洪奇華，陳學(xué)秋，金妙仁，胡彩虹*

（1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.杭州海爾希畜牧科技有限公司，浙江杭州 311261）

近20 年來，實時定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）技術(shù)已成為核酸分子定量的常規(guī)方法。qPCR 利用參照基因?qū)ζ鹗紭悠愤M(jìn)行相對定量，也可依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)對樣品的絕對定量，但由于其計數(shù)分辨率有限，當(dāng)靶核酸濃度較低、存在PCR 抑制劑干擾、擴增曲線的循環(huán)閾值（Ct 值）分辨不好時，qPCR 就不能滿足嚴(yán)格的量化要求。而數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)采用“分而治之”的策略，不僅可以得到目標(biāo)分子的濃度，還可以獲得其絕對數(shù)目[1]。近年來，dPCR 技術(shù)憑借其高通量、高準(zhǔn)確度、真正絕對定量等特點迅速發(fā)展起來，并在多個領(lǐng)域得到了極為廣泛的應(yīng)用。本文簡要介紹了dPCR 技術(shù)的基本原理、主要優(yōu)勢和技術(shù)平臺，并對其在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1 dPCR 的基本原理

dPCR 方法主要基于靶區(qū)的劃分、單分子PCR 和泊松統(tǒng)計3 個要點，其檢測原理與qPCR 基本相同，但在量化方式上有所不同。qPCR 反應(yīng)在單一體系中進(jìn)行，而dPCR 技術(shù)先將帶熒光標(biāo)記DNA 樣品的反應(yīng)體系進(jìn)行稀釋，分配到幾百到幾百萬個不同的區(qū)室（如液滴和微孔）中，每個區(qū)室含有0、1 或多個DNA 模板分子，充當(dāng)一個獨立的PCR 微反應(yīng)器；各反應(yīng)室內(nèi)DNA 分子獨立進(jìn)行常規(guī)PCR 反應(yīng)，然后采集每個反應(yīng)室的熒光信號，根據(jù)熒光信號的存在與否分別給出數(shù)字信號“1”或“0”的結(jié)果，代表目標(biāo)DNA 的存在與否；最后通過泊松統(tǒng)計估計每個分區(qū)的平均分子數(shù)，然后除以分配體積換算成濃度，計算獲得樣本的原始拷貝數(shù)，從而實現(xiàn)對靶標(biāo)分子的絕對計數(shù)（圖1）[2-3]。dPCR 的關(guān)鍵是進(jìn)行極限稀釋，增加反應(yīng)室的數(shù)量可以提高泊松精度[4]。

圖1 數(shù)字PCR 基本原理示意圖

2 dPCR 的主要優(yōu)勢

相對于傳統(tǒng)PCR 和qPCR，dPCR 技術(shù)具有不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線、靈敏度高、精確度高和對抑制劑更加耐受等獨特優(yōu)勢。

2.1 不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對定量 qPCR 方法中，通過在特定時間點（周期閾值Ct）測量PCR 擴增的熒光信號，與樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct 值比較并進(jìn)行定量。dPCR則在大量的獨立小室中分別進(jìn)行PCR，利用信號存在與否來指示目標(biāo)DNA，對樣本進(jìn)行直接“數(shù)字化”測量，因此是不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對定量，在不同實驗室和分析條件下結(jié)果更為一致，重現(xiàn)性好[5]。

2.2 靈敏度高 傳統(tǒng)PCR 中，核酸樣本和產(chǎn)物都在同一個混合體系中，目標(biāo)樣品的擴增效率和產(chǎn)物檢測敏感度受體系復(fù)雜程度的限制。在dPCR 中，核酸樣本被分為許多小室，在不同的反應(yīng)室中同時擴增后分別進(jìn)行評估，避免了引物與引物之間、不同產(chǎn)物之間的相互影響，因此結(jié)果不受擴增效率的影響，大大提高了檢測的靈敏度，比傳統(tǒng)PCR 提高10～100 倍[6-9]。

2.3 精確度高 在qPCR 中，由于熒光在每個周期加倍，通常一次分析只能獲得2 倍拷貝數(shù)差異的結(jié)果。而不斷發(fā)展的高度分區(qū)方法使dPCR 特別敏感，能區(qū)分樣本中目標(biāo)核酸之間的微小濃度差異，從而減少誤差，提高實驗精度。dPCR 通?？煞直?.25 倍差異的樣品，甚至可達(dá)1.16 倍，能夠?qū)崿F(xiàn)稀有突變體的檢測[2]。

2.4 對抑制劑耐受性高 qPCR 和dPCR 都能在“干凈”的單重擴增中檢測到單分子。但在qPCR 中，過量的背景DNA 或抑制劑可影響擴增效率并改變Ct 與目標(biāo)數(shù)之間的關(guān)系。此現(xiàn)象在稀有突變檢測中尤為突出，突變型和野生型等位基因都在熱循環(huán)過程中被擴增，如果野生型分子比例超過100 倍以上，會因消耗過多聚合酶、核苷酸和熒光探針而影響到低濃度靶標(biāo)。在dPCR 中，分區(qū)的反應(yīng)量極低，相對豐富了每個隔間的低濃度靶標(biāo)，擴展了動態(tài)范圍，提高了擴增效率。近來有報道，dPCR 對不同類型抑制劑（如KCl 和NaCl 等鹽類，去氧膽酸鈉和SDS 等離子洗滌劑，乙醇、異丙醇和苯酚等），比qPCR 具有更高的耐受性[10]。

另外，dPCR 樣本需求量低，不需要對極低濃度的模板進(jìn)行預(yù)富集，從而顯著提高檢測靈敏度，而且可以在dPCR 系統(tǒng)中回收樣品，更易于自動化操作。

3 dPCR 平臺的發(fā)展

dPCR 的最初分區(qū)是通過在多個孔上手動分發(fā)樣本來創(chuàng)建的[11]，耗時費力。微流控技術(shù)的發(fā)展提供了許多有效的分區(qū)方法，一些公司開發(fā)的儀器已可以將樣品分至數(shù)百到數(shù)百萬個納升或皮升級的反應(yīng)室[12]。目前，F(xiàn)luidigmTM、Applied Biosystems/Life TechnologiesTM、Stilla Technologies、RainDropTMplus Technologies、Bio-Rad、Formulatrix 等多家公司已相繼推出了各種商業(yè)化dPCR 平臺[13]。根據(jù)反應(yīng)單元形成方式的不同，可將dPCR 技術(shù)平臺分為固體微腔和油包水乳液兩大類。

3.1 固體微腔數(shù)字PCR 固體微腔平臺建立在微流體、納米制造和微電子等技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上，可為dPCR 提供一個低成本、小體積和高通量的理想平臺，如商用96、384 或1536 孔板，需要借助高通量的自動點樣儀，儀器成本較高，操作相對復(fù)雜。通過使用光刻和微加工工藝可使微腔更小，如每孔容積1.4 fL，更多的孔可以提高動態(tài)范圍和富集稀有樣品的能力[2]。

第1 代dPCR 平臺是通過包含微流控通道的芯片實現(xiàn)的[14]。然而，為了使芯片的尺寸最小化，各種系統(tǒng)中的隔室數(shù)量通常限制在幾千個[15]。目前已有多個帶微室的dPCR 系統(tǒng)，其中包括Bio-MarkTMDigital Array（Fluidigm，South San Francisco，CA，USA），每張芯片上集成有相互獨立的10 000～40 000 個反應(yīng)室，每個反應(yīng)體系用量為6 nL；QuantStudio 3D（ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA）芯片數(shù)字PCR 系統(tǒng)采用了高密度的納升流控芯片技術(shù)，可以并行分析24 個芯片，每個芯片包含20 000 個隔室，內(nèi)部體積為0.8 nL[14]。

3.2 液滴數(shù)字PCR 液滴數(shù)字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）反應(yīng)室不是由孔壁隔開的，而是由微流控油包水乳液產(chǎn)生數(shù)千到百萬計的液滴，PCR 反應(yīng)在由連續(xù)油相分離的水滴中進(jìn)行。ddPCR 的優(yōu)點是可以根據(jù)需要生成任意多個分區(qū)，如可以提供多達(dá)1 000 萬個納升至皮升級的液滴，每個液滴都是一個獨立的反應(yīng)體系分區(qū)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于由固體微腔在單個反應(yīng)孔中分割的數(shù)量。該方法具有很高的靈敏度來區(qū)分DNA 突變等稀有樣品，檢測限可達(dá)0.001%[16]。液滴是連續(xù)生成的，需要幾分鐘到幾小時才能生成足夠的分區(qū)，但分步乳化系統(tǒng)通過大規(guī)模的并行化來解決這個問題，允許它們在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生成千上萬的液滴，同時保持相對均勻的液滴尺寸[17]。然而，ddPCR 技術(shù)也存在一定的局限性，如液滴生成過程中常會發(fā)生分區(qū)間的體積差異。

目前，Bio-Rad、Stilla、Life Technologies 和RainDance等公司都可提供ddPCR 技術(shù)[15,18]。其中QX200 system（BioRad，Hercules，CA，USA）可以平行分析96 孔，每孔含20 000個1 nL的液滴；RainDropsystem（Raindance Technologies，Lexington，MA，USA）可以平行分析8 孔，每孔含高達(dá)1 000 萬個5 pL 的液滴；NaicaTMsystem（Stilla Technologies，Villejuif，F(xiàn)rance）中的樣品首先流經(jīng)一個由25 000～30 000 個液滴組成的大型微通道網(wǎng)絡(luò)——液滴晶體，可以并行分析4 個液滴晶體[19]。

4 dPCR 技術(shù)在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用

dPCR 最初應(yīng)用于基于極限稀釋技術(shù)和等位基因特異性熒光探針的腫瘤相關(guān)突變研究[8]。隨著技術(shù)的演變與優(yōu)化，現(xiàn)已成功應(yīng)用于許多領(lǐng)域，在動物生產(chǎn)中的病原體檢測、生長繁殖相關(guān)基因檢測、畜禽飼料成分檢測、畜禽產(chǎn)品質(zhì)量分析等方面也得到了成功應(yīng)用。

4.1 動物病原體的檢測

4.1.1 病毒的檢測 病毒遺傳物質(zhì)形式多樣，可以由DNA 組成，也可以由RNA 組成。組成病毒基因組的DNA 和RNA 有單鏈、有雙鏈、有閉環(huán)、有線性的。動物病毒基因組主要包括雙鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA（+）、單鏈RNA（-）和環(huán)狀雙鏈DNA。病毒性疾病在養(yǎng)殖動物傳染病中占很大的比例，由其引起的動物死亡率在所有病因中僅次于細(xì)菌，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失[20]，因此開發(fā)快速、靈敏、準(zhǔn)確的病毒檢測方法顯得尤為重要。近年來，國內(nèi)外學(xué)者已將dPCR 技術(shù)應(yīng)用于一些動物源性病毒的檢測。

dPCR 較早應(yīng)用于含單股環(huán)狀DNA 的豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus，PCV）檢測。Zhao 等[21]最早利用ddPCR 平臺建立了一種檢測PCV-2 的靈敏方法，檢測限為25拷貝/μL，比TaqMan-qPCR靈敏度高4倍。隨后，原霖等[22]也建立了準(zhǔn)確定量PCV-1基因的ddPCR 方法，檢測限為7.8 拷貝/20 μL，靈敏度高且特異性強。近年來出現(xiàn)了一種新型圓環(huán)病毒PCV-3，Wu 等[7]針對PCV3-cap基因建立了一種高度特異性的ddPCR 檢測方法，比qPCR 靈敏度約高出10 倍，檢測結(jié)果重復(fù)性好。豬圓環(huán)病毒高靈敏度dPCR 檢測方法的建立對豬皮炎腎病綜合征、繁殖障礙和多系統(tǒng)炎癥等疾病防控具有重要意義。除豬圓環(huán)病毒外，楊春華等[23]建立了人畜共患的單股環(huán)狀DNA 病毒——豬細(xì)環(huán)病毒（Torque Teno Virus，TTV）的dPCR 檢測方法，具有準(zhǔn)確定量、重復(fù)性好、特異性強、靈敏度高、檢測限低等優(yōu)點，成為了一種強有力的檢測診斷工具。

最近研究較多的非洲豬瘟由一種較大的雙鏈DNA病毒——非洲豬瘟病毒（ASF Virus，ASFV）引起。鄔旭龍等[24]建立了一種新型而高靈敏度的dPCR 檢測方法，檢測限為10 拷貝/20 μL，靈敏度是qPCR 的10倍，且具有很高的特異性和重復(fù)性，為實驗室監(jiān)測確診提供了依據(jù)。偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）也是一種雙鏈DNA 病毒。陳亞娜等[25]建立了檢測PRV 的ddPCR 方法，檢測限為6.1 拷貝/20 μL，比qPCR 低，敏感度高且特異性強；Ren 等[8]發(fā)現(xiàn)，ddPCR 與TaqMan-qPCR 2 種方法均表現(xiàn)出良好的線性和重復(fù)性，但ddPCR 相較于qPCR 能在極低濃度下保持線性，ddPCR 的檢測限為4.75 拷貝/μL，而qPCR的檢測限為76 拷貝/μL，ddPCR 的靈敏度提高了16 倍。Pinheiro-de-Oliveira 等[26]則用ddPCR 方法研究了由雙鏈DNA 病毒——犬丙型皰疹病毒2（Ovine herpesvirus type 2，OvHV-2）引起的巴西牛惡性卡他性熱的爆發(fā)，發(fā)現(xiàn)在低濃度時能檢測到qPCR 結(jié)果為陰性的3 個樣品，表明dPCR 是一種敏感而特異性好的方法，可用作檢測綿羊OvHV 的重要技術(shù)。

在含單鏈RNA（+）基因組的病毒檢測研究中，多位學(xué)者利用了dPCR 方法。Yang 等[27]比較了ddPCR與qPCR 檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的定量線性、靈敏度和準(zhǔn)確性，2 種方法均表現(xiàn)出高度的線性和定量相關(guān)性，但ddPCR 方法可以提高PRRSV檢測的靈敏度和特異性。Wu 等[9]建立了一種檢測人畜共患病毒——乙型腦炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）的RT-ddPCR 方法，比較了其與TaqMan-RT-PCR 的敏感性，結(jié)果表明2 種方法均呈高度線性，RT-ddPCR 的檢測限約為2 拷貝/ 20μL，比TaqMan-RT-PCR 靈敏度高100 倍，而且與其他豬病原菌無交叉反應(yīng)，具較高的特異性。Zhang 等[28]新建了一種RTddPCR 檢測A 型塞內(nèi)卡病毒（Senecavirus A，SVA）的方法，具有良好的線性、重復(fù)性和重現(xiàn)性，并在極低濃度的SVA 核酸模板下保持線性關(guān)系。Pinheiro-de-Oliveira 等[29]也建立了一套用RT-ddPCR 方法檢測口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）RNA的標(biāo)準(zhǔn)化方法，顯示出較好的穩(wěn)健性、敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。

有時不同病毒引起的疾病癥狀十分相似，在臨床上難以區(qū)分，敏感而特異的檢測對疾病的及時控制至關(guān)重要。新型的dPCR 檢測方法可作為診斷各種動物病毒的有效手段，有利于疾病的監(jiān)測與控制，顯示其潛在的應(yīng)用前景。

4.1.2 細(xì)菌的檢測與定量 隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)向?qū)I(yè)化、集約化和商品化的快速發(fā)展，以及飼料禁抗的實施，預(yù)防各種細(xì)菌性疾病的壓力日趨嚴(yán)重，因此細(xì)菌的快速準(zhǔn)確檢測顯得越發(fā)重要。

奶牛子宮炎是奶牛不孕的重要原因之一，由多種微生物感染引起。Jeon 等[30]利用ddPCR 方法分別測定發(fā)燒和不發(fā)燒2 組子宮炎奶牛的微生物菌群，發(fā)現(xiàn)2 組的化膿桿菌和細(xì)菌總數(shù)絕對豐度相似，但均高于健康組。隨后Cunha 等[31]用ddPCR 方法測定了8 種潛在致病菌的絕對拷貝數(shù)，并評估了其與奶牛子宮炎和發(fā)熱的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)血液可作為母牛病原體從腸道到子宮的傳播途徑。因此ddPCR 方法的絕對定量成為子宮炎機理闡明的有利工具。

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC）與人類疾病關(guān)系密切。Verhaegen 等[32]用ddPCR 方法對志賀毒素基因Stx1、Stx2和內(nèi)毒素基因Eae的定量進(jìn)行了優(yōu)化，ddPCR 和qPCR 的結(jié)果具有很好的一致性，但對PCR抑制劑耐受性比qPCR 好。此細(xì)菌中O157:H7 是主要血清類型，但近年來發(fā)現(xiàn)在阿根廷和德國存在O178 新型病原體。Paquette 等[33]比較了加拿大西部2 個屠宰場的牛糞大腸桿菌O178 和O157 數(shù)量，1 773 份樣品經(jīng)常規(guī)PCR 方法初篩后，再用ddPCR 對168 個樣品進(jìn)行絕對定量，發(fā)現(xiàn)O178 的比例高于O157，表明O178 可能是加拿大的一個新亞群。因此ddPCR 作為一種高靈敏度的方法可用于細(xì)菌新亞型的發(fā)掘。

dPCR 方法也已被用于微生物菌群評價。Looft 等[34]探討了卡巴多克斯對豬腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)飼料中添加該抗生素4 d 后，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，尤其是普雷沃菌屬豐度相對增加；但dPCR結(jié)果顯示用藥豬的普雷沃菌屬絕對豐度沒有變化，而是由于腸道中其他細(xì)菌數(shù)量減少，顯示了dPCR 絕對定量在研究中的重要性。當(dāng)利用抗生素進(jìn)行抗感染治療后，攝入益生菌的效果可通過糞便中益生菌的追蹤來評價。Gobert 等[35]建立了一種dPCR 結(jié)合疊氮丙二鈉（PMA）處理的新方法，對仔豬糞便中的鼠李糖乳桿菌和2 株副干酪乳桿菌進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)ddPCR 和qPCR 都可以對菌株進(jìn)行特異性定量，但ddPCR 無需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，且能定量更低數(shù)量的活細(xì)胞，因此PMA-ddPCR 方法為臨床前和臨床糞便中細(xì)菌存活率的定量檢測提供了一種新手段。

此外，dPCR 方法也已被用于雞和其他動物中細(xì)菌疾病的檢測與診斷。如Wattrang 等[36]發(fā)現(xiàn)在一些感染雞的未稀釋DNA 樣本中，血液中丹毒DNA 的檢測受到抑制，而ddPCR 對這種抑制不太敏感，為該細(xì)菌的檢測提供了有效的方法。

4.1.3 寄生蟲的檢測與定量 目前，dPCR 技術(shù)已用于動物腸道寄生蟲的研究。Yang 等[37]對綿羊和牛糞便中的隱孢子蟲進(jìn)行了ddPCR 和qPCR 研究，2 種方法均顯示出高度的線性，但ddPCR 的精確度比qPCR 更高，所需模板拷貝數(shù)低，且受抑制劑的影響較小。Elmahalawy 等[38]用ddPCR 方法對瑞典放牧綿羊中的3種胃腸道線蟲（血矛線蟲、錐蟲和毛線蟲）進(jìn)行絕對定量，結(jié)果表明該方法適用于不同屬和各種樣品的絕對定量。Baltru?is 等[39]也建立了一種ddPCR 新方法，用于精確鑒定和量化牛混合性胃腸道感染中的古柏線蟲和奧思特線蟲，利用2 種寄生蟲序列的單核苷酸差異，開發(fā)了標(biāo)記FAM 或HEX 熒光的2 種特異性水解探針，不僅可以區(qū)分這2 種寄生蟲的DNA 序列，還可以在混合DNA樣本中進(jìn)行定量分析，新開發(fā)的通用探針可為屬特異性提供穩(wěn)健準(zhǔn)確的參考。除腸道寄生蟲外，dPCR 技術(shù)也已被應(yīng)用于其他寄生蟲的檢測與定量，如豬疥螨不同生活階段SMIPP-C基因的轉(zhuǎn)錄水平研究[40]。

4.2 動物生長繁殖相關(guān)基因檢測與定量 生長繁殖相關(guān)基因的檢測與篩選涉及到經(jīng)濟產(chǎn)量和生產(chǎn)力，已成為畜禽養(yǎng)殖和動物育種中經(jīng)濟性狀選擇的重要因素。Quach等[41]采用ddPCR 方法確定了皮特蘭、長白、杜洛克和約克夏4 個家豬品種20 頭豬的睪丸特異性蛋白Y 編碼（TSPY）基因為三拷貝，且只在公豬中檢測到；在低繁殖率組和特別高繁殖率組中，豬的TSPY 基因拷貝數(shù)沒有顯著差異，但其數(shù)值比正常組稍偏低。Reliszko 等[42]用dPCR 檢測了妊娠豬MiR-23b、MiR-26a、MiR-92a、MiR-125b和MiR-203a的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)懷孕16 d 時，MiR-23b水平顯著上升，而用RT-qPCR 方法未能檢測到顯著性差異，說明dPCR 是最可靠的方法，能檢測到低豐度循環(huán)miRNA 的微小倍數(shù)變化。Favia 等[43]將ddPCR 技術(shù)應(yīng)用于單峰駱駝8 種骨骼肌中肌肉抑制素的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的絕對定量。Szczerbal 等[44]研究發(fā)現(xiàn)用ddPCR 方法可有效檢測和定量白細(xì)胞嵌合，準(zhǔn)確估計X 與Y 性染色體的拷貝數(shù)之比，用細(xì)胞遺傳學(xué)分析檢測到的XX/XY 嵌合體均能被ddPCR 證實，表明該方法簡單、靈敏、快速、準(zhǔn)確。

4.3 畜禽飼料成分檢測中的應(yīng)用 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品具有諸多優(yōu)勢，但尚未完全被人類接受。許多國家和政府對飼料產(chǎn)品中存在的轉(zhuǎn)基因生物成分進(jìn)行管制，規(guī)定了每種轉(zhuǎn)基因成分的標(biāo)識閾值，因此需要準(zhǔn)確的定量方法來確定產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分。目前通常用qPCR 方法對產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量分析，由于該方法對抑制劑敏感，并依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，在極低數(shù)量的DNA 靶點檢測方面存在局限性。

近年來，dPCR 技術(shù)在飼料相關(guān)轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用越來越受到關(guān)注。Corbisier 等[45]和Morisset 等[46]分別用dPCR 方法檢測了轉(zhuǎn)基因玉米MON810和內(nèi)參基因Hmg的絕對拷貝數(shù)，結(jié)果與qPCR 檢測結(jié)果一致，但dPCR 技術(shù)在低靶標(biāo)濃度時重現(xiàn)性更好，對抑制劑的耐受性更強。Cottenet 等[47]評估了dPCR 技術(shù)對15 個轉(zhuǎn)基因玉米和9 個轉(zhuǎn)基因大豆事件的定量性能，根據(jù)轉(zhuǎn)基因生物驗證指南，從高、中、低3 個不同的轉(zhuǎn)基因含量水平上對轉(zhuǎn)基因生物的真實性和精確性進(jìn)行了測定，結(jié)果表明精確度較高，每個轉(zhuǎn)基因事件的定量限值在12～31 個目標(biāo)拷貝。Bogo?alec 等[48]針對“抗草甘膦”大豆和大豆參考基因，用QX100/QX200 ddPCR 方法對4 個樣本進(jìn)行適用性研究，開發(fā)了一種用于復(fù)雜樣品中轉(zhuǎn)基因生物定量分析的方法。吳瀟等[49]基于QX200 平臺建立了特異的ddPCR 檢測方法，對轉(zhuǎn)基因大豆中結(jié)構(gòu)特異性基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量，結(jié)果檢出限為2 拷貝/20 μL，檢測靈敏度高于國標(biāo)中qPCR 方法。上述研究結(jié)果均顯示，dPCR 技術(shù)有著qPCR 無可比擬的優(yōu)越性，是飼料轉(zhuǎn)基因絕對定量檢測的一種有效方法。

對于復(fù)雜基質(zhì)或飼料，單重檢測方法難以執(zhí)行高通量分析所需的最佳轉(zhuǎn)基因成分檢測。為滿足復(fù)雜轉(zhuǎn)基因成分的絕對定量，已開發(fā)了系列雙重或多重dPCR 檢測方法。潘廣等[50]建立的雙重ddPCR 定量方法能特異性檢出轉(zhuǎn)基因玉米T25，在相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤25%時可以檢測到4.6 個特異性分子，而在不考慮各重復(fù)間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的情況下可以檢測到1 個拷貝。劉津等[51]建立了一種特異、穩(wěn)定、靈敏、通用的轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系雙重dPCR 定量檢測方法，ddPCR 平臺對大豆MON89788 品系和內(nèi)源Lectin的絕對定量限分別為8.0、8.2 拷貝/μL，cdPCR 平臺分別為7.443、7.646 拷貝/μL，2 個平臺的相對定量限均為0.1%。蔡教英等[52]建立了油菜樣品的雙重ddPCR 定量分析方法，定量限（LOQ）和檢測限（LOD）分別為18、3.7 拷貝。Niu 等[53]提出了一種單一通用引物-多重ddPCR（SUP-M-ddPCR）的策略，發(fā)現(xiàn)“五重法”LOD 和LOQ 分別為0.1% 和0.01%，可以作為檢測轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)品的重要工具。因此，雙重和多重ddPCR 定量方法比單重dPCR 定量方法更簡便、系統(tǒng)、高效、經(jīng)濟，適用于飼料樣品中復(fù)雜轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測。

為使轉(zhuǎn)基因成分檢測更真實可靠，用于dPCR 檢測的樣品多需進(jìn)行前處理，往往會導(dǎo)致實驗結(jié)果偏差。Fu等[54]探索了一種無預(yù)處理的dPCR 檢測方法，該方法對9 種轉(zhuǎn)基因玉米（MON810、MON863、TC1507、MIR604、MIR162、GA21、T25、NK603 和Bt176）的檢出限為0.1%（低于歐盟法規(guī)規(guī)定的標(biāo)識閾值），9個樣品間的特異性和穩(wěn)定性一致，實驗室內(nèi)和實驗室間的重復(fù)性均較好，可以更靈敏、特定而穩(wěn)定地檢測國際貿(mào)易產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分。

由于克服了PCR 抑制和依賴于外部標(biāo)準(zhǔn)曲線等問題，近年來dPCR 被認(rèn)為是一種新的qPCR 替代技術(shù)，對目標(biāo)DNA/RNA 進(jìn)行絕對定量，在轉(zhuǎn)基因生物的定量檢測、外源基因拷貝數(shù)分析以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方面具有重要作用，可為飼料生產(chǎn)和牧場生物技術(shù)可追溯性提供指導(dǎo)。

4.4 畜禽產(chǎn)品質(zhì)量分析

4.4.1 畜禽產(chǎn)品中病原菌污染檢測 動物病原體可能會對人類安全和健康帶來影響，甚至引發(fā)社會衛(wèi)生安全事件，因此有必要快速準(zhǔn)確地對畜禽產(chǎn)品中的病原體進(jìn)行監(jiān)測，為食品安全評價和潛在風(fēng)險控制提供參考。

戊型肝炎病毒（HEV）的食源性傳播已成為人們關(guān)注的問題，采用RT-qPCR 技術(shù)可以進(jìn)行靈敏地檢測與定量。Martin-Latil 等[55]比較了微流控RT-dPCR 與RT-qPCR 檢測豬肝制品中HEV 的性能，發(fā)現(xiàn)RT-dPCR的靈敏度與RT-qPCR 相似，但RT-dPCR 所需體積僅為RT-qPCR 的1/13，所需成本約為1/2，且不受抑制劑顯著影響。

目前食品中腸出血性大腸桿菌（EHEC）的常用鑒定方法是基于PCR 技術(shù)篩選富集培養(yǎng)物中特征性基因標(biāo)記，當(dāng)食品基質(zhì)復(fù)雜時可能會出現(xiàn)假陽性。McMahon 等[56]建立了一種能同時檢測單個細(xì)菌中Stx和Eae基因的多重單細(xì)胞ddPCR 方法，在絞碎牛肉/豬肉中可以準(zhǔn)確地鑒定出EHEC，既減少了假陽性，又降低了檢測成本，并提高了檢測速度和準(zhǔn)確性。

鼠傷寒沙門氏菌是一種零容忍的食源性致病菌。Wang 等[57]比較了qPCR 和ddPCR 2 種方法檢測該病原菌的效果，發(fā)現(xiàn)ddPCR 擁有更高的靈敏度（10-4ng/μL或102CFU/mL）、更少的預(yù)培養(yǎng)時間（節(jié)省2 h）和更強的抑制劑耐受性，為食源性鼠傷寒沙門菌的檢測提供了一種新方法。

人畜共患病原菌對食品質(zhì)量和公眾健康構(gòu)成極大威脅，qPCR 是目前檢測食源性致病菌的常用有效手段。以上研究結(jié)果顯示，dPCR 技術(shù)更加靈敏可靠，為畜禽產(chǎn)品中病原菌檢測提供了一種新的方法。

4.4.2 畜禽產(chǎn)品成分分析 近年來，經(jīng)常出現(xiàn)食品產(chǎn)品與標(biāo)簽不符、以次充好等商業(yè)欺詐問題，其中肉類產(chǎn)品摻假是食品行業(yè)的重大問題，需要可靠的技術(shù)來監(jiān)控。相對于qPCR 具有明顯優(yōu)勢的dPCR 技術(shù)在畜禽產(chǎn)品成分分析中的研究與應(yīng)用日益受到關(guān)注。Cai 等[58]以dPCR 技術(shù)為基礎(chǔ)，建立了一種高精度的針對肉制品中豬肉和雞肉的定量方法，發(fā)現(xiàn)生肉重與DNA 含量、DNA 含量與DNA 拷貝數(shù)的關(guān)系均接近線性，能夠根據(jù)DNA 拷貝數(shù)建立計算生肉重量的公式，并用已知比例的豬肉和雞粉樣品驗證了該方法的準(zhǔn)確性和適用性。王珊等[59]和陳晨等[60]建立了定量檢測羊肉制品中羊源和豬源性成分的ddPCR 方法，能夠更好地鑒別摻假。楊華等[61]建立了針對牛、豬、雞和鴨肉的多重ddPCR檢測技術(shù)，能夠快速并準(zhǔn)確判斷樣品中是否存在牛肉及其在牛肉制品中摻入的雞肉、鴨肉和豬肉。苗麗等[62]利用ddPCR 定量檢測系統(tǒng)準(zhǔn)確檢測肉及肉制品中羊源性成分的含量，且具有較強的抗干擾能力。Ren 等[63]采用ddPCR 方法檢測了羊肉制品中雞肉含量，并引入一個常數(shù)將拷貝數(shù)與肉重的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)換，該方法比qPCR 更精確、更靈敏，且在不同的熱處理和超高壓條件下具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，同時還證實了肉的不同部位對ddPCR 方法的定量準(zhǔn)確度沒有影響。Shehata等[64]用ddPCR 方法檢測了食品和飼料中牛肉、豬肉、雞肉和火雞肉成分，證實了該方法的特異性、重復(fù)性和再現(xiàn)性，牛肉和火雞肉檢測靈敏度為0.05%～3.0%，豬肉和雞肉為0.01%～1.0%。Cai 等[65]開發(fā)了一個雙液滴數(shù)字PCR（dddPCR）檢測和量化系統(tǒng)，在單一反應(yīng)管中同時鑒定和量化含牛肉和豬肉混合物的肉制品，認(rèn)為該檢測和定量系統(tǒng)適用于肉制品的質(zhì)量控制和常規(guī)分析。李偉琦等[66]也建立了特異、靈敏和通用的火雞源性成分dPCR（ddPCR 和芯片式dPCR）定量檢測方法，對混合鮮肉中火雞源性成分的質(zhì)量百分比定量檢測限為5%。

通常用于確定肉品種類的基因主要來自線粒體，但由于每個細(xì)胞的線粒體DNA 含量有5 倍的組織間差異，導(dǎo)致物種DNA 含量低估（-70%）或高估（+160%），因此不適合將線粒體DNA 作為物種定量的靶標(biāo)。Floren 等[67]開發(fā)了一種以核F2 基因為靶標(biāo)，對加工肉制品中的牛肉、馬肉和豬肉成分進(jìn)行精確定量的兩步ddPCR 方法，認(rèn)為該方法優(yōu)于qPCR 法，且在14 個不同的物種中證實了其特異性，定量限（LOQ）和檢測限（LOD）分別為0.01% 和0.001%，可作為生產(chǎn)系統(tǒng)質(zhì)量保證和控制的參考。

5 小結(jié)與展望

眾多研究結(jié)果顯示，dPCR 具有快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點，與qPCR 相比，對低豐度DNA 更為敏感和特異，大大提高了抑制劑存在情況下計算單個分子和解析少量拷貝的精度，可用來檢測復(fù)雜樣品中微量甚至痕量靶核酸。dPCR 的靈敏度取決于檢測器的靈敏度、PCR 擴增效率以及反應(yīng)單元的數(shù)目，隨著更低豐度DNA 檢測以及提高動態(tài)范圍的需求，需要提供更多數(shù)字分區(qū)的平臺。目前，dPCR 技術(shù)在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用正得到廣泛認(rèn)可，并在提高檢測限和實驗室間重現(xiàn)性方面具有相當(dāng)大的前景。

考慮到機器和樣本試劑成本，dPCR 目前比qPCR更貴，擁有dPCR 儀器的實驗室比較有限，然而隨著商業(yè)化dPCR 儀器的發(fā)展，預(yù)期成本將逐步下降。另外，該技術(shù)通量不高，操作比較復(fù)雜，存在一定的假陽性，而且還沒建立dPCR 相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，因此，dPCR 作為一項新的技術(shù)，還存在許多問題需要解決。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步與革新，如低成本芯片的制作、液滴生成和PCR 擴增的集成、自動化程度的提高等，該方法定將會得到更加廣泛的應(yīng)用。