朱雨凝 ， 姜忠玲 ， 叢 霞 ， 曹榮峰 ， 李華濤 ， 田文儒 ， 豐艷妮

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

奶牛鈣、磷代謝紊亂性疾病是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中重要常發(fā)病，圍產(chǎn)期奶牛分娩后轉(zhuǎn)為泌乳過(guò)程的生理應(yīng)激，以及體內(nèi)鈣的分配供給失衡，無(wú)法維持正常的血鈣濃度，易發(fā)生低鈣血癥[1]；正常泌乳奶牛受疾病、飼養(yǎng)或環(huán)境等因素影響機(jī)體鈣代謝平衡，也會(huì)引起奶牛鈣代謝紊亂。鈣的代謝與腎臟功能密切相關(guān)，腎小球?yàn)V出的鈣90%以上被腎小管重吸收，腎臟相關(guān)疾病會(huì)引起鈣代謝紊亂，同樣鈣代謝紊亂也會(huì)引起腎臟疾病[2-3]。

RNA-seq作為一種高通量測(cè)序技術(shù)，能在單核苷酸水平上對(duì)特定器官、組織或細(xì)胞所處狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行深度檢測(cè)[4]。現(xiàn)有的診斷方法難以對(duì)奶牛鈣磷代謝紊亂性疾病進(jìn)行早期診斷或預(yù)警。因此，本試驗(yàn)以牛腎小管上皮細(xì)胞為研究材料，利用RNA-seq技術(shù)分析低鈣環(huán)境造成差異表達(dá)基因，以期找出低鈣狀態(tài)下早期診斷或預(yù)警圍產(chǎn)期奶牛低鈣血癥的方法或生物標(biāo)志物，為有效預(yù)警圍產(chǎn)期奶牛低鈣血癥并提早防控其發(fā)生、發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 高糖DMEM/F12，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清(FBS)，購(gòu)自HyClone公司；EDTA、EGTA、100×青鏈霉素混合液、核酸染料、瓊脂糖粉劑和1×TAE電泳液，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞楓(DMSO)、胰蛋白酶，均購(gòu)自美國(guó)默克密理博公司；CCK-8試劑和Ca2+濃度測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RNA提取試劑盒，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；TRIzol溶液、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光染料(TB Green PremixExTaqⅡ)和DL2 000 Marker，均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix，購(gòu)自北京全式金生物；Qubit?RNA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自Life Technologies(美國(guó))；引物由上海派森諾生物科技股份有限公司合成；其他試劑均為化學(xué)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 牛腎細(xì)胞MDBK(NBL-1)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院，源自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的高糖F12/DMEM完全培養(yǎng)液將牛腎細(xì)胞培養(yǎng)于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量約為106個(gè)，置于37 ℃含5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 牛腎細(xì)胞體外低鈣培養(yǎng)環(huán)境的建立 依據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，利用EGTA螯合Ca2+來(lái)創(chuàng)造低鈣環(huán)境，將牛腎細(xì)胞分為DP組(對(duì)照組，Ca2+濃度為0.959 mmol/L)、DE1組(0.5 mmol/L EGTA，Ca2+濃度為0.851 mmol/L)、DE2組(1.0 mmol/L EGTA，Ca2+濃度為0.429 mmol/L)和DE3組(2.0 mmol/L EGTA，Ca2+濃度為0.002 mmol/L)。利用CCK-8試劑盒連續(xù)測(cè)定每天的細(xì)胞活力并繪制細(xì)胞活力曲線。同時(shí)，在顯微鏡下觀察更換培養(yǎng)液后1～3 d細(xì)胞的形態(tài)變化，以確定下一步試驗(yàn)的Ca2+濃度和處理時(shí)間。

1.2.3 cDNA文庫(kù)構(gòu)建 試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)72 h送公司進(jìn)行測(cè)序，簡(jiǎn)要步驟如下：提取細(xì)胞總RNA，將富集mRNA打成短片段，以其為模板，合成cDNA第1鏈和第2鏈。將雙鏈cDNA純化修復(fù)后加polyA尾，連接測(cè)序接頭，選擇適宜片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物純化，最終得到特異性cDNA文庫(kù)，質(zhì)檢合格后上機(jī)測(cè)序。

1.2.4 RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)分析 參考文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行測(cè)序分析系，即將Clean reads與參考基因組序列比對(duì)，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)獲得差異表達(dá)基因，最后對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋及GO、KEGG富集檢驗(yàn)，獲得差異表達(dá)基因所富集的GO、KEGG集合。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢驗(yàn)測(cè)序結(jié)果 依據(jù)測(cè)序結(jié)果挑選與Ca2+濃度密切相關(guān)的差異基因運(yùn)用RT-qPCR驗(yàn)證，引物序列如表1。PCR程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40個(gè)循環(huán)。β-actin為內(nèi)參基因，以2-△△Ct方法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。使用GraphPad Prism 6.0軟件中One-way ANOVA進(jìn)行分析，P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Real-time qPCR primers

2 結(jié)果

2.1 鈣離子濃度與細(xì)胞生長(zhǎng) 與DP組相比，DE1組和DE2組細(xì)胞活力在培養(yǎng)第2天后開(kāi)始下降，而DE3組細(xì)胞活力從第1天開(kāi)始一直呈下降趨勢(shì)，第3天細(xì)胞活力基本為0。DE2組細(xì)胞生長(zhǎng)活力在第3天開(kāi)始出現(xiàn)明顯的下降，到第4天達(dá)到最低。DE1組細(xì)胞活力變化則不明顯(圖1)。

圖1 不同鈣濃度培養(yǎng)基中牛腎細(xì)胞細(xì)胞活力Fig. 1 Viability of bovine renal tubular epithelial cells in media containing different calcium concentrations

觀察不同濃度Ca2+培養(yǎng)基處理的細(xì)胞形態(tài)，如圖2所示，DE3組從24 h開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞脫壁現(xiàn)象；與DP組相比，DE1組細(xì)胞變化不明顯，而DE2組細(xì)胞表現(xiàn)為增殖速度減慢，細(xì)胞漂浮較多，因此，選擇DE2組(1mmol/L EGTA)作為試驗(yàn)組進(jìn)行測(cè)序以分析差異基因的表達(dá)。

圖2 不同Ca2+濃度培養(yǎng)液培養(yǎng)的牛腎小管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)(40×)Fig.2 Growth status of bovine renal tubular epithelial cells cultured in the media containing different calcium concentrations (40×)黑色箭頭:細(xì)胞皺縮； 白色圓圈:細(xì)胞質(zhì)空泡化Black arrow:Cell shrinkage； White cycle:Cytoplasmic vacuolation

2.2 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估 為保證信息分析質(zhì)量，對(duì)原始測(cè)序序列(Sequenced reads)進(jìn)行過(guò)濾后得到Clean reads，基于Clean reads進(jìn)行后續(xù)分析。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GC含量為47%左右，Q20值達(dá)100%，Q30值在99%左右，堿基質(zhì)量符合要求。

2.3 差異表達(dá)基因的篩選 以log2(Fold change)和顯著水平(q-value)2個(gè)因素進(jìn)行評(píng)估，并用火山圖可視化差異表達(dá)基因的整體分布情況。本試驗(yàn)中共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因114個(gè)，其中上調(diào)基因21個(gè)，下調(diào)基因87個(gè)(圖3)。

圖3 試驗(yàn)組與對(duì)照組間基因差異表達(dá)分析火山圖Fig.3 Comparative analysis of differentially expressed genes between the experimental group and the control group藍(lán)點(diǎn)：下調(diào)的差異表達(dá)基因；紅點(diǎn)：上調(diào)差異表達(dá)基因；灰點(diǎn)：非差異表達(dá)基因Blue dots: Down-regulated genes; Red dots: Up-regulated genes; Gray dots: Non-differentially expressed genes

2.4 差異表達(dá)基因GO富集分析 GO分析包括細(xì)胞組成、分子功能和生物過(guò)程3個(gè)方面。本試驗(yàn)中差異表達(dá)基因主要富集在蛋白質(zhì)合成(超過(guò)20個(gè))、磷脂酰肌醇調(diào)節(jié)信號(hào)通路(4個(gè))、PI3K-Akt信號(hào)通路(3個(gè))、肌醇介導(dǎo)的信號(hào)通路(4個(gè))等通路中(圖4)。

圖4 兩組細(xì)胞差異表達(dá)基因GO富集分析柱狀圖(DE組與DP組比較)Fig.4 Histogram of GO enrichment analysis of differentially expressed genes in two cell groups(DE group versus DP group)

2.5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因中PIK3CA、G-CSF、TSC2、CDC37、ERBB3和MDM2等富集于PI3K-Akt信號(hào)通路中(圖5A)；PLCD3、PIK3CA、TSC2和MDM2等富集于甲狀腺激素信號(hào)通路中(圖5B)，這些差異基因的富集對(duì)生物標(biāo)志物的尋找有重要的提示作用。

圖5 信號(hào)通路的變化 Fig.5 Changes of the signal pathwaysA：PI3K-Akt; B:甲狀腺激素信號(hào)通路深色陰影標(biāo)注：表達(dá)量減少的基因； 淺色陰影：表達(dá)量增加的基因A:PI3K-Akt; B:Thyroid hormone signal pathwayDark shading marks: Genes with reduced expression; Light shadows: Genes with increased expression

2.6 RT-qPCR驗(yàn)證差異基因 結(jié)合Ca2+調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，選取與Ca2+密切相關(guān)的14個(gè)差異顯著基因，采用RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證其表達(dá)量?；虻牟町惐磉_(dá)倍數(shù)(log2FC)與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，篩選的14個(gè)基因的變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本相同(圖6)。

圖6 RT-qPCR與RNA-seq測(cè)序結(jié)果差異倍數(shù)及趨勢(shì)對(duì)比Fig.6 Comparison of differential multiple and trend between RT-qPCR and RNA-seq results

3 討論

奶牛低鈣血癥不僅是圍產(chǎn)期的代謝類疾病，還會(huì)誘發(fā)奶牛其他產(chǎn)后期疾病，嚴(yán)重影響奶牛的健康和經(jīng)濟(jì)效益。鈣的代謝與腎臟關(guān)系密切[2,7]。生理情況下，循環(huán)中的鈣平衡，尤其是游離鈣的平衡常常依賴于腎臟的調(diào)節(jié)。本試驗(yàn)基于Illumina HiSeq Xten測(cè)序平臺(tái)對(duì)低Ca2+環(huán)境下的牛腎細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，尋找低鈣環(huán)境下差異表達(dá)的基因，借助GO和KEGG富集分析，為找出潛在的評(píng)估奶牛低血鈣的生物學(xué)指標(biāo)奠定基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)中，富集在甲狀腺信號(hào)通路里的差異顯著基因主要有MDM2、PLCD1、P1K3CA、TSC2。MDM2作為一種原癌基因，是調(diào)節(jié)p53通路的重要基因，具有降解p53及泛素化的功能，能夠增強(qiáng)細(xì)胞生存活力，延長(zhǎng)細(xì)胞生存期，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[8-9]。PLCD1是PLC超家族的成員之一，PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，其C2結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合2個(gè)Ca2+，通過(guò)引導(dǎo)Ca2+釋放和活化蛋白激酶C參與細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、激素分泌、鈣穩(wěn)態(tài)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞骨架整合等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10-11]。PIK3CA基因是磷脂酰肌醇-3激酶催化亞基α基因，其蛋白是PI3K-Akt信號(hào)通路中的重要因子，參與細(xì)胞增殖、黏附和分化以及細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)重排等生理過(guò)程[12-13]。作為腫瘤抑制因子，TSC2基因的蛋白產(chǎn)物Tuberin，通過(guò)抑制mTOR的活性，控制細(xì)胞的增殖與分化。在有絲分裂期間，PI3K/Akt磷酸化Tuberin，降低其GAP活性，抑制Hamartin/Tuherin復(fù)合體的抑腫瘤功能[14]。本試驗(yàn)中，PLCD1、PIK3CA、TSC2在低鈣環(huán)境下的表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)，僅MDM2呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明低鈣環(huán)境均對(duì)細(xì)胞的增殖、黏附、分化以及細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞抑癌功能都具有負(fù)面的影響。

PI3K/Akt信號(hào)通路是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，可調(diào)節(jié)多種生理功能，對(duì)細(xì)胞凋亡、惡變、腫瘤、放射治療、病理性疼痛等都有重要作用[13,15]。在本試驗(yàn)中，TSC2、MDM2、PIK3CA與G-CSF、CDC37和ERBB3等基因富集在PIK3-Akt信號(hào)通路中。G-CSF在體內(nèi)來(lái)源廣泛，能刺激位于休止期多能造血干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，增加中性粒細(xì)胞的數(shù)量，激活其殺菌活性，從而有效地刺激骨髓造血，動(dòng)員造血干細(xì)胞進(jìn)入外周血[16-17]。CDC37特異地募集蛋白激酶與HSP90結(jié)合形成分子伴侶復(fù)合體，以維持激酶蛋白的穩(wěn)定和正常功能[18]。研究表明，Akt蛋白與CDC37和HSP90形成分子伴侶復(fù)合體后，能夠被其上游激酶PDK1所激活；此外，外源性Cdc37也可以增強(qiáng)Akt和Hsp90之間的結(jié)合[19]。ERBB3又稱為HER3基因，是表皮生長(zhǎng)因子受體家族(EGFR)中的第3個(gè)成員，它與ERBB2形成的異源二聚體通過(guò)激活PI3K-Akt/NF-κB抗凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞能抵抗凋亡[20]。在本試驗(yàn)中，除MDM2以外，其他基因的表達(dá)量在低鈣環(huán)境下都是下降的，由此可見(jiàn)，低鈣環(huán)境不利于細(xì)胞免疫功能、抗凋亡能力、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能的發(fā)揮。

Ca2+對(duì)細(xì)胞連接構(gòu)成以及維持發(fā)揮重要的作用，細(xì)胞外游離Ca2+濃度降低或細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高均可抑制細(xì)胞間隙連接，破壞其完整性[21-22]。因此，我們認(rèn)為鈣的吸收和調(diào)節(jié)對(duì)維持細(xì)胞正常功能至關(guān)重要。甲狀腺激素可以調(diào)節(jié)腎小管對(duì)鈣的重吸收，調(diào)節(jié)尿液中的鈣含量，以維持機(jī)體鈣平衡；此外，甲狀腺激素影響骨重建、促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，調(diào)節(jié)骨骼的新陳代謝，對(duì)骨骼生長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度維持起關(guān)鍵作用[23]。低鈣環(huán)境下，腎小管上皮細(xì)胞差異表達(dá)的基因有些富集在甲狀腺激素信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路中。因此，我們認(rèn)為低鈣對(duì)細(xì)胞的影響可能是通過(guò)甲狀腺激素信號(hào)通路來(lái)起作用的。

低鈣環(huán)境可抑制牛腎細(xì)胞的增殖、分化、抗凋亡和細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)，本試驗(yàn)從114個(gè)差異表達(dá)基因中篩選出與Ca2+調(diào)節(jié)相關(guān)的14個(gè)基因并驗(yàn)證，為進(jìn)一步利用患病牛建立奶牛低鈣血癥診斷的生物學(xué)標(biāo)志提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。