李 川，黃 璐，喬江方，張美微，張盼盼，牛 軍，劉京寶，王淑鳳

(1.河南省農業(yè)科學院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002； 2.禹州市農業(yè)農村局，河南 禹州 452570)

溫度是影響作物生長發(fā)育、產量品質的關鍵因素。近年來隨著全球氣候變暖，短期異常高溫頻發(fā)[1-3]。玉米是我國重要的糧食、飼料、工業(yè)三元作物。溫度對玉米抽雄吐絲及授粉過程的影響較大[4]，進而嚴重影響玉米產量。因此，研究玉米對花粒期高溫的響應機制具有重要的現實意義。玉米吐絲授粉的最佳日平均溫度為25～28 ℃，空氣相對濕度70%[5]。日最高溫度超過35 ℃，田間玉米授粉過程將受到阻礙，花粉在高于39 ℃時會失活，授粉過程不能順利完成從而造成減產甚至絕收[6]。高溫脅迫除了影響花粉活性和授粉過程外，還可以影響雌穗的發(fā)育，例如雌穗分化異常、延緩吐絲，最終導致雌雄穗發(fā)育時期不協調，玉米授粉結實率下降[7-8]?；Ｆ谌掌骄鶞囟冗^高可以導致玉米葉片氣孔關閉[9]、破壞玉米葉片葉綠體結構[10]、降低玉米植株中蛋白酶活性，這些最終導致玉米植株光合作用被大大削弱[11-12]?；Ｆ谌臻g高溫會提高玉米植株生育過程中多種生理生化反應速率[13-14]，縮短生育期，減少籽粒干物質積累量[15]，減少籽粒庫容，導致玉米籽粒敗育率增加[16]，最終導致玉米產量下降[17]。另外，玉米花粒期高溫脅迫還能夠改變內源激素的含量及種類[18]，而玉米果穗的灌漿由多種內源激素共同調控。其中，脫落酸(ABA )在植株受到高溫脅迫時表達水平提高，調控下游高溫誘導相關基因的表達水平，減少高溫對葉綠體結構的破壞，提高植株的耐熱性。玉米灌漿速率受多種內源激素的共同調控，其中，赤霉素(GA)可以提高植物結實率；生長素(IAA)可以促進細胞分裂、植株生長。玉米花粒期高溫脅迫還可以改變植株內多種酶活性，降低玉米品質[19]。光合作用的中間產物蔗糖運輸至玉米籽粒后，由束縛態(tài)淀粉酶、可溶性淀粉合成酶、蔗糖合成酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶等不同種類的酶蛋白催化形成淀粉。花粒期高溫脅迫降低淀粉合成酶的活性，最終造成籽粒中合成的淀粉減少[20]。

目前，關于花粒期高溫脅迫對玉米的危害研究主要集中于玉米植株生理生化過程、產量、品質等方面[20-22]，而在分子水平上的研究報道較少，主要是從抗逆基因[23]、激素所調控的高溫脅迫相關下游基因[24]等單個或少數幾個基因表達水平上分析高溫脅迫對玉米的影響。為此，利用高通量轉錄組測序手段和廣泛靶向代謝組測序手段全面闡述玉米新品種鄭單309花粒期響應高溫脅迫的分子機制，明確高溫脅迫下的差異表達基因、差異表達代謝物，并對差異表達基因和差異表達代謝物代謝通路進行分析，從而闡明鄭單309響應高溫脅迫的分子機制。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料為玉米新品種鄭單309，由河南省農業(yè)科學院糧食作物研究所選育，于2018年通過河南省作物品種審定委員會審定(豫審玉20180038)。該品種耐高溫熱害，抗青枯病和穗腐病，穩(wěn)產性好，適應范圍廣。

1.2 高溫處理

試驗于2018年6月12日在河南省農業(yè)科學院現代農業(yè)科技試驗示范基地進行。在玉米第9片葉展開時(大喇叭口期)采用生長箱進行田間增溫處理，生長箱長20 m、寬15 m、高4 m。生長箱四周用透光率較好(95%)的樹脂薄膜覆蓋，頂部密封90%，留出10%的空隙便于田間氣體交換。生長箱下部樹脂薄膜可以拆移，以便生長箱內溫度過高時可以快速降溫。在生長箱四周和中間懸掛溫度計，每天早、中、晚觀察記錄生長箱內溫度變化，控制生長箱內氣溫平均高于外界田間氣溫4～5 ℃。17:00—8:00揭開樹脂膜。生長箱內光照強度和相對濕度等生長條件基本與外界生長條件一致。玉米植株抽雄散粉后即高溫脅迫處理7 d進行第一次取樣，高溫處理14 d進行第二次取樣，之后拆除生長箱不再進行高溫處理。

1.3 取樣

高溫處理7 d 進行第一次取樣：選5株長勢一致的玉米植株，取穗位葉混合在一起，重復3次，分別命名為HT鄭單309-1、HT鄭單309-2、HT鄭單309-3；不進行高溫處理的對照材料分別命名為CK鄭單309-1、CK鄭單309-2、CK鄭單309-3。高溫處理14 d 進行第二次取樣：另選取5株長勢一致的玉米植株，取穗位葉混合在一起，分別命名為HT鄭單309-4、HT鄭單309-5、HT鄭單309-6；對照材料分別命名為CK鄭單309-4、CK鄭單309-5、CK鄭單309-6。葉片樣品立即放于液氮中冷凍，然后于-70 ℃超低溫冰箱保存。

1.4 RNA提取及轉錄組測序

玉米葉片總RNA用試劑盒RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen，Germany)提取。用瓊脂糖凝膠電泳及生物芯片分析檢測儀Agilent Bioanalyzer 2100 system(Aglilent Technologies, USA)檢測提取RNA 的完整性。RNA濃度用Nanodrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer(Nanodrop Technologie, USA)測定。由北京百邁客生物科技有限公司構建cDNA文庫, 轉錄組高通量測序用Illumina HiSeqTM2500測序儀完成。

1.5 高通量測序結果分析及基因功能注釋

高通量測序后的原始序列通過去除接頭序列、低質量序列、多N序列及長度過短序列等一系列分析后獲得干凈序列。最終計算出測序序列的堿基錯誤率及GC堿基含量。利用Hisat2 序列比對軟件采用BWT算法將所得干凈序列與已經公布的玉米自交系B73序列(https://www.maizegdb.org/)進行比對，查找基因信息。利用RSeQC-2.6.3軟件對與上述自交系B73序列比對所得基因進行測序飽和度、基因覆蓋度及冗余序列分析，參照Nr 蛋白質序列、 Nt 核酸序列、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KO、GO數據庫進行高通量測序結果基因的功能注釋。

1.6 基因表達量統計及篩選差異表達基因

基因表達具有時間和空間特異性，本試驗中高溫脅迫處理不同時間段材料中檢測到的基因表達水平存在顯著差異的基因命名為差異表達基因(Differentially expressed genes，DEGs)。差異表達基因是鄭單309響應高溫脅迫的重要基因。轉錄組測序所得所有轉錄本用FPKM(Fragment per kilobase of transcript per million fragment mapped)值表示。依據基因表達量及edgeR軟件計算獲得差異表達基因，篩選標準P<0.05。顯著差異表達基因篩選標準為錯誤發(fā)現率FDR<0.05 ，基因表達量變化倍數取2為底數對數值的絕對值|log2FC|≥2。參照GO數據庫，將差異表達基因按照參與的生物學過程(Biological process,BP)、細胞組分(Cellular component, CC)、分子功能(Molecular function, MF)進行基因功能注釋分類。參照KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數據庫分析差異表達基因參與的代謝途經。

1.7 代謝組學測序分析

代謝組學測序分析材料同轉錄組測序材料，采用廣泛靶向技術進行分析，由北京百邁客生物科技有限公司完成。鄭單309葉片樣本粉碎后用微孔濾膜過濾。葉片中代謝物用液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS)分析儀檢測，并根據檢測所獲得的二級譜信息定性分析代謝物種類。之后對鄭單309葉片樣本代謝物進行主成分分析(Principal component analysis，PCA)，獲知樣本之間總體代謝差異和組內樣本之間的變異度。利用正交偏最小二乘法-判別分析統計方法(Orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis,OPLS-DA)過濾掉代謝組測序結果中與分類變量不相關的正交變量，并對非正交變量和正交變量進行分析，從而獲得更加可靠的代謝物組間差異。差異代謝物篩選標準為代謝物表達量變化倍數取2為底數對數值的絕對值|log2FC|≥2以及OPLS-DA模型的變異度值VIP>1。利用R軟件(www.r-project.org)對所檢測到的同一代謝物在不同鄭單309葉片樣本間的積累模式進行聚類分析(Hierarchical cluster analysis, HCA)。通過查找KEGG數據庫對檢測到的差異代謝物進行功能注釋、代謝通路等分析。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫與正常生長條件下鄭單309轉錄組測序序列分析

經分析(表1)發(fā)現，CK鄭單309-1獲得了71 543 704條干凈序列，GC含量為59.84%，沒有AT/GC分離現象，堿基識別精度99.9% 以上序列即Q30堿基質量值達92.68%。與參照B73基因組比對發(fā)現，84.33%的序列配對成功，獲得60 332 708條配對序列。HT鄭單309-1獲得了56 355 684條干凈序列，GC含量為60.42%，沒有AT/GC分離現象，Q30堿基質量值達92.68%。與參照B73基因組比對發(fā)現，82.76% 的序列配對成功，獲得46 641 566條配對序列。 CK鄭單309-2獲得了58 280 642 條干凈序列，與參照B73基因組比對81.81%的序列配對成功。HT鄭單309-2獲得了62 827 976條干凈序列，與參照B73基因組比對84.96%的序列配對成功。CK鄭單309-3獲得了69 146 446 條干凈序列，與參照B73基因組比對82.60%的序列配對成功。HT鄭單309-3獲得了58 844 390條干凈序列，與參照B73基因組比對84.53% 的序列配對成功。

表1 高溫脅迫與正常生長條件下鄭單309轉錄組測序數據統計分析

CK鄭單309-4獲得了57 394 260 條干凈序列，與參照B73基因組比對74.62%的序列配對成功。HT鄭單309-4獲得了51 080 622條干凈序列，與參照B73基因組比對77.34% 的序列配對成功。CK鄭單309-5獲得了56 849 972 條干凈序列，與參照B73基因組比對79.38%的序列配對成功。HT鄭單309-5獲得了71 288 420條干凈序列，與參照B73基因組比對79.77% 的序列配對成功。CK鄭單309-6獲得了71 324 428 條干凈序列，與參照B73基因組比對76.37%的序列配對成功。HT鄭單309-6獲得了68 719 302條干凈序列，與參照B73基因組比對84.51% 的序列配對成功。

2.2 鄭單309高溫脅迫條件下的差異表達基因統計

差異表達基因根據表達水平分為上調表達基因(Up-regulated gene)和下調表達基因(Down-regulated gene)。圖1所示，鄭單309高溫脅迫7 d與正常生長條件材料對比組(G0)共檢測到515個差異表達基因，其中75個為上調表達基因，440個為下調表達基因。鄭單309高溫脅迫14 d與正常生長條件材料對比組(G1)共檢測到506個差異表達基因，其中114個為上調表達基因，392個為下調表達基因。鄭單309高溫脅迫7 d 與高溫脅迫14 d材料對比組(G2)共檢測到2 050個差異表達基因，其中790個為上調表達基因，1 260個為下調表達基因。G0與G1中有7個基因在高溫脅迫7、14 d葉片中均較正常材料差異表達。這7個共同差異表達基因分別為Zea_mays_newGene_28308，在高溫脅迫7 d葉片中上調表達，在高溫脅迫14 d葉片中下調表達，屬于新基因，功能未知； Zm00001d019114，在高溫脅迫7、14 d葉片中均上調表達，編碼叉狀蛋白抑制因子，在KOG數據庫中分類屬于RNA 加工及修飾蛋白； Zm00001d021497，在高溫脅迫7、14 d葉片中均下調表達，編碼絲切蛋白/原肌球蛋白類肌動蛋白結合蛋白，在KOG數據庫中分類屬于細胞骨架； Zm00001d025043，在高溫脅迫7 d葉片中上調表達，在高溫脅迫14 d葉片中下調表達，編碼ABC轉運蛋白，在KOG數據庫中分類屬于次級代謝物生物合成；Zm00001d022453，在高溫脅迫7、14 d葉片中均上調表達，編碼陽離子過氧化酶1，在KOG數據庫分類中屬于過氧化物；Zm00001d025319，在高溫脅迫7、14 d葉片中均上調表達，編碼泛素-蛋白連接酶1，在KOG數據庫中分類屬于翻譯后修飾；Zm00001d038806，在高溫脅迫7、14 d葉片中均下調表達，編碼熱激蛋白101，在KOG數據庫中分類屬于翻譯后修飾。G0與G2中檢測到58個共同差異表達基因。G1與G2中檢測到115個共同差異表達基因。上述差異表達基因中的Zm00001d022453、Zm00001d025319、Zm00001d038806是G0、G1、G2中的共同差異表達基因。

G0:鄭單309高溫脅迫7 d與正常生長條件材料的差異表達基因數目;G1:鄭單309高溫脅迫14 d與正常生長條件材料的差異表達基因數目;G2：鄭單309高溫脅迫7 d與高溫脅迫14 d材料的差異表達基因數目

2.3 鄭單309高溫脅迫下差異表達基因的功能分析及分類

參照GO數據庫，鄭單309高溫脅迫7 d 與正常生長條件材料對比組中差異表達基因主要富集于中和作用、生長發(fā)育、多有機體過程、生殖過程、繁育、細胞組分、生物調控、細胞進程，細胞連接、共質體、細胞外區(qū)、細胞外區(qū)成分，催化活性、分子功能活性、抗氧化活性等。鄭單309高溫脅迫14 d 與正常生長條件材料對比組中差異表達基因主要富集于節(jié)奏過程、中和作用、多有機體過程、定位、刺激反應、單有機體過程、代謝過程，細胞膜、細胞膜成分、細胞外區(qū)、細胞外區(qū)成分，結合作用、催化活性、電子載體活性、抗氧化活性、養(yǎng)分儲備活性等。鄭單309高溫脅迫7 d 與14 d對比組中差異表達基因主要富集于單有機體過程、刺激反應、定位、多有機體過程、信號傳導、中和作用、節(jié)奏過程，細胞膜、細胞膜成分、細胞外區(qū)、核酸細胞成分，轉運蛋白活性、核酸結合轉錄因子活性、電子載體活性、信號轉導活性，分子轉換活性、抗氧化活性等。

依據KOG/COG數據庫，對差異表達基因進行同源分類。鄭單309高溫脅迫7 d 與正常生長條件材料對比組中差異表達基因主要分布于碳水化合物的運輸和代謝、信號轉導系統、細胞壁/細胞膜/被膜生物合成、脂質運輸及代謝、通用功能預測系統5個主要(富集到的差異表達基因個數≥10個)分類，以及能量產生及轉換、細胞循環(huán)控制/細胞分裂/染色體分區(qū)、氨基酸轉運及代謝、輔酶轉運及代謝、轉錄、復制/重組/修復、細胞運動性、翻譯后修飾/蛋白質中轉/分子伴侶、無機離子運輸及代謝、次級代謝物生物合成/運輸/分解代謝、防衛(wèi)機制、細胞骨架、未知功能13個次要(富集到的差異表達基因個數<10個)分類。鄭單309高溫脅迫14 d 與正常生長條件材料對比組中差異表達基因主要分布于氨基酸轉運及代謝、碳水化合物的運輸和代謝、細胞壁/細胞膜/被膜生物合成、次級代謝物生物合成/運輸/分解代謝、通用功能預測系統、信號轉導系統、防衛(wèi)系統7個主要(富集到的差異表達基因個數≥10)分類，以及能量產生及轉換、細胞循環(huán)控制/細胞分裂/染色體分區(qū)、核苷酸轉運及代謝、輔酶轉運及代謝、脂質運輸及代謝、翻譯/核糖體結構及生物合成、轉錄、復制/重組/修復、細胞運動性、翻譯后修飾/蛋白質中轉/分子伴侶、無機離子運輸及代謝、胞內運輸/分泌/膜泡運輸、細胞外結構、未知功能14個次要(富集到的差異表達基因個數<10)分類。鄭單309高溫脅迫7 d 與14 d對比組中差異表達基因遠遠多于鄭單309高溫脅迫7 d 與正常生長條件材料對比組及鄭單309高溫脅迫14 d 與正常生長條件材料對比組，差異表達基因主要分布于能量產生及轉換、氨基酸轉運及代謝、核苷酸轉運及代謝、碳水化合物的運輸和代謝、輔酶轉運及代謝、脂質運輸及代謝、翻譯/核糖體結構及生物合成、轉錄、細胞壁/細胞膜/被膜生物合成、翻譯后修飾/蛋白質中轉/分子伴侶蛋白、無機離子運輸及代謝、次級代謝物生物合成/運輸/分解代謝、通用功能預測系統、信號轉導系統、防衛(wèi)系統15個主要分類，以及RNA加工及修飾、染色質結構及動態(tài)、細胞循環(huán)控制/細胞分裂/染色體分區(qū)、復制/重組/修復、細胞運動性、細胞外結構、細胞骨架、未知功能8個次要分類。

對差異表達基因注釋參與的代謝途徑(Pathway)進行分析能進一步了解基因功能。鄭單309高溫脅迫7 d 與正常生長條件材料對比組中差異表達基因主要注釋到植物-病原體相互作用、戊糖及葡萄糖醛酸酯相互轉換、淀粉和蔗糖代謝、木質素生物合成、植物激素信號傳導、氧化磷酸化6個代謝途經中。鄭單309高溫脅迫14 d 與正常生長條件材料對比組中差異表達基因主要注釋到淀粉和蔗糖代謝、木質素生物合成、苯基丙氨酸代謝、植物-病原體相互作用、碳代謝、氨基糖及核苷酸糖代謝、氨酰tRNA生物合成7個代謝途經中。鄭單309高溫脅迫7 d 與14 d對比組中差異表達基因較多，主要注釋到內質網內蛋白質加工、氨基酸生物合成、碳代謝、淀粉及蔗糖代謝、胞吞作用、過氧化酶體、植物激素信號傳導、剪接體、DNA復制、核糖體、錯配修補、泛素介導的蛋白質水解作用、RNA降解、RNA運輸、真核細胞核糖體生物合成、氮代謝、硫代謝、半胱氨酸及蛋氨酸代謝、木質素生物合成、谷胱甘肽代謝、脂肪酸降解、磷酸戊糖途徑、脂肪酸生物合成、果糖及甘露糖代謝、脂肪酸延長、醚酯代謝、丁酸甲酯代謝、嘌呤代謝、氰基氨基酸代謝、嘧啶代謝、丙酮酸代謝、光合作用、苯基丙氨酸代謝、2-氧化磷酸代謝、甘油磷脂代謝、脂肪酸代謝、類胡蘿卜素生物合成、半乳糖代謝、萜類化合物主鏈生物合成、乙醛酸及脫酸產物代謝、光合器官中碳固定、糖酵解/糖異生作用、抗壞血酸代謝、纈氨酸亮氨酸及異亮氨酸降解、氨基糖及核苷酸糖代謝、丙氨酸天冬氨酸及谷氨酸代謝、甘氨酸絲氨酸及蘇氨酸代謝、植物晝夜節(jié)奏、植物-病原體互作20個代謝途經中。

2.4 鄭單309高溫脅迫下的差異代謝物統計

對不同高溫脅迫處理鄭單309代謝組學進行分析，共檢測到654個代謝物(圖2)。鄭單309高溫脅迫7 d 與正常生長條件材料對比組G0中檢測到40個差異表達代謝物，其中8個上調表達，32個下調表達。鄭單309高溫脅迫14 d 與正常生長條件材料對比組G1中檢測到40個差異表達代謝物，其中4個上調表達，36個下調表達。鄭單309高溫脅迫7 d 與14 d對比組G2中檢測到46個差異表達代謝物，其中17個為上調表達，29個下調表達。G0與G1對比組中檢測到17個共同差異表達代謝物均在高溫脅迫7 d葉片、高溫脅迫14 d葉片中顯著表達。G0與G2對比組中檢測到4個共同差異表達代謝物顯著表達，分別為喜樹堿，上調表達；乙?；嚢彼酧-己糖苷，上調表達；反式己二烯二酸，上調表達；對苯二甲醛，上調表達。G1與G2對比組中檢測到7個共同差異表達代謝物顯著表達，分別為髓鞘相關糖蛋白異構體1，下調表達；膽甾醇，下調表達；山奈酚，下調表達；綠原酸甲酯，下調表達；乙酰氧乙酸，下調表達；N，N-二甲基甲酰胺，下調表達M；對苯二甲酸，下調表達。尤其值得注意的是，代謝物對苯二甲酸在GO、G1、G2對比組中表達量均達到差異水平，只是表達模式不同。

G0:鄭單309高溫脅迫7 d與正常生長條件材料的差異表達代謝物數目;G1:鄭單309高溫脅迫14 d與正常生長條件材料的差異表達代謝物數目;G2：鄭單309高溫脅迫7 d與高溫脅迫14 d材料的差異表達代謝物數目

2.5 鄭單309高溫脅迫下差異代謝物的功能分類

由表2可知，鄭單309高溫脅迫7 d 與正常生長條件材料對比組中的40個差異表達代謝物主要富集于精氨酸及脯氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸及蘇氨酸代謝，次生代謝產物生物合成，組氨酸代謝，類黃酮生物合成，ABC轉運蛋白，嘧啶代謝，氨酰tRNA生物合成，碳青霉烯生物合成，氨基酸生物合成，黃酮和黃酮醇生物合成等KEGG通路。

由表3可知，鄭單309高溫脅迫14 d 與正常生長條件材料對比組中的40個差異表達代謝物主要富集于精氨酸及脯氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸及蘇氨酸代謝，谷胱甘肽代謝，次生代謝產物生物合成，類黃酮生物合成，黃酮和黃酮醇生物合成，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化，ABC轉運蛋白，煙酸及煙酰胺代謝，半乳糖代謝，色氨酸代謝，類固醇生物合成，嘌呤代謝，賴氨酸降解，萜類化合物、哌啶及吡啶生物堿生物合成等KEGG通路。

表2 高溫脅迫處理7 d與正常條件下鄭單309差異表達代謝物KEGG注釋結果

續(xù)表2 高溫脅迫處理7 d與正常條件下鄭單309差異表達代謝物KEGG注釋結果

表3 高溫脅迫處理14 d與正常條件下鄭單309差異表達代謝物KEGG注釋結果

續(xù)表3 高溫脅迫處理14 d與正常條件下鄭單309差異表達代謝物KEGG注釋結果

由表4可知，鄭單309高溫脅迫7 d 與14 d對比組中的46個差異表達代謝物主要富集于次生代謝產物生物合成，葡萄糖甙生物合成，氰氨基酸代謝，對苯二甲酸、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，ABC轉運蛋白，氨基酸生物合成，纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸降解，纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸生物合成，2-氧羧酸代謝，氨酰tRNA生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，嘧啶代謝，氮代謝，精氨酸生物合成，嘌呤代謝，乙醛和二羧酸代謝，色氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，鞘脂代謝，甘油磷酸代謝，類黃酮生物合成，苯并惡嗪類生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙醇生物合成，泛酸鹽和輔酶A生物合成，氨基酸生物合成，碳代謝，C5支鏈二元酸代謝，賴氨酸生物合成，丁酸代謝，牛磺酸代謝，抗壞血酸和醛酸代謝，2-氧羧酸代謝，檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化，組氨酸代謝，黃酮和黃酮醇生物合成等KEGG通路。

表4 高溫脅迫處理7 d與14 d鄭單309差異表達代謝物KEGG注釋結果

續(xù)表4 高溫脅迫處理7 d與14 d鄭單309差異表達代謝物KEGG注釋結果

3 結論與討論

鄭單309是適合河南省夏播的高產玉米品種，在2017年河南省玉米區(qū)域試驗中，比對照鄭單958增產2.2%。本研究對花粒期鄭單309高溫脅迫處理7 、14 d及正常生長條件下穗位葉進行轉錄組高通量測序，解析鄭單309響應花粒期高溫脅迫的分子機制。鄭單309高溫脅迫7 d與正常生長條件材料對比組中共檢測到515個差異表達基因，其中75個為上調表達基因；高溫脅迫14 d與正常生長條件材料對比組中共檢測到506個差異表達基因，其中114個為上調表達基因。高溫脅迫7 d 材料與高溫脅迫14 d材料相比，發(fā)現2 050個差異表達基因，其中790個為上調表達基因，1 260個為下調表達基因。說明隨著高溫脅迫處理時間的延長，鄭單309在轉錄水平上有更多的基因表達模式發(fā)生變化。高溫脅迫7 d與正常生長條件對比組、高溫脅迫14 d與正常生長條件對比組、高溫脅迫7 d與高溫脅迫14 d對比組中只檢查到了3個共同差異表達基因Zm00001d022453、Zm00001d025319、Zm00001d038806。Zm00001d022453編碼陽離子過氧化酶1，在KOG數據庫中分類屬于過氧化物。這與前人[25]研究結果一致，即高溫脅迫破壞玉米植株生長發(fā)育中活性氧產生與清除的動態(tài)平衡?；钚匝醯拇罅糠e累可以損傷膜系統，導致電解質流出及細胞生理生化特性發(fā)生紊亂。高溫逆境下高表達水平的過氧化物可以清除積累的活性氧，從而維持細胞活性。Zm00001d025319編碼泛素-蛋白連接酶1，在KOG數據庫中分類屬于翻譯后修飾。而泛素化修飾在高溫逆境中起到重要作用，尤其泛素對植物激素的改變，從而改變激素下游重要蛋白質的表達進而影響生長發(fā)育。Zm00001d038806編碼熱激蛋白101。研究發(fā)現，植物響應高溫脅迫的網絡主要包括熱激蛋白和熱激轉錄因子組成的植物高溫脅迫響應調控網絡、氧化脅迫調控網絡、鋅指蛋白轉錄因子抗逆響應網絡、激素參與的高溫脅迫應答機制、高溫脅迫下的磷脂信號通路[26]。從而推斷Zm00001d038806基因在鄭單309應答花粒期高溫脅迫網絡中起著重要作用。

不同對比組中差異表達基因富集的具體GO分類不同，鄭單309高溫脅迫7 d 與正常生長條件材料對比組中差異表達基因主要富于中和作用、細胞外區(qū)、細胞外區(qū)成分、分子功能調控、抗氧化活性5個GO分類。鄭單309高溫脅迫14 d 與正常生長條件材料對比組中差異表達基因主要富集于電子載體活性、抗氧化活性、節(jié)奏過程、細胞外區(qū)、中和作用5個GO分類。由此推測,轉錄組測序檢測到的高溫脅迫相關差異表達基因主要屬于中和作用、細胞外區(qū)、抗氧化活性3類GO分類功能。隨著高溫脅迫時間的延長，鄭單309高溫脅迫7 d 與14 d對比組中差異表達基因主要富集于電子載體活性、核苷酸、細胞外區(qū)、轉運蛋白活性、核苷酸結合轉錄因子活性5個GO分類功能中。不同對比組中差異表達基因主要富集于碳水化合物的運輸和代謝、細胞壁/細胞膜/被膜生物合成、通用功能預測系統、信號轉導系統4個主要KOG/COG分類。研究發(fā)現，花粒期高溫脅迫改變籽粒淀粉合成酶的活性，減少淀粉合成減少產量[27]。鄭單309植株檢測到差異表達基因屬于碳水化合物運輸和代謝功能，調節(jié)籽粒內淀粉的合成，最低程度減少高溫對產量的損失。不同對比組中差異表達基因主要富集于植物-病原體相互作用、淀粉和蔗糖代謝、木質素生物合成3個KEGG代謝途經中。

代謝組學分析共檢測到654個代謝物，鄭單309高溫脅迫7 d與正常生長條件材料對比組中檢測到40個差異表達代謝物，其中8個上調表達；鄭單309高溫脅迫14 d與正常生長條件材料對比組中檢測到40個差異表達代謝物，其中4個上調表達；隨著高溫脅迫處理時間的延長，上調表達代謝物減少，下調表達代謝物增加。對苯二甲酸在不同對比組中均差異表達。研究發(fā)現，玉米秸稈中存在大量的對苯二甲酸[28]，然而對苯二甲酸具體如何在玉米響應高溫脅迫中起作用尚需要探索研究。不同對比組中檢測到的差異表達代謝物主要富集于精氨酸及脯氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸及蘇氨酸代謝，次生代謝產物生物合成，類黃酮生物合成，ABC轉運蛋白，嘧啶代謝，黃酮和黃酮醇生物合成7個主要KEGG代謝通路中。