楊立均，魯雅雯，丁 超，金維環(huán)，郭紅祥

(1.河南省煙草公司 駐馬店市公司,河南 駐馬店 463000；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450002)

脂氫過氧化物裂解酶(HPL)是一類膜結(jié)合的血紅素-鐵硫蛋白，屬于細(xì)胞色素P450(CYP74)蛋白家族[1]。HPL參與植物體內(nèi)脂氧合途徑，是脂氧合酶(LOX)下游的一個(gè)關(guān)鍵酶，可將LOX催化形成的氫過氧化脂肪酸裂解形成含氧酸和短鏈揮發(fā)性醛類[2-3]。依據(jù)催化底物的過氧基位置不同，HPL被劃分為3類同工酶，第1類同工酶(也命名為13-HPL)特異催化13位過氧基斷裂，第2類同工酶(9-HPL)催化9位過氧基斷裂，第3類同工酶(9/13-HPL)催化9位或13位過氧基斷裂[4]。這3類同工酶在植物種類中有不同的分布，如杏和梨中含有9-HPL基因，煙草、番茄、擬南芥等植物中含有13-HPL基因，黃瓜、水稻中含有9/13-HPL基因[5]。

自從第1個(gè)HPL基因從甜椒中克隆出來，人們陸續(xù)從擬南芥、甜瓜等多種植物中得到HPL基因的cDNA序列，對HPL基因的研究也逐漸加深。13-HPL蛋白具有細(xì)胞色素P450家族的普遍特征：結(jié)構(gòu)域A(I-螺旋區(qū))在酶與底物相互作用中起作用，結(jié)構(gòu)域D為血紅素結(jié)合區(qū)；N-端具有由15～20個(gè)疏水氨基酸組成的跨膜信號序列。HPL參與植物生長發(fā)育的眾多過程，其催化產(chǎn)物是植物特異氣味的成分，如C6和C9揮發(fā)物對果蔬氣味非常重要，C6醛與植物青草氣味有關(guān)，C9醛則會(huì)增加濃郁的香味。黃瓜中的主要風(fēng)味物質(zhì)如烯醛、烯醇、丙醛、己醛等均由HPL催化的代謝產(chǎn)生，枸橘中的HPL基因轉(zhuǎn)入生菜后能夠提高風(fēng)味和品質(zhì)[6-7]。目前，關(guān)于HPL的研究大多集中于改善植物風(fēng)味方面[8-11]，另外，有研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫會(huì)增加黃瓜HPL基因的表達(dá)，因此，HPL在提高植物抗旱等抗逆性方面也將有較好的應(yīng)用[7,12]。

煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)量和品質(zhì)一直被人們關(guān)注。干旱是影響煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的一個(gè)重要因子。干旱脅迫能導(dǎo)致煙株葉片活性氧積累、膜脂過氧化程度加劇，從而增加丙二醛(MDA)含量；同時(shí)煙株也會(huì)啟動(dòng)抗氧化防御系統(tǒng)，增強(qiáng)過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶的表達(dá)與活性，增加脯氨酸的積累，進(jìn)而提高抗旱能力[13]。我國部分煙區(qū)常因連續(xù)干旱導(dǎo)致煙葉中香氣物質(zhì)含量減少，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。HPL催化生成的揮發(fā)性短鏈醛和含氧酸具有特殊氣味，是影響煙草品質(zhì)的重要指標(biāo)；同時(shí)，HPL也被報(bào)道參與植物的干旱脅迫響應(yīng)，故考慮通過調(diào)節(jié)煙草HPL的表達(dá)來提高煙草的品質(zhì)和抗旱性。從煙草中克隆HPL基因(NtHPL)，獲得HPL基因的過表達(dá)煙株，并進(jìn)行抗性功能研究，以期提高煙草抗逆性、減少逆境對煙草品質(zhì)的影響，增加其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 菌株、載體及主要試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞、過表達(dá)載體pCAMBIA 1300均由河南省高等學(xué)校轉(zhuǎn)基因植物基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、T4 DNA連接酶購于Takara公司，2×TaqPlus Master Mix購自Vazyme公司，DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、產(chǎn)物純化試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司，熒光定量試劑盒購于諾唯贊公司，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SmaⅠ購自Thermo Fisher公司，酵母粉、胰化蛋白胨購自Solarbio公司，其他均為國產(chǎn)分析純試劑。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，測序由華大基因有限公司完成。

1.2 植物材料及處理

在大田煙草旺長期，選取生長狀況良好的K326煙株，分別取根、莖、葉組織，液氮速凍后放于-80 ℃冰箱中保存，用于NtHPL組織表達(dá)特異性分析。

將野生型煙草K326和過表達(dá)NtHPL煙草種子播種育苗盤中,置于光照培養(yǎng)箱(26～28 ℃,相對濕度70%,光照16 h/黑暗8 h)中培養(yǎng)，至煙苗四葉期時(shí)移入花盆中(直徑15 cm，高22 cm)。五葉期后，隨機(jī)各選取長勢相同的10株煙株,每株用200 mL 20% PEG-6000溶液進(jìn)行干旱脅迫處理，24 h后取葉片檢測MDA、脯氨酸含量以及POD、SOD活性。

選取長勢一致的野生型K326煙株進(jìn)行如下處理：對照組(噴施清水)、茉莉酸甲酯(MeJA)組(噴施4.0 mmol/L MeJA溶液)、乙烯利組(噴施4.0 mmol/L乙烯利溶液)、脫落酸(ABA)組(噴施0.1 mmol/L ABA水溶液)、水楊酸(SA)組(噴施2 mmol/L SA溶液)、機(jī)械損傷處理組(用剪刀剪傷葉片)，24 h后取頂端第2片葉，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于NtHPL表達(dá)分析。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析 對克隆得到的煙草HPL基因序列用NCBI網(wǎng)站在線工具ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)尋找開放閱讀框；選擇番茄(Lycopersiconesculentum)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、苜蓿(Medicagosativa)、樹棉(Gossypiumarboreum)、辣椒(Capsicumannuum)、土豆(Solanumtuberosum)、黃瓜(Cucumissativus)、石榴(Psidiumguajava)、大麥(Hordeumvulgare)、玉米(Zeamays)、葡萄(Vitisvinifera)和大豆(Glycinemax)的HPL蛋白氨基酸系列， 運(yùn)用DNAman軟件與煙草HPL蛋白氨基酸進(jìn)行序列比對，同時(shí)分析煙草HPL蛋白分子質(zhì)量、等電點(diǎn)；采用Chlorop 1.1軟件分析HPL的細(xì)胞定位[14]。用PSIPRED方法預(yù)測NtNPL蛋白的二級結(jié)構(gòu)、信號肽和跨膜區(qū)[15],用蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)在線分析工具(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測NtNPL蛋白的空間結(jié)構(gòu)。

1.3.2 煙草HPL基因的克隆與轉(zhuǎn)基因煙株的獲得 按照Trizol法提取煙草葉片總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作得到cDNA。根據(jù)HPL基因cDNA序列設(shè)計(jì)引物，上下游引物分別插入XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，引物序列：NtHPL-F：5′-GCTCTAGAATGTCCACAATAATGGCGAAAATGAT-3′；NtHPL-R：5′-TCCCCCGGGTCAACTGGCTTTTTTCACAGATGTGAT-3′。以cDNA為模板進(jìn)行克隆。PCR循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸92 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min。

將純化的PCR產(chǎn)物和pCAMBIA 1300載體進(jìn)行XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切，回收目的基因片段和線性載體片段后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接條件為16 ℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，經(jīng)抗性篩選、菌液PCR驗(yàn)證，將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)、提取質(zhì)粒，凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(GV3101)感受態(tài)細(xì)胞，36～48 h后挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測，將檢測成功的菌液進(jìn)行保菌。葉盤法轉(zhuǎn)化K326煙草無菌苗獲得轉(zhuǎn)基因植株HPL-1300。

1.3.3 生理指標(biāo)檢測 MDA含量采用硫代巴比妥酸法(TBA)測定，SOD活性采用氮藍(lán)四唑還原法測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定[16-17]。

1.3.4 煙草HPL基因表達(dá)分析 煙草總RNA提取采用TRIzon試劑，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以煙草β-Actin(GenBank：AF126810)作為內(nèi)參基因，使用美國BioRad公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測HPL基因表達(dá)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù),采用2-ΔΔCt算法進(jìn)行基因表達(dá)水平分析。所用引物如下，NtActinF:CTGAGGTCCTTTTCCAACCA，R:TACCCGGGAACATGGTAGAG；NtHPLF:GTTTTGAGTTGTGGCAGCTA，R:GAGTATCACACAAGGGGGAG。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtHPL基因的生物信息學(xué)分析

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以NtHPL-F、NtHPL-R為引物從煙草中克隆得到的NtHPLcDNA序列全長為1 494 bp(圖1)，利用NCBI上ORF Finder工具發(fā)現(xiàn)，該序列包含完整的開放閱讀框，編碼1個(gè)由497個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為55.7 ku，等電點(diǎn)為8.41。將cDNA序列與NtHPL基因組DNA序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)包含2個(gè)外顯子(450 bp和1 044 bp)和1個(gè)內(nèi)含子(10 938 bp)。采用Chlorop 1.1軟件分析表明，NtHPL蛋白定位于葉綠體中，N-端含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。圖2顯示NtHPL蛋白為跨膜蛋白，分別在299—319位和463—479位氨基酸有2個(gè)跨膜區(qū)，N-端含有21個(gè)氨基酸組成的信號肽。

1.DL2000 DNA Marker; 2.NtHPL

圖2 NtHPL蛋白的信號肽與跨膜預(yù)測結(jié)果

圖3顯示NtHPL蛋白與其他物種的HPL蛋白序列比較結(jié)果，NtHPL蛋白具有細(xì)胞色素P450蛋白家族的普遍特征，在C-端具有4個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域A、B、C、D，結(jié)構(gòu)域A主要在與底物相互作用中起重要作用，結(jié)構(gòu)域D中含有13-HPL特有的NKQC序列，主要負(fù)責(zé)與血紅素分子結(jié)合；在N-端有CYP74亞家族蛋白質(zhì)的保守序列LPxRxIPGSYGxPxxGP。NtHPL蛋白還包含有與血紅素分子以及血紅素鐵相互作用的保守氨基酸。從圖4可以看出，NtHPL蛋白主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)組成。

Domain A、B、C、D是P450家族蛋白C-端的保守區(qū)；下劃線表示P450家族CYP74亞家族在N-端的保守區(qū)；圓點(diǎn)表示與血紅素分子相互作用的氨基酸；星號表示與血紅素鐵相互作用的半胱氨酸

下劃線表示N-端信號肽，紅色表示α-螺旋結(jié)構(gòu)，黃色表示β-片層結(jié)構(gòu)，灰色表示卷曲結(jié)構(gòu)

2.2 NtHPL基因的表達(dá)分析

從圖5可以看出，在煙草旺長期，NtHPL基因在葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根和莖，表明該基因主要存在于葉中。機(jī)械損傷、MeJA和SA處理后，葉片NtHPL表達(dá)量明顯提高，分別是對照的5.31、10.94、4.26倍，說明NtHPL響應(yīng)機(jī)械損傷脅迫和MeJA信號。機(jī)械損傷能夠產(chǎn)生茉莉酸(JA)信號，SA能誘導(dǎo)植物對病毒、真菌、細(xì)菌引起的病害產(chǎn)生抗性。有研究表明，植物發(fā)生機(jī)械損傷、病蟲害時(shí)，綠葉揮發(fā)物的生成會(huì)增多，綠葉揮發(fā)物是由LOX和HPL共同作用生成，所以NtHPL與煙草的抗逆響應(yīng)有關(guān)。乙烯、ABA和干旱處理后，葉片NtHPL表達(dá)量有不同程度的提高，分別是對照組的2.33、2.54、4.17倍，表明NtHPL與干旱等非生物脅迫及信號刺激響應(yīng)有關(guān)。

A.煙草旺長期不同部位NtHPL的表達(dá)； B.NtHPL在逆境脅迫及激素類信號物質(zhì)作用下的表達(dá)

2.3 NtHPL過表達(dá)煙株的獲得

采用CTAB法提取葉片DNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因煙株檢測，由圖6可以看出，在野生型K326中沒有檢測到條帶，而轉(zhuǎn)基因煙草中檢測到1 622 bp的條帶，表明NtHPL過表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入K326中。從圖6可以看出，NtHPL過表達(dá)煙株(HPL-1300)中HPL表達(dá)量明顯上升，是K326的3.6倍，說明獲得的NtHPL轉(zhuǎn)基因煙株過表達(dá)效果較好。

1：DL2000 DNA Maker； 2：野生型K326； 3：NtHPL過表達(dá)煙株

2.4 NtHPL基因的抗旱功能初步分析

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的主要產(chǎn)物,常用來評價(jià)細(xì)胞膜的受傷害程度。圖7顯示，干旱處理后，野生型K326和轉(zhuǎn)基因煙株的MDA含量都升高了，但野生型K326的MDA含量是NtHPL過表達(dá)煙株的近5倍，表明干旱脅迫造成K326煙株脂質(zhì)過氧化程度明顯高于轉(zhuǎn)基因煙株，即轉(zhuǎn)基因煙株具有更強(qiáng)的維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性的能力。脯氨酸是植物體細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物可通過積累游離脯氨酸防御干旱脅迫。圖7顯示，干旱脅迫能夠增加煙株的脯氨酸含量，但轉(zhuǎn)基因煙株HPL-1300的脯氨酸含量明顯高于K326煙株，表明轉(zhuǎn)基因煙株防御干旱脅迫的能力更強(qiáng)。POD和SOD是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，它們能清除活性氧自由基，抑制膜脂過氧化，減輕逆境對細(xì)胞膜的傷害。圖7顯示，干旱處理后，野生型K326和轉(zhuǎn)基因煙株HPL-1300的POD和SOD活性均有升高，但K326煙株中這2種酶的活性明顯高于轉(zhuǎn)基因煙株，分別是轉(zhuǎn)基因煙株的1.8倍和2.2倍，表明轉(zhuǎn)基因煙株中POD和SOD被誘導(dǎo)的程度低于野生型K326，即轉(zhuǎn)基因煙株中的活性氧積累少，其抗旱能力大于K326煙株。

圖7 干旱脅迫對煙株脯氨酸和MDA含量及抗氧化酶活性的影響

3 結(jié)論與討論

脂肪酸代謝是植物生長發(fā)育中重要的代謝過程，HPL是脂氧合途徑下游的酶，其催化產(chǎn)物是植物綠葉揮發(fā)物的主要成分，既可作為植物的氣味物質(zhì)又能作為信號分子參與植物的抗逆反應(yīng)。大多數(shù)植物HPL蛋白的N-端都具有跨膜信號序列，但也存在較大差異。煙草HPL蛋白是一種13-HPL。研究表明，番茄13-HPL活性存在于葉綠體囊膜上，其N-端沒有典型的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽[18]；BATE等[19]推測，擬南芥13-HPL的N端有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。本研究發(fā)現(xiàn)，煙草HPL蛋白主要表達(dá)在葉片部位，預(yù)測其N-端含有1個(gè)由21個(gè)氨基酸組成的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。HPL基因的表達(dá)受到眾多脅迫因素的誘導(dǎo)，13-HPL催化的產(chǎn)物愈傷素是傷口愈合反應(yīng)中的信號分子，能促使創(chuàng)傷的細(xì)胞和組織快速愈合[20-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，除了干旱、ABA、SA等因素誘導(dǎo)NtHPL的表達(dá)外，機(jī)械傷害和MeJA都能顯著提高NtHPL的表達(dá)水平，進(jìn)一步表明NtHPL能參與煙草的傷口愈合反應(yīng)過程。

干旱是我國煙草種植面臨的一種嚴(yán)重的非生物脅迫因素，提高煙草抵抗非生物脅迫的能力一直是煙草栽培與育種的努力方向。當(dāng)干旱脅迫發(fā)生時(shí),植物因氣孔關(guān)閉，限制了二氧化碳的攝取,使得光呼吸過程中電子傳遞受阻，從而產(chǎn)生大量活性氧和自由基，對植物細(xì)胞大分子和生物膜造成損害，增加脂質(zhì)過氧化程度。植物體內(nèi)存在維持活性氧與自由基平衡的一系列調(diào)節(jié)機(jī)制，抗氧化酶是清除體內(nèi)活性氧的一類重要酶，植物可通過轉(zhuǎn)錄因子、蛋白質(zhì)磷酸化等途徑上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)與活性，降低活性氧對植物的傷害[26-27]。植物HPL產(chǎn)物中的醛類不僅可通過還原反應(yīng)清除多余的活性氧，而且醛類物質(zhì)中與羰基直接相連的α-碳原子上具有較活潑的氫，能與受脅迫影響產(chǎn)生的活潑自由基結(jié)合，中止自由基的作用，從而阻止氧化的進(jìn)行，起到了較強(qiáng)的抗氧化作用[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫后，過表達(dá)NtHPL煙草的脯氨酸含量明顯高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢熤?，而MDA含量、SOD和POD活性的變化則相反，表明NtHPL過表達(dá)能夠提高煙株的抗干旱脅迫響應(yīng)能力，降低干旱脅迫對煙株的傷害，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。