA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on vlhA gene sequence▲：本次試驗(yàn)的測序樣品▲：Sequenced sample in this experiment

3 討論

雞關(guān)節(jié)炎病是家禽養(yǎng)殖過程中較為常見的疾病之一，威脅著養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展、養(yǎng)殖水平的提高，由營養(yǎng)因素引起的雞關(guān)節(jié)炎病較為少見，但由禽呼腸孤病毒、滑液囊支原體、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌等病原單一或混合感染引起的雞關(guān)節(jié)炎病時(shí)有發(fā)生[10]。不同病原引起的臨床癥狀也較為相似，但僅憑肉眼無法確定發(fā)病病原，因此需依靠實(shí)驗(yàn)室技術(shù)進(jìn)行鑒定。無菌采集病雞的病變部位并進(jìn)行病原菌的分離鑒定、16S rRNA 基因序列測定和vlhA基因檢測，結(jié)果表明該雞場暴發(fā)雞關(guān)節(jié)炎病的原因是由金黃色葡萄球菌和滑液囊支原體混合感染。

金黃色葡萄球菌是一種條件性致病菌，廣泛存在于雞舍地面、空氣等環(huán)境中[1,11]；同時(shí)也是一種人獸共患病原菌，可引起人和多種動(dòng)物的敗血癥。此外被感染的家禽還可表現(xiàn)關(guān)節(jié)炎等癥狀，本試驗(yàn)從病雞的壞死股骨頭部位分離出金黃色葡萄球菌，這與姬忠華等[12]的研究結(jié)果相符。此外，創(chuàng)傷感染是金黃色葡萄球菌引起雞關(guān)節(jié)炎的主要原因[4]，同時(shí)立體籠養(yǎng)的養(yǎng)殖方式在一定程度上促進(jìn)細(xì)菌在雞體內(nèi)增殖，造成細(xì)菌性股骨頭壞死的發(fā)生[13]。結(jié)合雞場養(yǎng)殖情況及雞群發(fā)病情況可初步判定該雞群感染金黃色葡萄球菌的病程較長。凝固酶是金黃色葡萄球菌的主要致病因子，凝固酶試驗(yàn)是判定葡萄球是否具有致病性的重要試驗(yàn)。吳勝等[14]、張曉梅等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔接種金黃色葡萄球菌數(shù)小時(shí)后逐漸表現(xiàn)出精神不濟(jì)、敗血癥等癥狀，隨著病程的發(fā)展而死亡，結(jié)合本試驗(yàn)分離獲得的葡萄球菌的凝固酶試驗(yàn)為陽性，說明該分離菌株具有一定的致病能力。針對(duì)金黃色葡萄球菌的治療，目前最好的方法就是使用抗菌藥，但是抗菌藥的過度使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性增加，而該發(fā)病雞群的葡萄球菌分離菌株對(duì)鹽酸頭孢噻呋和大觀林可霉素不敏感，再結(jié)合本試驗(yàn)藥敏結(jié)果可知，該分離菌株已產(chǎn)生多重耐藥情況。建議雞場在投喂藥物前，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選擇用藥。本試驗(yàn)藥敏結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林等藥物較為敏感，可考慮作為治療該病的首選藥物。

MS主要引起雞和火雞的滲出性滑膜炎、腱鞘炎等。雞群一旦感染MS，便會(huì)終生帶菌，可通過蛋源垂直傳播或者接觸污染源水平傳播，且該病發(fā)展緩慢，病程較長。結(jié)合雞場實(shí)際情況，即發(fā)病蛋雞是從其他雞場引種過來的、雞場未免疫過疫苗以預(yù)防滑液囊支原體病，且vlhA基因序列分析表明該MS陽性樣品與疫苗株親緣關(guān)系遠(yuǎn)，推斷該雞群在引種前已有部分雞只感染MS，成為病原攜帶雞，再通過污染飼料、飲水等方式傳播該病，造成同群健康雞只感染。目前，我國MS的防治尚未大規(guī)模的使用MS疫苗，也尚無有效的特異性治療方式，多以藥物治療和及時(shí)淘汰發(fā)病雞群為主要手段。通過vlhA基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹分析可知，我國MS流行株的基因型與其他國家的差異較大，而本試驗(yàn)中檢測到的陽性樣品MS-1屬于K基因群，屬于國內(nèi)的流行毒株，可考慮用國內(nèi)流行血清型毒株制備針對(duì)性疫苗進(jìn)行MS的防治[16]。

綜上可知，該雞群暴發(fā)關(guān)節(jié)炎病的主要原因是在引種前已有部分蛋雞感染MS，再加上轉(zhuǎn)群過后，雞舍溫度、環(huán)境的變化或是工作人員暴力抓雞等因素引起雞群強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，致使機(jī)體抗體能力下降，并通過創(chuàng)傷繼發(fā)感染金黃色葡萄球菌導(dǎo)致發(fā)病。結(jié)合雞場的實(shí)際情況，建議采取以下幾種方式進(jìn)行后續(xù)防治工作：(1)及時(shí)淘汰發(fā)病雞群，并進(jìn)行無害化處理，對(duì)暫未發(fā)病雞群考慮用血清學(xué)檢測的方法淘汰陽性雞，有效控制MS污染；(2)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、提供良好的飼養(yǎng)環(huán)境，嚴(yán)格執(zhí)行生物安全管理措施；(3)慎重引種，應(yīng)從未發(fā)生過該病的正規(guī)雞場引種(引種前進(jìn)行血清學(xué)檢測)；(4)定期對(duì)環(huán)境進(jìn)行消毒；(5)針對(duì)發(fā)病雞群用藥時(shí)，應(yīng)結(jié)合藥敏試驗(yàn)的結(jié)果合理用藥，并注意藥物輪換使用，避免產(chǎn)生耐藥菌株；(6)考慮長期投喂具有預(yù)防作用的抗菌藥的替代物——益生菌；(7)今后對(duì)雞只進(jìn)行轉(zhuǎn)群時(shí)應(yīng)做好轉(zhuǎn)群前的準(zhǔn)備，如消毒擬轉(zhuǎn)入雞舍、準(zhǔn)備抗應(yīng)激藥物等，注意減少抓雞過程的應(yīng)激，做好轉(zhuǎn)群后的飼養(yǎng)管理等。