董俊斌 ， 包海泉

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 , 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018 ;2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

馬胃蠅廣泛分布于世界各地,其幼蟲在動(dòng)物消化道中發(fā)育，能引起長鼻目(Proboscidea),犀科(Rhinocerotidae)，馬科(Equidae)動(dòng)物的寄生蟲病[1]。馬胃蠅幼蟲長期寄生于動(dòng)物的消化系統(tǒng)內(nèi)，引起消化系統(tǒng)疾病。臨床上表現(xiàn)為胃潰瘍、胃腸壁穿孔、腸阻塞、腸扭轉(zhuǎn)、腹瀉，嚴(yán)重的會(huì)出現(xiàn)貧血，最后死亡[2]。馬胃蠅在分類學(xué)上屬于雙翅目(Diptera)，胃蠅科(Gasterophilidae)，胃蠅屬(Gasterophilus)。我國目前報(bào)道的馬胃蠅有7種，包括腸胃蠅(G.intestinalis)、鼻胃蠅(G.nasalis)、黑角胃蠅(G.nigricornis)、裸節(jié)胃蠅(G.imermis)、紅尾胃蠅(G.haemorrhoidalis)、黑腹胃蠅(G.pecorum)和Gasterophilusflavipes[3-5]。除了上述幾種，全世界流行的胃蠅還有扁腹胃蠅(G.lativentris)、南方胃蠅(G.meridionalis)和三列棘胃蠅(G.ternicinctus)[3]。

馬胃蠅線粒體基因在研究馬胃蠅分類和種屬鑒定上應(yīng)用越來越廣泛。馬胃蠅線粒體基因大小一般在14～20 kDa,是閉合雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，線粒體基因組上的多數(shù)基因在J鏈上編碼，少數(shù)基因在N鏈上編碼。其中穩(wěn)定的包含有13個(gè)編碼蛋白，細(xì)胞色素氧化酶亞基(COXⅡ)是13個(gè)編碼基因中的一員。還包括22個(gè)tRNA 基因、2個(gè)rRNA基因(16S rRNA和12S rRNA)[6]。16S核糖體rRNA簡稱16S rRNA，是原核生物的核糖體中30S亞基的組成部分。

近年來有學(xué)者對伊犁馬、普氏野馬胃蠅蛆病進(jìn)行了報(bào)道，對于蒙古馬馬胃蠅的研究在國內(nèi)外還很少，對其病原形態(tài)和分子生物學(xué)還不太明確。因此，本試驗(yàn)選取了蒙古馬馬胃蠅幼蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)試驗(yàn)，并對蒙古馬馬胃蠅線粒體基因COXⅡ、16S rRNA進(jìn)行序列分析，為探討蒙古馬的馬胃蠅分子生物學(xué)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蒙古馬馬胃蠅幼蟲樣品采集 2019年1月在內(nèi)蒙古呼和浩特市四子王旗收集感染馬胃蠅的馬匹8匹，剖檢以后獲取馬胃蠅幼蟲。將蟲體置于平皿內(nèi)放于解剖鏡下觀察。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察 對蒙古馬馬胃蠅三齡幼蟲進(jìn)行掃描電鏡HITACHI S3400 SEM (Hitachi Corp.,Tokyo,Japan)、光學(xué)顯微鏡(Olympus Corp.,Tokyo,Japan)觀察。電鏡掃描標(biāo)本、光鏡樣本按照常規(guī)處理方法處理。

1.3 蟲體基因COXⅡ、16S rRNA的擴(kuò)增及分析 取馬胃蠅三齡幼蟲冷凍樣品約100 mg，通過干燥(60 ℃下干燥15 min)、液氮研磨,試劑盒法(Quantum Prep,AquaPure Genomic DNA Kit,Bio-Rad)提取總DNA。PCR 擴(kuò)增線粒體基因COXⅡ、16S rRNA目的基因。PCR引物的選擇參照文獻(xiàn)[7-8]設(shè)計(jì)的昆蟲線粒體COXⅡ、16S rRNA基因引物(表1)。

表1 線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基COXⅡ基因和16S rRNA 基因引物Table 1 Primers for mitochondrial cytochrome oxidase subunit (COXⅡ) gene and 16S rRNA gene

用Clustal W軟件進(jìn)行多序列比對和分析[9]。利用MEGA 6.0軟件對馬胃蠅COXⅡ基因、16S rRNA基因與GenBank數(shù)據(jù)庫中胃蠅屬的其他種類同源序列進(jìn)行比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 解剖鏡觀察到一齡、二齡、三齡蒙古馬馬胃蠅幼蟲呈深紅色，頭部尖，尾部較鈍(圖1)。一齡幼蟲約長7.8 mm，寬3.2 mm。二齡幼蟲長約長12.4 mm，寬5. 7 mm。三齡幼蟲約長20.5 mm，寬7.1 mm。所有的幼蟲由12個(gè)體節(jié)組成(1個(gè)頭節(jié)，3個(gè)胸節(jié)，8個(gè)腹節(jié))，1、2體節(jié)各有1排棘刺，每排大約有35～42個(gè)棘刺。從第3節(jié)開始棘刺呈雙排，外排棘刺大于內(nèi)排棘刺。第6、7、8體節(jié)棘刺大而密集，每排大約有60～75個(gè)棘刺。從第1體節(jié)直至第8體節(jié)，沒有中斷。第9體節(jié)幾乎沒有棘刺(圖1A)。一齡幼蟲和二齡幼蟲蟲體領(lǐng)部棘刺，偽頭小齒,體節(jié)的棘刺，底部寬、刺尖細(xì)；三齡幼蟲蟲體領(lǐng)部棘刺，偽頭小齒，體節(jié)的棘刺，尖部變得更細(xì)，刺的結(jié)構(gòu)刀狀刺底部較寬，刺尖部窄(圖1B、1C)。

圖1 蒙古馬馬胃蠅幼蟲形態(tài)Fig.1 Morphology of Mongolian horse Gasterophilus sp. larvaeA:馬胃蠅一齡、二齡、三齡幼蟲背部解剖鏡圖(40×)； B:三齡幼蟲頭部光鏡圖(40×)； C：三齡幼蟲頭部電鏡圖； D：三齡幼蟲后氣門板光鏡圖(40×)。 mh：口溝； pas：乳突狀感受器； oc：口脊骨; ns：頸部棘刺； dsp：偽頭小齒； so：后氣門板上氣門孔裂縫A:Anatomical mirror image of the back of the first,second and third instar larva(40×); B:Light micrographs of a third instar larvae of Mongolian horse Gasterophilus sp.(40×); C:Scanning electron micrographs of a third instar larvae of Mongolian horse Gasterophilus sp.； D:Light micrographs of the posterior spiracular discs in a third instar larvae of Mongolian horse Gasterophilus sp.(40×).mh:Mouthhook; pas:Papillary sensilla; oc：Oral cristae; ns:Neck spines; dsp:Dorsal spines in the pseudocephalon; so：Spiracular openings

光鏡觀察一齡、二齡、三齡幼蟲的頭部，發(fā)現(xiàn)有1對口鉤、1對乳突狀感受器和1對口脊骨。尾部有1對后氣門板(表2)。

表2 蒙古馬馬胃蠅一、二、三齡幼蟲形態(tài)比較Table 2 Morphology of Mongolian horse Gasterophilus sp.larvae (μm)

三齡幼蟲口脊骨葉部頂端為平滑狀(圖1C)，掃描電鏡觀察頭部口鉤表面較光滑，無纖毛類結(jié)構(gòu)，口鉤的底部較粗大。在口鉤與感受器之間有偽頭小齒，底部較寬，刺尖部窄(圖1B、1C)。尾部有1對呈“D”形的后氣門板(圖1D)。蒙古馬馬胃蠅三齡幼蟲棘刺形態(tài)、背脊的連續(xù)性、口脊頁部形態(tài)、偽頭小刺的結(jié)構(gòu)與其他流行的胃蠅形態(tài)比較見表3。

表3 胃蠅屬三期幼蟲形態(tài)學(xué)比較Table 3 Morphological comparison of three-stage larvae of Gasterophilus sp.

2．2 蒙古馬馬胃蠅COXⅡ基因、16S rRNA擴(kuò)增 蒙古馬的馬胃蠅線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基(COXⅡ)基因核酸序列利用引物擴(kuò)增出 668 bp的條帶，16S rRNA基因核酸序列利用引物擴(kuò)增出482 bp的條帶。

本試驗(yàn)中，馬胃蠅線粒體COXⅡ基因和16S rRNA基因分別與GenBank中的5種胃蠅屬或與胃蠅屬相近的皮蠅屬、黃蠅屬、狂蠅屬的線粒體COXⅡ基因、16S rRNA基因，利用Clustar W對齊。線粒體COXⅡ基因分別與腸胃蠅Gasterophilusintestinalis(NC_029834)、黑腹胃蠅Gasterophiluspecorum(NC_029812)、皮蠅屬的皮蠅Hypodermalineatum(NC_013932)、黃蠅屬的Dermatobiahomini(NC_006378)和狂蠅屬的羊狂蠅Oestrusovis(KR820748)進(jìn)行比對。線粒體16S rRNA基因分別與胃蠅屬的腸胃蠅Gasterophilusintestinalis(KR230430)、胃蠅Gasterophilushamorrhoidalis(AF322439)、皮蠅屬的皮蠅Hypodermasinense(EU276096)、皮蠅Hypodermadiana(AF322438)、狂蠅屬的Cephenemyiastimulator進(jìn)行比對。

比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蒙古馬馬胃蠅COXⅡ基因?qū)R以后400個(gè)位點(diǎn)中，A、T、C、G的平均含量分別為33.33%、35.57%、18.11%和13.00%。A+T含量偏高，為68.9%。A+T含量在第3位點(diǎn)最高，達(dá)到78.60%，具有偏向性。核苷酸序列堿基保守位點(diǎn)152個(gè)、變異位點(diǎn)516個(gè)、簡約信息位點(diǎn)131個(gè)、自裔位點(diǎn)385個(gè)。16S rRNA基因核酸序列對齊452 bp中，A、T、C、G的平均含量分別為34.54%、37.64%、10.73%和17.09%。A+T含量偏高，為72.38%。A+T含量在第3位點(diǎn)最高,達(dá)到71.70%，具有偏向性。核苷酸序列堿基保守位點(diǎn)198個(gè)、變異位點(diǎn)275個(gè)、簡約信息位點(diǎn)58個(gè)、自裔位點(diǎn)215個(gè)。

對于線粒體COXⅡ基因利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。整體轉(zhuǎn)換/顛換(TS/TV)(R=1.236)。最大似然法的進(jìn)化歷史基于GTR模型(General time reversible model)[9]。進(jìn)化樹最高的對數(shù)(Log likelihood)可能性為-3 222.676 0。分支附近和分類群連在一起顯示的是進(jìn)化樹的百分率。進(jìn)化樹分析包括6個(gè)核酸序列，核酸位置包括第1位點(diǎn)、第2位點(diǎn)、第3位點(diǎn)和非編碼區(qū),總共包括620個(gè)核酸位置，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖2 線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基(COXⅡ)基因利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Molecular phylogenetic analysis of COXⅡ gene by maximum likelihood method

對于16S rRNA基因，利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。整體轉(zhuǎn)換/顛換(TS/TV)(R=6.205)。最大似然法的進(jìn)化歷史基于GTR模型。進(jìn)化樹最高的對數(shù)(Log likelihood)可能性為-1 529.139 3。分支附近和分類群連在一起顯示的是進(jìn)化樹的百分率。進(jìn)化樹分析包括6個(gè)核酸序列，核酸位置包括第1位點(diǎn)、第2位點(diǎn)、第3位點(diǎn)和非編碼區(qū)，總共包括452個(gè)核酸位置，進(jìn)化樹利用MEGA 6.0軟件設(shè)計(jì)。

圖3 16S Ribosomal RNA基因利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Molecular phylogenetic analysis of 16S rRNA gene by maximum likelihood method

線粒體COXⅡ基因使用聚類分析發(fā)現(xiàn)，腸胃蠅和黑腹胃蠅首先聚在一起后與人皮蠅聚在一起，然后與紋皮蠅、羊狂蠅聚在一起，最后與本試驗(yàn)的蒙古馬馬胃蠅聚集在一起。蒙古馬馬胃蠅與之前報(bào)道過的腸胃蠅、黑腹胃蠅、人皮蠅、紋皮蠅、羊狂蠅相比在不同的進(jìn)化樹分支上。線粒體16S rRNA基因使用聚類分析發(fā)現(xiàn)，腸胃蠅Gasterophilusintestinalis、紅尾胃蠅Gasterophilushamorrhoidalis、皮蠅屬的Hypodermadiana先聚在一起，狂蠅屬的Cephenemyiastimulator和皮蠅屬的Hypodermasinense先聚在一起，最后與本試驗(yàn)的蒙古馬馬胃蠅聚集在一起。蒙古馬馬胃蠅與之前報(bào)道過的腸胃蠅、黑腹胃蠅、人皮蠅、紋皮蠅、羊狂蠅在不同的進(jìn)化樹分支上。

3 討論

本試驗(yàn)描述了蒙古馬馬胃蠅幼蟲在頭部有1對乳突狀感受器，對蒙古馬馬胃蠅領(lǐng)部棘刺，體節(jié)上的棘刺以及偽頭小齒進(jìn)行了形態(tài)描述，這些特征豐富了Zumpt[11]在1965年對馬胃蠅形態(tài)的描述。2004年Sukontason等[10]認(rèn)為，前胸、中胸以及體節(jié)的棘刺的形態(tài)特征是非常重要的，他們的形態(tài)特征是醫(yī)療上寄生昆蟲種類的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。Sukontason等[10]還描述了能夠引起疾病的蠅類三齡幼蟲都具有刺底部較寬，刺尖部窄的特征。本試驗(yàn)結(jié)果(表3)顯示，蒙古馬馬胃蠅幼蟲棘刺的底部較寬，刺尖部窄，這種特征和黑腹胃蠅、腸胃蠅、鼻胃蠅、裸節(jié)胃蠅幼蟲的棘刺相似[10]。Zumpt[11]認(rèn)為，三齡幼蟲體節(jié)背脊上的刺是鑒定馬蠅種類最重要的特征。蒙古馬馬胃蠅的L1幼蟲和L2幼蟲底部寬、刺尖細(xì)，L3幼蟲的刺的尖部變得更細(xì)，刺的結(jié)構(gòu)刀狀，這與Dasilvaxavier等[12]在2016報(bào)道的雙翅目Sarcophagidae的幼蟲形態(tài)相似。

本試驗(yàn)觀察到的馬胃蠅的第1、2體節(jié)各有1排棘刺，從第3體節(jié)開始棘刺呈雙排，體節(jié)上的背部棘刺從第1體節(jié)直至到第8體節(jié)，沒有中斷，到第9體節(jié)幾乎沒有棘刺，而楊紅霞等[4]對獸胃蠅蛆、鼻胃蠅蛆、紅尾胃蠅蛆、腸胃蠅蛆4種胃蠅的研究指出：鼻胃蠅三期幼蟲形態(tài)特征為單排刺列,但在其胸部第1刺列為雙排刺；獸胃蠅(又稱黑腹胃蠅)背面刺帶直至第6腹節(jié)；腸胃蠅背面刺帶直至第7腹節(jié)，第2胸節(jié)的中間小刺明顯中斷；紅尾胃蠅背面刺帶直至第6腹節(jié)，在第2胸節(jié)中間棘刺中斷明顯，這些與本試驗(yàn)結(jié)果存在明顯差異。劉善輝[13]在研究中指出，黑腹胃蠅棘刺在背部第7、8體節(jié)中斷，第3體節(jié)棘刺呈單排。這與本試驗(yàn)結(jié)果也不相同(表3)。

本試驗(yàn)結(jié)果(表3)顯示，蒙古馬胃蠅三齡幼蟲口脊骨頁部形態(tài)、偽頭小刺結(jié)構(gòu)與黑腹胃蠅三齡幼蟲的形態(tài)特征相似。楊紅霞等[4]在研究中指出，紅尾胃蠅、鼻胃蠅與腸胃蠅這3種三齡幼蟲的口脊頁部的頂端部位與黑腹胃蠅的不同，呈鋸齒狀，而黑腹胃蠅口脊骨葉部頂端為平滑狀[4]，偽頭小齒是黑腹胃蠅三期幼蟲的特征性結(jié)構(gòu)。蒙古馬馬胃蠅幼蟲的口鉤，乳突狀感受器的形態(tài)與腦民塔拉[14]對于蒙古馬馬鼻蠅蛆的研究觀察到的形態(tài)相似，但是馬胃蠅后氣門板的形態(tài)與腦民塔拉觀察到的馬鼻狂蠅的后氣門板形態(tài)、大小不同。本試驗(yàn)中蒙古馬馬胃蠅三齡幼蟲的后氣孔氣門板上有6個(gè)開口，氣門肌肉使得氣門板上的開口形態(tài)垂直。2012年Mendon?a等[15]報(bào)道雙翅目金蠅屬麻蠅科Chrysomya.putoriaWiedemann在后氣門板上也有類似垂直的后氣門裂縫。馬胃蠅的種屬鑒定從形態(tài)上來區(qū)分比較困難、復(fù)雜[16]。因此需要分子學(xué)的相關(guān)知識進(jìn)行種屬鑒定。

馬胃蠅線粒體基因?qū)τ谌后w遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、系統(tǒng)分類學(xué)意義重大，線粒體基因可以作為標(biāo)記基因。2018年Zhang等[17]報(bào)道由于地理環(huán)境和生活環(huán)境的影響，中國與意大利報(bào)道的同種類的黑腹胃蠅、腸胃蠅、鼻胃蠅、黑角胃蠅的線粒體基因序列存在基因變異。劉善輝[13]對新疆普氏野馬馬胃蠅進(jìn)行線粒體基因分析得出在新疆主要有6種胃蠅：腸胃蠅、鼻胃蠅、黑腹胃蠅、黑角胃蠅、裸節(jié)胃蠅和紅尾胃蠅。2019年Li等[5]通過對新疆目前流行的胃蠅進(jìn)行線粒體基因研究又發(fā)現(xiàn)1種名為G.flavipes的胃蠅。

馬胃蠅呈全世界分布，內(nèi)蒙古自治區(qū)分布著120多萬匹蒙古馬,數(shù)量約占全國馬匹總數(shù)的1/5。本課題組從2015年以來研究馬蠅蛆病，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，馬胃蠅蛆病流行于內(nèi)蒙古自治區(qū)的呼倫貝爾、呼和浩特、赤峰、鄂爾多斯、錫林郭勒盟等地，發(fā)病率在8%～10%，病死率為80%左右。目前，許多胃蠅科昆蟲的線粒體基因報(bào)道還不全面[18]。在GenBank數(shù)據(jù)庫中能夠查到的不同種屬胃蠅的線粒體基因序列非常少。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，蒙古馬馬胃蠅的線粒體COXⅡ基因、16S rRNA基因與GenBank數(shù)據(jù)庫中狂蠅屬、黃蠅屬、胃蠅屬和皮蠅屬的昆蟲在系統(tǒng)發(fā)育樹中分開，有一定遺傳距離。

4 結(jié)論

形態(tài)學(xué)結(jié)果說明，蒙古馬馬胃蠅三齡幼蟲領(lǐng)部棘刺，體節(jié)上的棘刺形態(tài)，口脊骨頁部形態(tài)和偽頭小刺結(jié)構(gòu)與黑腹胃蠅三齡幼蟲的特征相似。分子生物學(xué)研究說明，蒙古馬馬胃蠅線粒體基因COXⅡ和16S rRNA與GenBank報(bào)道的胃蠅屬(腸胃蠅、黑腹胃蠅和紅尾胃蠅)都有一定的遺傳距離，且與黃蠅屬、皮蠅屬、狂蠅屬分開，單獨(dú)成1個(gè)分支。可知，蒙古馬馬胃蠅形態(tài)上與黑腹胃蠅相似，但是線粒體基因存在變異，可能代表馬胃蠅的一個(gè)新變種。