李順峰，劉麗娜，王安建，田廣瑞，許方方，魏書信

(河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002)

香菇(Lentinusedodes)是傘菌目口蘑科一種藥食兩用的真菌，其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，在民間素有“山珍”之稱。香菇不僅含有多種營養(yǎng)成分如多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素及礦物質(zhì)元素等，還含有雙鏈核糖核酸和水溶性鮮味物質(zhì)等[1-3]。香菇具有很好的免疫作用[4-6]，它可以提高機體免疫功能、延緩衰老、防癌抗癌、降血壓、降血脂、降膽固醇。另外，香菇還對糖尿病、肺結(jié)核、傳染性肝炎、神經(jīng)炎、消化不良、便秘等有治療作用。據(jù)中國食用菌協(xié)會[7]統(tǒng)計，2018年我國香菇產(chǎn)量為1 043.12萬t，其中，河南省香菇產(chǎn)量為288.86萬t，位列全國第一。目前，除了干制和鮮銷以外，有將近30%的香菇用于加工，而在加工過程中燙漂是必需的工序，會產(chǎn)生大量煮菇水(按年產(chǎn)量的30%計算，每年約有312萬t的香菇用于加工，每年產(chǎn)生800～1 400萬t的煮菇水)，這些煮菇水含有大量水溶性營養(yǎng)成分，如將這部分煮菇水直接進行排放，則污染環(huán)境，也不符合環(huán)保要求。如將這部分煮菇水直接進入污水處理系統(tǒng)，又會增加企業(yè)污水處理成本，增加企業(yè)負擔。若能將這些營養(yǎng)成分和呈味成分進行提取利用，做成保健食品、調(diào)味品等，不僅可以減少對環(huán)境的污染，而且減少企業(yè)污水處理成本，提高效益。

目前，對食用菌煮菇水的研究較少，僅有常樹人[8]將煮平菇水用于制作平菇母種培養(yǎng)基和俞智明[9]采用煮菇水進行醬油制作的研究。對食用菌煮菇水的營養(yǎng)成分和呈味成分構(gòu)成及其產(chǎn)品開發(fā)鮮見報道。5′-核苷酸是食用菌中的主要呈味物質(zhì)，主要由核酸分解而成。5′-核苷酸不僅本身具有鮮味，而且和左旋谷氨酸鈉(味精)合用具有顯著的協(xié)同增鮮作用[10-11]，對咸味、酸味、苦味、腥味、焦味有消殺作用[11-14]，還具有提高嬰兒免疫調(diào)節(jié)功能和記憶力的作用[15-16]。因此，以香菇煮菇水為研究對象，采用生物酶解技術(shù)提高其呈味物質(zhì)含量，增強風味，以期為香菇煮菇水的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原材料 香菇煮菇水由河南天中億龍食品有限公司提供，經(jīng)紗布過濾后備用。

1.1.2 試劑 5’-磷酸二酯酶(食品級，10 000 U/g，南寧龐博生物工程有限公司)；磷酸二氫鉀、高碘酸鈉、乙二醇、抗壞血酸、四水合鉬酸銨等均為國產(chǎn)分析純；5′-鳥苷酸(5′-GMP)、5′-腺苷酸(5′-AMP)、5′-肌苷酸(5′-IMP)[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]，5′-黃苷酸(5′-XMP)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；試驗用水為蒸餾水。

1.1.3 儀器與設備 FA2004C 型分析天平(上海越平科學儀器有限公司)、THZ-98AB 型恒溫振蕩器(上海一恒科學儀器有限公司)、UV-1800 型紫外可見分光光度計[島津儀器(蘇州)有限公司]、RV8V-C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀[艾卡(廣州)儀器設備有限公司]、DF-101S 型恒溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)、艾柯超純水機(成都康寧實驗專用純水設備廠)、H2050R 型臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)、Ultimate 3000高效液相色譜儀(戴安中國有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 5′-核苷酸含量的定量測定 5′-核苷酸質(zhì)量濃度參照陳鈞輝等[17]的方法測定。

1.2.1.1 磷標準曲線的繪制 取11支干試管，分別吸取0.1 g/L標準磷溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL，加蒸餾水補至2 mL，每管分別加入過碘酸試劑1 mL、30 %乙二醇0.4 mL、2 mol/L的甲胺0.5 mL，搖勻至45 ℃水浴中保溫45 min，各管加定磷試劑(17%硫酸∶2.5%鉬酸銨∶10%抗壞血酸∶水=1∶1∶1∶2)3.0 mL，繼續(xù)保溫20 min，取出冷卻至室溫，于660 nm 處測吸光度。以磷含量為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線，回歸方程為y=0.095 5x+0.004 1(R2=0.999 4)。

1.2.1.2 計算公式 樣品中每1 L樣液所含5′-核苷酸(g)的計算見公式(1)。

(1)

式中：C為5′-核苷酸質(zhì)量濃度(g/L)；C1為5′-核苷酸磷的質(zhì)量濃度(mg/L)；Mr為所測核苷酸相對分子質(zhì)量，如樣品系RNA水解液，則用4種核苷酸的平均相對分子質(zhì)量,為340；31為磷的相對原子質(zhì)量；n為樣液稀釋倍數(shù)。

1.2.2 5’-磷酸二酯酶酶解

1.2.2.1 單因素試驗 香菇煮菇水濃縮至原體積的1/2，分別在不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)、酶解溫度(50、55、60、65、70 ℃)、加酶量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)和酶解時間(1、2、3、4、5 h)的條件下進行酶解試驗，按照1.2.1方法進行5′-核苷酸質(zhì)量濃度的測定。

1.2.2.2 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，對加酶量、酶解時間、pH值和酶解溫度4個因素分別選取3個水平，對酶解工藝進行優(yōu)化。正交試驗設計見表1。

1.2.3 呈鮮味氨基酸和呈鮮味核苷酸含量的測定 呈鮮味氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)含量按照食品安全國家標準GB 5009.124—2016測定。

呈鮮味核苷酸含量測定：酶解前后香菇煮菇水經(jīng)4 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm濾膜后進行HPLC分析[1,18]。

表1 正交試驗因素與水平

1.2.4 等效鮮味含量(EUC)計算 EUC值常用來表征食品的鮮味程度[19]，具體指在每1 g或1 mL的食物中，以谷氨酸鈉(MSG)的量來表示呈鮮物質(zhì)的總量。

EUC值計算如公式(2)所示：

對于鄧強提出的上訴意見，經(jīng)查，廣東省紀委專案組對鄧強立案并采取“兩規(guī)”調(diào)查措施之前，省紀委已經(jīng)掌握其受賄犯罪線索，且鄧強在接受調(diào)查問話時，開始并沒有交代自己的犯罪事實，過了幾天才交代，故不構(gòu)成自首。另外，省紀委事前已掌握肇慶非法采砂及銷售有關(guān)問題線索，鄧強反映的情況對偵破有關(guān)案件沒有起到實質(zhì)性作用，因此，鄧強的行為也不構(gòu)成立功。

Y=Σaibi+1 218(Σaibi)(Σajbj)

(2)

式中：Y為EUC值(g/mL)；ai為呈鮮氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)的質(zhì)量濃度(g/mL)；aj為呈鮮核苷酸[5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)、5′-鳥苷一磷酸(5′-GMP)、5′-肌苷一磷酸(5′-IMP)和5′-黃苷一磷酸(5′-XMP)]的質(zhì)量濃度(g/mL)；bi為呈鮮味氨基酸相對MSG的鮮味程度值(谷氨酸為1，天冬氨酸為0.077)；bj為呈味核苷酸相對5′-IMP的值(5′-IMP=1、5′-GMP=2.3、5′-XMP=0.61、5′-AMP=0.18)；1 218為協(xié)同作用常數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均進行3次平行試驗，測定結(jié)果以平均值±標準差(SD)表示，數(shù)據(jù)分析與整理采用SPSS軟件和Excel軟件，采用Origin 9.6作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解單因素試驗

2.1.1 pH值對香菇煮菇水5′-核苷酸質(zhì)量濃度的影響 當加酶量、酶解時間、酶解溫度分別為0.2%、3 h、60 ℃時，在不同的pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)進行酶解，研究5’-磷酸二酯酶酶解對香菇煮菇水中5′-核苷酸質(zhì)量濃度的影響。結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，在試驗范圍內(nèi)，pH值由3.0升至5.0時，5′-核苷酸質(zhì)量濃度逐漸升高，在pH值5.0時，5′-核苷酸質(zhì)量濃度達到最大(3.19 g/L)，隨著pH值繼續(xù)增大，5′-核苷酸質(zhì)量濃度呈逐漸下降的趨勢，這可能是由于在適宜的pH值作用范圍內(nèi)，酶活性較高，能充分發(fā)揮酶的專一水解作用，故選擇pH值5.0作為比較適宜酶解的pH值條件。安晶晶等[20]在研究5’-磷酸二酯酶酶解香菇漿時發(fā)現(xiàn)，該酶在pH值4.0～5.0時，鮮味核苷酸產(chǎn)量最高，與本研究結(jié)果相似。

圖1 pH值對香菇煮菇水中5′-核苷酸質(zhì)量濃度的影響

2.1.2 酶解溫度對香菇煮菇水5′-核苷酸質(zhì)量濃度的影響 在加酶量0.2%、酶解時間3 h、pH值5.0的條件下，分別采用不同酶解溫度(50、55、60、65、70 ℃)進行酶解，結(jié)果見圖2。

圖2 酶解溫度對香菇煮菇水中5′-核苷酸質(zhì)量濃度的影響

由圖2可以看出，隨著酶解溫度的升高，5′-核苷酸質(zhì)量濃度呈先升高后下降的趨勢。在酶解溫度為55 ℃時，5′-核苷酸質(zhì)量濃度達到較高水平，當溫度繼續(xù)上升時，5′-核苷酸質(zhì)量濃度有降低趨勢。這是由于在較低溫度時，隨著溫度上升酶活性不斷增強，酶解破壁作用加強，但溫度超過最適溫度之后，隨著溫度的上升酶部分或全部失活[21-22]，因此，酶解溫度確定為55 ℃。

2.1.3 加酶量對香菇煮菇水中5′-核苷酸質(zhì)量濃度的影響 在酶解時間3 h、pH值5.0、酶解溫度55 ℃條件下，分別采用不同加酶量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)進行酶解，結(jié)果見圖3。

圖3 加酶量對香菇煮菇水中5′-核苷酸質(zhì)量濃度的影響

由圖3可以看出，當加酶量由0.1%增加到0.2%時，5′-核苷酸質(zhì)量濃度由2.68 g/L顯著升高至3.34 g/L，此后繼續(xù)增大加酶量，5′-核苷酸質(zhì)量濃度呈緩慢升高趨勢。隨著加酶量從0.2%升高至0.5%時，5′-核苷酸質(zhì)量濃度僅比加酶量為0.2%時增加了0.18 g/L，未達到顯著水平(P>0.05)。考慮后續(xù)工作和節(jié)約資源等綜合因素，選擇加酶量0.2%較為合適。

2.1.4 酶解時間對香菇煮菇水5′-核苷酸質(zhì)量濃度的影響 在加酶量0.2%、pH值5.0、酶解溫度55 ℃條件下，分別采用不同的酶解時間(1、2、3、4、5 h)進行酶解，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解時間對香菇煮菇水中5′-核苷酸質(zhì)量濃度的影響

從圖4可以看出，酶解時間在1～3 h，隨著酶解時間的增加，5′-核苷酸質(zhì)量濃度上升較快，酶解時間在3～5 h時，5′-核苷酸質(zhì)量濃度趨于平穩(wěn)而不再增加。可見，香菇煮菇水中的底物可在3 h內(nèi)與5’-磷酸二酯酶充分反應，生成較多的5′-核苷酸。之后，隨酶解時間的延長，5′-核苷酸質(zhì)量濃度不再增加[21-22]。因此，酶解時間確定為3 h。

2.2 酶解正交優(yōu)化試驗

以5′-核苷酸質(zhì)量濃度為評價指標，對香菇煮菇水中5′-核苷酸的5’-磷酸二酯酶酶解工藝進行優(yōu)化。正交試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗設計及結(jié)果

從表2中的R值可以看出，各因素對5′-核苷酸質(zhì)量濃度影響大小依次為A>D>B>C，即影響5′-核苷酸質(zhì)量濃度的最主要因素是酶解pH值，其他依次為酶解時間、酶解溫度和加酶量。從表2中的k值可以看出，5’-磷酸二酯酶酶解提高煮菇水中5′-核苷酸質(zhì)量濃度的最佳工藝組合為A2B1C3D1，即酶解pH值5.0、酶解溫度50 ℃、加酶量0.3%、酶解時間2 h。經(jīng)試驗驗證，在此條件下5′-核苷酸質(zhì)量濃度為3.80±0.07 g/L，與表2第5組無顯著差異且酶解溫度更低。

2.3 5’-磷酸二酯酶酶解對香菇煮菇水鮮味的影響

5′-核苷酸是5’-磷酸二酯酶對核糖核酸(RNA)的分解產(chǎn)物，包括5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)、5′-胞嘧啶一磷酸(5′-CMP)、5′-鳥苷一磷酸(5′-GMP)、5′-肌苷一磷酸(5′-IMP)、5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和5′-黃苷一磷酸(5′-XMP)，其中，5′-AMP、5′-GMP、5′-IMP和5′-XMP被認為是呈鮮味的核苷酸。酶解前后的香菇煮菇水中呈鮮味核苷酸、氨基酸質(zhì)量濃度測定結(jié)果見表3。由表3可以看出，5’-磷酸二酯酶酶解可顯著提高香菇煮菇水呈鮮味核苷酸中5′-AMP和5′-GMP質(zhì)量濃度(P<0.05)，而對5′-IMP和5′-XMP質(zhì)量濃度無顯著影響(P>0.05)，且酶解對呈鮮味氨基酸質(zhì)量濃度無顯著影響(P>0.05)。

呈鮮味氨基酸與呈鮮味核苷酸存在的協(xié)同效應，可以增加蘑菇的鮮味。MAU[23]將蘑菇中呈鮮成分的EUC分為4級，一級>1 000% (>10 g/g)，二級為100%～1 000%(1～10 g/g)，三級為10%～100%(0.1～1 g/g)，四級<10%(<0.1 g/g)。從表3可以看出，按照MAU對EUC的分級標準，酶解前后香菇煮菇水的EUC均為三級，但EUC從酶解前的273.71 g/L顯著升高至436.27 g/L，酶解后EUC約為酶解前的1.59倍。

表3 5’-磷酸二酯酶酶解對香菇煮菇水鮮味成分的影響

3 結(jié)論與討論

鮮味作為五大基本味之一，對于食品整體味道及人們對食品的評價至關(guān)重要。在5′-核苷酸中，5′-IMP、5′-GMP和5′-AMP對食品鮮味的貢獻最為突出。其中，5′-GMP主要存在于食用菌中，以香菇為例，香菇的鮮味主要來源于呈味氨基酸(以谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、絲氨酸為主)和核苷酸(5′-GMP為主要的呈味核苷酸)。鮮香菇經(jīng)干制加工后，其中的5′-GMP質(zhì)量濃度可提升至鮮香菇的3倍，達到1.56 mg/g，可見高溫處理可迅速提升鮮味物質(zhì)的含量[11]。香菇煮菇水是香菇經(jīng)高溫熱燙之后得到的溶液，其中的蛋白質(zhì)會分解轉(zhuǎn)化為小分子的多肽和游離氨基酸，核酸會轉(zhuǎn)化為小分子的5′-核苷酸，鮮味得到大幅度的呈現(xiàn)。采用生物酶法提取制備香菇呈味物質(zhì)是近年來的研究熱點，先后報道有采用纖維素酶、菠蘿蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶等酶解制備香菇呈味物質(zhì)[11, 24-26]。本研究表明，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化，5’-磷酸二酯酶酶解香菇煮菇水的最佳工藝條件為酶解pH值5.0、酶解溫度50 ℃、加酶量0.3%、酶解時間2 h，在此條件下5′-核苷酸質(zhì)量濃度3.80 g/L。5’-磷酸二酯酶酶解可顯著提高香菇煮菇水中5′-AMP和5′-GMP質(zhì)量濃度，而對5′-IMP、5′-XMP和呈鮮味氨基酸質(zhì)量濃度無顯著影響，并可顯著增強EUC約1.5倍。這一結(jié)果與安晶晶等[20]的研究相一致，其在研究5’-磷酸二酯酶對香菇風味基料中鮮味核苷酸酶解增量的影響時，發(fā)現(xiàn)經(jīng)5’-磷酸二酯酶酶解香菇基料的鮮味核苷酸產(chǎn)量提高了3倍。因此，采用5’-磷酸二酯酶酶解香菇煮菇水可顯著增強煮菇水的EUC值，呈鮮效果顯著，可為香菇煮菇水的高效利用和加工提供技術(shù)參考。