馬瑩慧 ， 熊 馨 ， 李 月 ， 于美娜 ， 矯艷磊 ， 雷玉敏 ， 時念秋

(吉林醫(yī)藥學院藥學院 , 吉林 吉林 132013)

長白山紅景天(Rhodiolasachalinensis)，又稱庫頁紅景天，為多年生草本植物，主要生長于我國吉林長白山及黑龍江等地區(qū)，是一種藥食兼用的珍貴植物?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，紅景天黃酮類化合物具有抗氧化、抑制腫瘤、預防心血管疾病等多種藥理作用，被廣泛應用于保健食品開發(fā)中[1-4]。隨著不斷的研究與發(fā)現(xiàn),紅景天中黃酮類化合物被證明在某些藥理活性方面優(yōu)于多糖類等組分[5-6]。本試驗通過對長白山紅景天中黃酮類成分進行提取和純化，并對其抗炎及抗氧化活性進行研究，為今后進一步研究、開發(fā)和利用長白山紅景天這一珍貴資源提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設備 多功能中藥粉碎機(旭郎機械公司)；數(shù)控超聲波清洗器(固特超聲儀器有限公司)；Rotavapor R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦有限公司)；Scientz-12SN冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；UV-1800型紫外分光光度計(上海奧析科學儀器有限公司)；酶標儀(美國伯樂公司)；Heal Force HF90/HF240 CO2培養(yǎng)箱(上海力新儀器有限公司)；倒置顯微鏡(南京麥迪森儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(上海汗諾儀器有限公司)；ESJ200-4B電子分析天平(沈陽龍騰電子有限公司)。

1.1.2 藥品與試劑 長白山紅景天中藥飲片(酒泉市培豐中藥材生態(tài)種植加工有限公司，批號：170801)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：8118069)；胎牛血清(美國Clark Bioscience公司，批號：JC53519)；青霉素、鏈霉素雙抗液(美國MRC公司，批號：SK171106)；胰蛋白酶(美國MRC公司，批號:TC71010)；噻唑藍(MTT，美國Sigma公司，批號：0973)；磷酸鹽平衡鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.2，美國HyClone公司，批號:AC11271276)；二甲基亞砜(DMSO,美國Solarbio公司，批號:1213C0214)；小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞(購自上海賽庫生物技術(shù)有限公司)；甲醇(分析純；江蘇漢邦科技有限公司)；蘆丁(上海源葉生物科技有限公司)；AB-8型樹脂(東鴻化工有限公司)；TNF-α、IL-10試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?、脂多糖(LPS，美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制 以蘆丁為對照品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮含量。精密稱5 mg蘆丁對照品置于容量瓶中，以50%乙醇定容至5 mL，配制成濃度為1 mg/mL的對照品溶液。分別取0.2、0.3、0.4、0.5、0.7 mL和0.9 mL至于試管中，用50%乙醇補足體積均為1 mL，各管中加5%亞硝酸鈉溶液0.2 mL，搖勻。靜置6 min后，加10%硝酸鋁溶液0.2 mL，搖勻。靜置6 min后，加4%氫氧化鈉溶液1 mL，用50%乙醇補足體積至10 mL，搖勻。靜置15 min后，在510 nm波長下，以50%乙醇為參比測定各管中藥液的吸光度值。以藥品濃度(X)—吸光度值(Y)進行線性回歸，得到蘆丁對照品的標準曲線[7-9]。

1.2.2 長白山紅景天中黃酮組分的提取 取干燥的長白山紅景天藥材，用粉碎機粉碎，過40目篩，晾干，稱重，設計單因素試驗，確定長白山紅景天中黃酮類成分最佳提取工藝。精密稱定長白山紅景天藥粉置于乙醇溶液中，超聲法進行提取，將超聲提取后的藥液進行抽濾，旋蒸至50 mL，用75% 乙醇溶液補足損失的體積。從濾液中取出0.2 mL，按照“1.2.1”項下方法測定長白山紅景天濾液吸光值，按如下公式計算黃酮得率(c為標準曲線中黃酮的濃度，m為稱取的長白山紅景天藥粉的質(zhì)量)。

1.2.3 單因素試驗 按照“1.2.2”項下方法，對黃酮組分進行提取，分別考察乙醇提取液的體積分數(shù)、料液比、超聲時間、超聲功率、超聲溫度對黃酮組分提取率的影響[10-12]。各因素水平范圍見表1，當考察某單一因素時，其他因素取水平范圍的中間值，例如對乙醇提取液的體積分數(shù)進行方法優(yōu)化時，固定料液比1∶25，超聲時間35 min，超聲溫度50 ℃，超聲功率150 W，主要考察乙醇的體積分數(shù)分別為40%、50%、60%、70%和80%，通過考察不同體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響，確定乙醇提取液的最佳體積分數(shù)。

表1 單因素水平范圍Table 1 Single factor level range

1.2.4 正交試驗 結(jié)合單因素試驗數(shù)據(jù)，選取提取液濃度、料液比、超聲時間及超聲功率為提取因素，建立四因素三水平的正交試驗，對各因素影響的顯著性及提取的最佳工藝進行進一步考察[8]。正交試驗因素水平見表2。

表2 正交試驗因素水平Table 2 Orthogonal test factor level table

1.2.5 長白山紅景天黃酮組分的純化 在室溫條件下，將AB-8大孔樹脂置于95%乙醇中密封浸泡24 h，用95%乙醇清洗，再用蒸餾水沖洗至流出液無醇味。取適量AB-8大孔樹脂和3根型號完全相同的柱子(樹脂裝柱體積為1 BV)，按照層析柱徑高比1∶16、上柱體積流量 2 BV/h、洗脫體積流量2 BV/h的條件進行純化。

首先，考察上樣濃度對AB-8樹脂吸附總黃酮效果的影響。取黃酮組分質(zhì)量濃度分別為0.2、0.1、0.05 、0.03 mg/mL和0.02 mg/mL的藥液進行上樣，收集經(jīng)樹脂吸附后的溶液，按以下公式計算吸附率(m1為粗提液中總黃酮含量，m2為收集液中總黃酮含量)。

其次，考察最佳上樣量。取黃酮組分質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的藥液進行上樣，過程中液體流速始終控制為2 BV/h，分段收集，每段收集10 mL，測定流出液中總黃酮含量與同體積粗提液中總黃酮的含量的百分比，繪制吸附泄漏曲線，考察藥液的最佳上樣量。

最后，考察洗脫劑體積分數(shù)及洗脫劑用量。以體積分數(shù)分別為40%、50%、60%、70%和80%的乙醇作解吸液，以2 BV/h的流動速度進行洗脫，通過計算洗脫液中黃酮組分的洗脫率，考察洗脫劑體積分數(shù)對黃酮組分解吸效果的影響(ma為洗脫液中總黃酮含量，mb為粗提液中總黃酮含量)。

用50%的乙醇溶液進行洗脫，分段收集，每段收集10 mL，測定流出液中黃酮類化合物的濃度，繪制動態(tài)洗脫曲線，對洗脫劑最適用量進行考察[13-18]。

1.2.6 長白山紅景天黃酮組分的體外抗炎試驗

1.2.6.1 長白山紅景天黃酮組分對巨噬細胞活性的影響 取對數(shù)生長期的RAW 264.7細胞，按2×104個/孔將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，放入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。試驗設空白對照組和不同濃度的樣品組，空白對照組加入培養(yǎng)基200 μL，樣品組分別加入黃酮化合物終濃度為 2、4、6、8、10、20、30、40 mg/mL和60 mg/mL的培養(yǎng)基0.2 mL，設5個復孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h后吸棄各孔上清液，加入100 μL質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移除MTT，加入DMSO 0.1 mL/孔，搖床搖晃5～10 min，于570 nm處測定各孔吸光度值，計算細胞存活率(A為不同濃度待測樣品吸光度值，A0為樣品溶液吸光度值)。

1.2.6.2 長白山紅景天黃酮組分對細胞因子TNF-α、IL-10表達的影響 按3×105個/孔將小鼠巨噬細胞接種于 6 孔細胞培養(yǎng)板，每孔200 μL。設空白對照組(培養(yǎng)液2 mL)、LPS模型組(含終濃度為10 μg/mL LPS 的培養(yǎng)液2 mL) 和黃酮組(含終濃度為4 mg/mL黃酮+10 μg/mL LPS的培養(yǎng)液2 mL)，每組設置5個復孔，于培養(yǎng)箱中共同處理 24 h。培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞上清液，按ELISA試劑盒說明書操作，檢測細胞因子TNF-α、IL-10 的分泌量[19-22]。

2 結(jié)果

2.1 蘆丁標準曲線的繪制 將蘆丁標準品按照“1.2.1”項下方法進行測定，得到蘆丁對照品的標準曲線，其線性回歸方程為y=9.011 8x+0.030 6,R2=0.999 1。

2.2 長白山紅景天黃酮組分的提取

2.2.1 各因素對黃酮組分提取率的影響 按照“1.2.3”項下方法對長白山紅景天黃酮組分進行單因素試驗，各單因素試驗結(jié)果見圖1，分析試驗結(jié)果，確定最佳提取工藝為：乙醇提取液體積分數(shù)為60%，料液比為1∶35，提取時間為35 min，提取溫度為60 ℃，提取功率為200 W。

圖1 各因素對黃酮組分提取率的影響Fig.1 Influence of various factors on extraction rate of flavonoids1、2、3、4、5：各因素的5個條件水平1,2,3,4,5：5 condition levels of each factor

2.2.2 正交試驗結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗數(shù)據(jù)可知，超聲溫度的曲線較平緩，與其余4種因素相比較，對黃酮組分提取率影響相對較小。因此，選取提取液濃度、料液比、超聲時間及超聲功率為提取因素，建立L9(34)正交試驗，正交試驗計劃表及結(jié)果見表3、表4。

表3 正交試驗計劃及直觀分析Table 3 Orthogonal test plan and visual analysis

表4 正交試驗方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test

根據(jù)表中各因素的極差R值大小，分析可知各因素對提取率影響的強弱關系為：乙醇體積分數(shù)>料液比>超聲時間>超聲功率。乙醇體積分數(shù)(A)K2>K1>K3，料液比(B)K2>K3>K1，超聲時間(C)K3>K1>K2，超聲功率(D)K2>K3>K1。根據(jù)正交試驗結(jié)果，確定最佳提取工藝為:乙醇體積分數(shù)為60%，料液比為1:35，超聲時間為40 min，超聲功率為200 W。利用此條件對長白山紅景天中黃酮組分進行提取，利用紫外分光光度法測定吸光度值，計算出黃酮組分純度為69.3%。

2.3 長白山紅景天黃酮組分的純化

2.3.1 上樣藥液質(zhì)量濃度對吸附率的影響 按照“1.2.5”項下方法進行試驗。當上樣藥液質(zhì)量濃度分別為0.02、0.03、0.05、0.10 mg/mL和0.20 mg/mL時，黃酮吸附率分別為32.58%、32.78%、46.74%、46.19%和46.06%，即隨著上樣藥液質(zhì)量濃度的增加，吸附率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當藥液質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL時，達到峰值，故最佳上樣藥液質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL。

2.3.2 吸附泄漏曲線的繪制 按照“1.2.5”項下方法對長白山紅景天黃酮組分最大上樣量進行考察，橫坐標用流出液的體積表示，縱坐標用流出液中總黃酮的含量與同體積粗提液中總黃酮的含量的百分比表示，繪制泄漏曲線見圖2，由圖可知當上樣量為2 BV時開始泄漏，故最大上樣量為2 BV。

圖2 泄漏曲線Fig.2 Leakage curve

2.3.3 洗脫劑體積分數(shù)對AB-8樹脂解吸總黃酮效果的考察 按照“1.2.5”項下方法對洗脫劑最適體積分數(shù)進行考察。當乙醇體積分數(shù)分別40%、50%、60%、70%和80%時，黃酮組分洗脫率分別為30.16%、48.22%、22.00%、19.66%和18.56%，故洗脫劑最適濃度為50%。

2.3.4 洗脫劑用量對AB-8樹脂解吸總黃酮效果的考察 按照“1.2.5”項下方法對洗脫劑用量進行考察。橫坐標用流出液體積表示，縱坐標用黃酮濃度表示，50%的乙醇用量為2.5 BV時，洗脫效果最佳，繪制洗脫曲線見圖3。

圖3 洗脫曲線Fig.3 Elution curve

最終確定長白山紅景天黃酮類成分的最佳純化工藝為：總黃酮超聲提取液上樣濃度0.05 mg/mL，最佳上樣量為2 BV，乙醇洗脫劑體積分數(shù)為50%，洗脫劑體積為2.5 BV，純化液經(jīng)冷凍干燥后精密稱定凍干粉，利用紫外分光光度計測定黃酮類成分的吸光度值，計算出黃酮成分純度為81.6%，較純化前純度提高了12.3%。

2.4 長白山紅景天黃酮組分的體外抗炎試驗

2.4.1 長白山紅景天黃酮組分對巨噬細胞活性的影響 按照“1.2.6”項下方法進行細胞毒試驗，結(jié)果見圖4。長白山紅景天總黃酮濃度在0～4 mg/mL時，對小鼠巨噬細胞無細胞毒性作用，故選擇質(zhì)量濃度為4 mg/mL的總黃酮用于后續(xù)試驗。

圖4 不同質(zhì)量濃度的總黃酮對小鼠巨噬細胞活性的影響Fig.4 Effect of different mass concentrations of total flavonoids on the activity of mouse macrophages

2.4.2 長白山紅景天總黃酮對細胞因子 TNF-α、IL-10表達的影響 通過檢測各組細胞培養(yǎng)液中 TNF-α和IL-10的分泌水平，評價長白山紅景天黃酮類化合物對 LPS 誘導小鼠巨噬細胞分泌細胞因子含量的影響，其結(jié)果見表5。由結(jié)果可知，與LPS模型組相比，長白山紅景天黃酮組分顯著抑制了促炎因子TNF-α的分泌(P<0.01)，促進了抗炎因子IL-10的分泌(P<0.05)，說明長白山紅景天黃酮組分具有良好的抗炎作用。

表5 ELISA法測定細胞因子 TNF-α、IL-10的分泌量Table 5 Determination of cytokine TNF-α and IL-10 secretion by ELISA method

3 討論

紅景天作為我國一種傳統(tǒng)的草藥，具有止血、抗抑郁、治療腹瀉、保護神經(jīng)等多種功能，具有較高的藥用及保健價值[23-27]。其有效成分黃酮組分的提取多采用超聲波提取法、有機溶劑提取法及超臨界流體萃取法等多種方法。其中超聲波提取法具有所需時間短、利用率高、操作方便等優(yōu)點[28]。本試驗通過超聲波提取法對長白山紅景天黃酮組分進行提取，得出其最佳提取工藝為采用50%乙醇作為提取溶劑，料液比為1∶35,60 ℃、200 W條件下超聲提取35 min，提取后黃酮組分純度為69.3%。黃酮組分的分離純化方法有多種，其中以大孔吸附樹脂進行純化最為常見，本試驗應用AB-8 大孔樹脂，按照層析柱徑高比為1∶16，藥液中黃酮組分濃度為0.05 mg/mL，以2 BV/h的流量速度上樣2 BV，再以50%乙醇洗脫2.5 BV的條件對超聲波提取后的藥液進行純化，純化后總黃酮純度為81.6%，較提取后純度提高了12.3%，為接下來的研究提供了物質(zhì)基礎。

TNF-α是一種早期炎癥因子，是炎癥發(fā)生過程中的重要介質(zhì)，可引發(fā)一系列炎癥；IL-10是一種多功能細胞因子，調(diào)節(jié)炎癥的持續(xù)時間和反應過程是其主要生物學功能，同時還具有選擇性的阻斷促炎性細胞因子以及趨化因子表達的功能，是目前公認的炎癥抑制因子[21-22]。長白山紅景天中黃酮組分可顯著抑制TNF-α的分泌，并且明顯提高IL-10的含量，說明具有良好的抗炎活性。本試驗主要從細胞水平考察了黃酮組分的體外抗炎作用，為進一步確證，可采用體內(nèi)動物試驗深入研究。