王軼男 ， 胡詩(shī)悅 ， 陳洪濤 ， 金春梅 ， 金 一 ， 于龍政

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ， 吉林 延吉 133002 ； 2. 長(zhǎng)春市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 吉林 長(zhǎng)春 130000 ；3. 山東省新泰市泉溝鎮(zhèn)人民政府 ， 山東 新泰 271207)

牛瑟氏泰勒蟲(chóng)(Theileriasergenti)是一種泰勒屬的血液原蟲(chóng)，通過(guò)破壞紅細(xì)胞發(fā)揮致病作用[1]。病牛早期出現(xiàn)不愿行走、虛弱等癥狀，重癥病例出現(xiàn)黃疸、食欲廢絕、不能站立等嚴(yán)重癥狀[2]。伴隨養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的擴(kuò)大，在我國(guó)不同地理區(qū)域不斷發(fā)現(xiàn)牛瑟氏泰勒蟲(chóng)感染。肉牛產(chǎn)業(yè)是吉林省近年來(lái)的重點(diǎn)發(fā)展產(chǎn)業(yè)，因此要有效防治該病的發(fā)生，減少和降低養(yǎng)牛業(yè)的損失。P33基因是牛瑟氏泰勒蟲(chóng)的功能基因，基因序列全長(zhǎng)868 bp[3]。

牛瑟氏泰勒蟲(chóng)免疫學(xué)檢測(cè)方法主要包括間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、乳膠凝集試驗(yàn)(LA)、平面聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、分子生物學(xué)診斷等[4-6]。用以上方法都能診斷出該病，但仍存在特異性較差、敏感性較低、擴(kuò)增產(chǎn)物的污染導(dǎo)致假陽(yáng)性等問(wèn)題，因此不能有效防控該病。鑒于上述原因，本試驗(yàn)旨在建立牛瑟氏泰勒蟲(chóng)的TaqMan熒光定量PCR和SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)方法，為其快速檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本 采集吉林省延邊朝鮮族自治州1個(gè)規(guī)模養(yǎng)牛場(chǎng)的牛血液樣品作為檢測(cè)血樣，并于-20 ℃冷凍保存。

1.2 主要試劑 Blood DNA Midi Kit、Plasmid Maxi Kit、Gel Extraction Kit等，均購(gòu)自O(shè)MEGA Bio-Tek生物技術(shù)公司；rTaqDNA聚合酶、ExTaqDNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ、pMD 18-T Vector克隆載體、SYBRPremixExTaqⅡ、PremixExTaq等，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成 本試驗(yàn)應(yīng)用軟件Primer Express設(shè)計(jì)引物，并根據(jù)熒光定量PCR引物和探針設(shè)計(jì)原則，用軟件Primer Premier和Oligo分別評(píng)估引物和探針。其中選擇FAM作為探針5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，選擇TAMRA作為探針3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。同時(shí)參考Yu等[2]推薦的常規(guī)PCR引物序列。引物和探針序列見(jiàn)表1，均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 PCR和real-time PCR所用的引物核苷酸序列Table 1 Details of primers for PCR and real-time PCR

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備和鑒定 提取蟲(chóng)體陽(yáng)性全血基因組DNA，并以陽(yáng)性DNA為模板，利用表1中Ts-TaqMan-F和Ts-TaqMan-R為引物(Ts-TaqMan-F/Ts-TaqMan-R和Ts-SYBR-F/Ts-SYBR-R是擴(kuò)增同一片段)進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：10×ExTaqBuffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，DNA模板 2 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 16.25 μL，ExTaqDNA聚合酶 0.25 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 45 s，退火60 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；再延伸72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物符合預(yù)期片段大小的回收純化，4 ℃過(guò)夜條件下連接到pMD-18T Vector載體，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA。然后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定、雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定。構(gòu)建的重組質(zhì)粒檢測(cè)濃度并計(jì)算拷貝數(shù)后作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性試驗(yàn) 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按10倍倍比梯度稀釋為109～100copies/μL，各取1 μL進(jìn)行擴(kuò)增。SYBR Green方法中20 μL最佳反應(yīng)體系：SYBR PremixExTaq10 μL，上、下引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。探針?lè)椒ㄖ?0 μL最佳反應(yīng)體系：ExTaq12.5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL,上、下引物各0.8 μL，探針0.6 μL，模板2 μL，ddH2O 3.1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。使用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3005P進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，以每個(gè)稀釋度質(zhì)粒模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)確定建立方法可檢測(cè)到的最低拷貝數(shù)以確定其敏感性。

1.4.3 特異性試驗(yàn) 以犬新孢子蟲(chóng)(Neosporacaninum)、附紅細(xì)胞體(Mycoplasmasuis)、弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)的DNA作為模本，以瑟氏泰勒蟲(chóng)的DNA作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行熒光定量PCR的檢測(cè)，繪制出特異性試驗(yàn)的擴(kuò)增曲線。

1.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 選取不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行3組，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)，以評(píng)估建立方法的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備和鑒定 利用克隆引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，如圖1所示，得到與預(yù)期一致的101 bp片段。將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序?qū)Ρ龋Y(jié)果均與預(yù)期相符，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建成功，見(jiàn)圖2。測(cè)定質(zhì)粒濃度，計(jì)算拷貝數(shù)為2.26×1010copies/μL，進(jìn)行10倍倍比稀釋成2.26×1010～2.26 copies/μL。

圖1 P33基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR product of P33 gene M:DNA marker DL2 000; 1:P33基因; 2:陰性對(duì)照M:DNA marker DL2 000; 1:P33 gene; 2:Negative control圖2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建Fig.2 Construction of standard plasmidM:DNA marker DL2 000; 1:陽(yáng)性對(duì)照; 2:陰性對(duì)照M:DNA marker DL2 000; 1:Positive control; 2:Negative control

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性試驗(yàn) 用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10倍倍比稀釋作為模板進(jìn)行SYBR Green熒光定量PCR的擴(kuò)增，由圖3可知，生成典型S型的擴(kuò)增曲線且靈敏度為2.26 copies/μL。在2.26×108～2.26×101copies/μL范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，Ct值(y)與樣品初始拷貝數(shù)(x)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=-3.314x+38.34(相關(guān)系數(shù)R2=0.993，擴(kuò)增效率E=100.3%)。如圖4所示，熔解曲線的熔解溫度Tm為(83.1±0.5)℃，無(wú)引物二聚體及非特異產(chǎn)物，且只有單一特異峰。用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10倍倍比稀釋作為模板進(jìn)行TaqMan熒光定量PCR的擴(kuò)增，如圖5所示，生成典型S型的擴(kuò)增曲線且靈敏度為2.26 copies/μL。在2.26×108～2.26×101copies/μL范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，Ct值(y)與樣品初始拷貝數(shù)(x)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=-3.509x+42.93(相關(guān)系數(shù)R2=0.996，擴(kuò)增效率E=92.7%)。

圖3 SYBR Green PCR 方法的建立Fig.3 Establishment of SYBR Green PCRA:擴(kuò)增曲線； B:標(biāo)準(zhǔn)曲線A:Amplification curve; B:Standard curve1:2.26×108copies/μL； 2:2.26×107copies/μL； 3:2.26×106copies/μL； 4:2.26×105copies/μL； 5:2.26×104copies/μL；6:2.26×103copies/μL； 7:2.26×102copies/μL； 8:2.26×101copies/μL； 9:2.26 copies/μL

圖4 SYBR Green PCR 熔解曲線Fig.4 Dissociation curve of SYBR Green PCR

圖5 TaqMan PCR 方法的建立Fig.5 Establishment of TaqMan PCRA:擴(kuò)增曲線； B:標(biāo)準(zhǔn)曲線A:Amplification curve; B:Standard curve1:2.26×108copies/μL； 2:2.26×107copies/μL； 3:2.26×106copies/μL； 4:2.26×105copies/μL； 5:2.26×104copies/μL；6:2.26×103copies/μL； 7:2.26×102copies/μL； 8:2.26×101copies/μL； 9:2.26 copies/μL

2.3 特異性試驗(yàn) 分別用N.caninum、M.suis、T.gondii和3個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的DNA作為樣本進(jìn)行2種熒光定量PCR方法的特異性試驗(yàn)。如圖6和圖7所示，均未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增曲線，證明針對(duì)P33的引物具有較好的特異性。且SYBR Green PCR方法得到的熔解曲線在83 ℃出現(xiàn)單一特異峰，無(wú)引物二聚體等，見(jiàn)圖6。

圖6 SYBR Green PCR 特異性分析Fig.6 Specificity of SYBR Green PCRA:擴(kuò)增曲線； B:熔解曲線A:Amplification curve； B:Dissociation curve1～3:TsP1質(zhì)粒; 4:弓形蟲(chóng); 5:附紅細(xì)胞體; 6:新孢子蟲(chóng)1-3:TsP1 plasmid; 4:Toxoplasma gondii; 5:Mycoplasma suis; 6:Neospora caninum

圖7 TaqMan PCR 特異性分析Fig.7 Specificity of TaqMan PCR1～3:TsP1質(zhì)粒; 4:新孢子蟲(chóng); 5:弓形蟲(chóng); 6:附紅細(xì)胞體1-3:TsP1 plasmid; 4:Neospora caninum; 5:Toxoplasma gondii; 6:Mycoplasma suis

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) SYBR Green 熒光定量PCR方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)是通過(guò)選取2.26×108、2.26×104copies/μL和2.26 copies/μL三個(gè)不同稀釋度的質(zhì)粒來(lái)評(píng)估的。批內(nèi)結(jié)果CV值介于0.95%～3.24%，見(jiàn)表2；批間結(jié)果CV值介于1.06%～3.54%，見(jiàn)表3。2個(gè)試驗(yàn)的CV值均小于4%。

表2 SYBR Green PCR 批內(nèi)試驗(yàn)Table 2 Intra-assay variability of SYBR Green PCR

表3 SYBR Green PCR 批間試驗(yàn)Table 3 Inter-assay variability of SYBR Green PCR

TaqMan熒光定量PCR方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)是通過(guò)選取2.26×108、2.26×105copies/μL和2.26×103copies/μL三個(gè)不同稀釋度的質(zhì)粒來(lái)評(píng)估的。批內(nèi)結(jié)果CV值介于1.61%～1.98%，見(jiàn)表4；批間結(jié)果CV值介于1.37%～3.04%，見(jiàn)表5。2個(gè)試驗(yàn)的CV值均小于4%。

表4 TaqMan PCR 批內(nèi)試驗(yàn)Table 4 Intra-assay variability of TaqMan PCR

表5 TaqMan PCR 批間試驗(yàn)Table 5 Inter-assay variability of TaqMan PCR

3 討論

牛瑟氏泰勒蟲(chóng)是通過(guò)寄生在紅細(xì)胞內(nèi)引起紅細(xì)胞破裂和溶血的牛血液原蟲(chóng)，在我國(guó)吉林省、甘肅省、貴州省等多個(gè)地區(qū)均存在[1,7-8]。牛瑟氏泰勒蟲(chóng)呈低致病性，在本地牛群中表現(xiàn)為帶蟲(chóng)感染，臨床癥狀不明顯，但對(duì)外地引進(jìn)牛的感染率和致死率很高，同時(shí)臨床癥狀較為明顯[7]。熒光定量PCR由于其簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、快速且準(zhǔn)確的特點(diǎn)，在分子生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[9]。本試驗(yàn)通過(guò)牛瑟氏泰勒蟲(chóng)P33基因分別設(shè)計(jì)特異性引物和探針，成功建立SYBR Green和TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法。

本試驗(yàn)所建立的2種熒光定量方法在拷貝數(shù)2.26×108～2.26 copies/μL范圍內(nèi)都能檢測(cè)到，均呈現(xiàn)典型S型曲線。2種熒光定量PCR方法檢測(cè)靈敏度均為2.26 copies/μL；特異性試驗(yàn)中陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增曲線；重復(fù)性試驗(yàn)中批內(nèi)和批間CV值均小于4%。

綜上所述，本試驗(yàn)建立的牛瑟氏泰勒蟲(chóng)熒光定量PCR方法具有很好的敏感度、特異性及重復(fù)性，為牛瑟氏泰勒蟲(chóng)的鑒別提供一種快速檢測(cè)的技術(shù)參考。