李巖利，胡睿智，譚繼君，伍小松,2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128）

白藜蘆醇（RES）的化學(xué)名稱為反式-3,4′,5-三羥基二苯乙烯，由2 個芳香環(huán)組成且通過亞甲基橋連接。RES 最早于1939 年被 Takaoka 從白葉藜蘆的根部分離出而被發(fā)現(xiàn)[1]，是一種天然的植物多酚，在松樹、花生和大豆等植物中廣泛存在[2]。目前研究已證實(shí)RES 具有抗氧化[3]、抗炎[4]、抑菌[5]、抗病毒[6]、改善脂肪沉積[7]、能量和脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)[8]的作用，RES 與氧化損傷和心血管疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[9-10]。本文就RES的生理功能及其潛在作用機(jī)理進(jìn)行總結(jié)，并結(jié)合其在豬生產(chǎn)方面的研究報(bào)道，探討其作為功能性飼料添加劑改善豬生產(chǎn)性能的應(yīng)用前景。

1 RES 的來源、合成和提取工藝

RES 有順式和反式2 種同分異構(gòu)體，順式RES 在自然界中不穩(wěn)定，極易轉(zhuǎn)化為其反式異構(gòu)體，因此，通常所說的RES 往往是其反式結(jié)構(gòu)。RES 的分子式為C14H12O3，相對分子質(zhì)量為228，為無色針狀晶體，不溶于水，易溶于甲醇、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑，熔點(diǎn)為256～257℃[11]。RES 的2 種異構(gòu)體如圖1 所示。

圖1 RES 的結(jié)構(gòu)式

當(dāng)植物應(yīng)對外界傷害或真菌攻擊時，會產(chǎn)生RES來抵抗外界傷害帶來的影響[12]。RES 在植物體內(nèi)的合成通過苯丙烷途徑完成[13]。如圖2 所示，以苯丙氨酸作為合成RES 的起始底物，苯丙氨酸解氨酶（PAL）為催化劑，經(jīng)過非氧化脫氨轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，反式肉桂酸又經(jīng)過肉桂酸-4-羥化酶（C4H）的催化，生成對香豆酸（p-CA），再經(jīng)4-香豆酰輔酶A 連接酶（4CL）的催化作用，將p-CA 與輔酶A（CoA）的泛酸基團(tuán)連接，生成4-香豆酰CoA，最后在RES 合酶（STS）的催化下，4-香豆酰CoA 和丙二酰CoA 結(jié)合生成RES。對于某些植物含酪氨酸裂解酶（TAL），可直接催化酪氨酸（Tyr）而產(chǎn)生p-CA，再經(jīng)4CL、STS 催化過程最終生成RES[14]。其中，STS 是整個RES 合成途徑的關(guān)鍵酶，底物丙二酰CoA 是其限制性因素[15]。當(dāng)植物處于逆境威脅的情況下，才會激活STS 催化的這一合成途徑[16]。

圖2 白藜蘆醇的生物合成途徑[13-14]

提取RES 時因溶劑不同而得到的提取率不同。單輝君等[17]研究表明，不同溶劑提取RES 的效率為甲醇＞95%無水乙醇＞乙酸乙酯＞水。提取RES 的方法包括有機(jī)溶劑提取、堿提取、酶解提取、超聲提取、微波提取、超臨界CO2提取等。姚慶收等[18]用有機(jī)溶劑提取法、堿提取法和超聲提取法從花生根部及其愈傷組織中提取RES，其中超聲提取法的提取率最高，且操作簡單、用時短。張青松[19]用有機(jī)溶劑提取、酶解、超聲提取、超臨界CO2提取RES，其中超臨界CO2提取的純度最高，但提取率最低。瞿衛(wèi)林等[20]用酶輔助提取RES，提取率較有機(jī)溶劑提取、堿提取和超聲提取的常規(guī)提取方法提高3～5 倍。因此，生產(chǎn)中可選擇使用超臨界CO2提取，加酶輔助提取的方法獲得的RES 純度和提取率較高。

微生物合成和化學(xué)合成RES 也是得到RES 較常用的方法。微生物合成RES 主要是通過將4CL和STS在微生物中表達(dá)，把香豆酸添加到培養(yǎng)基中作為前體物質(zhì)，來實(shí)現(xiàn)RES 的微生物合成[21]，目前所利用的微生物主要是大腸桿菌。董良媛[22]通過用大腸桿菌BL21 將葡萄RS基因構(gòu)建pET22b-RS 表達(dá)載體，來轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（E.coliBL21，DE3），再通過添加p-CA 和丙二酰CoA 后獲得產(chǎn)量為25.2 mg/L 的RES。Watts 等[23]利用轉(zhuǎn)化有阿拉伯?dāng)M南芥的4CL基因和落花生的STS基因的大腸桿菌JM109 菌株，以p-CA 為底物，得到了100 mg/L 的RES。RES 的人工合成方法也是合成RES的可行辦法且早已受到各國學(xué)者的關(guān)注。目前化學(xué)合成RES 的主要方法：①Witting 及Witting-Homor 路線合成，此方法所需條件溫和，產(chǎn)物易分離，研究人員多利用此種方法來合成二苯乙烯類化合物，已被廣泛應(yīng)用[24]。②Perkin 反應(yīng)，此方法可得到單一的白藜蘆醇產(chǎn)物，很好地保持其立體構(gòu)型[25]。③Herk 反應(yīng)，此方法的關(guān)鍵步驟是通過Herk 反應(yīng)在2 個苯環(huán)之間形成碳碳雙鍵，產(chǎn)物為單一的RES[26]。

2 RES 的生理功能

2.1 抗氧化和清除自由基作用 多酚物質(zhì)中酚羥基的數(shù)目與其抗氧化能力有關(guān)[27]，RES 分子中的3 個酚羥基均能清除自由基?；钚匝酰≧OS）含有未成對的電子或基團(tuán)，RES 的酚羥基可失去一個氫質(zhì)子，將其轉(zhuǎn)移給ROS，ROS 接受質(zhì)子后失去了氧化性質(zhì)，同樣失去質(zhì)子的2 個白藜蘆醇分子又可以互相共用電子對，發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，從而起到清除自由基的作用。RES 分子中的4'-羥基基團(tuán)與苯環(huán)形成共振效應(yīng)連接對二苯乙烯骨架，使得4'-羥基基團(tuán)有很強(qiáng)的反應(yīng)活性，是RES 發(fā)揮抗氧化作用的重要基團(tuán)[28]。RES 能夠清除氧自由基和羥自由基，且有體外試驗(yàn)表明其清除過氧化亞硝酸離子（ONOO-）的能力強(qiáng)于維生素C[29]。體外試驗(yàn)中，通過將官能團(tuán)逐次引入苯環(huán)，發(fā)現(xiàn)RES 的3 個酚羥基均具有抗氧化作用，且酚羥基數(shù)量減少會降低其抗氧化活性[30]。潘潤天[31]通過對比RES、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）和維生素C 在體外清除羥基自由基、ABTS 自由基、DPPH 自由基和抑制亞油酸過氧化的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RES 清除羥基自由基和抑制亞油酸過氧化的能力最強(qiáng)，且顯著高于BHT 和維生素C。

當(dāng)生物機(jī)體受到有害刺激時，會產(chǎn)生過量ROS，使原本存在的氧自由基動態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致機(jī)體組織損傷[32]。機(jī)體內(nèi)存在2 種抗氧化系統(tǒng)：①非酶參與的抗氧化系統(tǒng)，通過維生素C、維生素E、谷胱甘肽（GSH）等直接作用清除自由基。②需酶參與的抗氧化系統(tǒng)，通過激活Ⅱ相解毒酶等清除自由基。通過雄性小鼠和缺血再灌注損傷大鼠的試驗(yàn)表明，RES 能上調(diào)抗氧化酶的活性，如過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px），同樣可使機(jī)體丙二醛（MDA）含量有所降低[33-34]。

RES 主要通過上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2/ 抗氧化反應(yīng)元件（Nrf2-ARE）信號通路來實(shí)現(xiàn)其在體內(nèi)的抗氧化作用。Nrf2 是細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激時發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的一個重要因子[35]。在正常機(jī)體狀態(tài)下，Nrf2 被胞漿蛋白伴侶分子（Keap1）抑制[36]。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，Keap1 的抑制作用解除，Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合小分子蛋白Maf 后，再結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件（ARE），進(jìn)而啟動Nrf2 下游抗氧化蛋白的轉(zhuǎn)錄，如醌氧化還原酶1（NQO1）、血紅素加氧酶1（HO-1）、SOD、GSH-Px 等，發(fā)揮抗氧化作用[36]。RES 可通過催化還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶（NADPH oxidase，Nox）亞基蛋白水平的下調(diào)抑制其亞基Rac1膜轉(zhuǎn)位和p47phox 磷酸化從而抑制NADPH 氧化酶介導(dǎo)的ROS 生成，對于某些特定底物，RES 可以直接激活沉默信息轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1（SIRT1），也可以通過磷酸二酯酶（PDE）抑制的通路間接激活SIRT1，SIRT1 有助于使叉頭轉(zhuǎn)錄因子（FOXO）上調(diào)SOD2、CAT 和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的水平，從而發(fā)揮抗氧化作用[30,37]。RES 還可通過激活過氧化物酶活化受體Y輔助活化因子1α（PGC-1α），上調(diào)線粒體抗氧化酶表達(dá)，從而降低ROS 生成[38]。此外，通過大鼠心肌細(xì)胞和小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞模型試驗(yàn)表明，RES 可通過上調(diào)磷脂酰肌醇-3 激酶/ 蛋白激酶（PI3K-Akt）信號通路激活Nrf2，發(fā)揮抗氧化作用[39-40]。但同時也有研究表明，RES 在人U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型中可抑制PI3KAkt 信號通路使細(xì)胞免受應(yīng)激損傷[41]，所以對于不同的細(xì)胞類型和刺激因素，RES 對PI3K-Akt 信號通路的調(diào)控存在偏差。RES 還可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路中的胞外信號調(diào)控激酶（ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38 來影響細(xì)胞的抗氧化反應(yīng)[42]。

2.2 抗炎作用 當(dāng)機(jī)體受到炎癥細(xì)胞因子和促炎細(xì)胞因子等有害物質(zhì)的刺激時，機(jī)體內(nèi)一系列的防御性反應(yīng)會被引發(fā)，從而引起炎癥的發(fā)生。機(jī)體內(nèi)適度的炎癥可以清除外源或自身變異的抗原，修復(fù)機(jī)體損傷[43]，但炎癥因子的過度激活會導(dǎo)致機(jī)體組織器官的損傷[44]。有研究表明，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積產(chǎn)生的大量ROS，會導(dǎo)致溶酶體破裂，引起溶酶體酶的釋放，進(jìn)而激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）炎癥通路[45]。NF-κB 是炎癥反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，正常情況下受抑制性亞單位IκB 的抑制作用[46]。當(dāng)外界刺激時，會激活NF-κB 信號通路，NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）等。同時，TNF-α和IL-1β可反過來激活NF-κB 通路[47]。此外，脂多糖、病毒、紫外線和ROS 均能激活NF-κB 通路[48]。RES 可抑制IκBα激酶的降解，阻止NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核來發(fā)揮其抗炎作用[49]。Manna 等[50]研究表明，RES 能抑制不同種類細(xì)胞中NF-κB 的活化，包括U-937、HeLa 和H4，且RES 可以劑量和時間依賴性下調(diào)因TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB 信號通路。Estrov 等[51]研究表明RES 能阻斷IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB 的活化。Adhami 等[52]研究表明，RES 可阻斷IκB 的活化、磷酸化和降解，進(jìn)而抑制NF-κB 通路。RES 還能通過激活A(yù)MPK 信號通路和SIRT1 使NF-κB 去乙?；?，減少其轉(zhuǎn)錄[53]，在敲除SIRT 表達(dá)的角質(zhì)細(xì)胞中，RES 可逆轉(zhuǎn)SIRT1 的表達(dá)從而抑制紫外線誘導(dǎo)的JNK 活化，緩解細(xì)胞炎癥損傷[54]。在以白癜風(fēng)白斑病灶周圍皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞模型中的研究發(fā)現(xiàn)，RES 可通過抑制JNK 和p38的磷酸化來緩解炎癥[55]。此外，RES 還可通過抑制環(huán)氧合酶（COX）和過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）等炎性介質(zhì)的表達(dá)緩解炎癥[53]。RES 抗氧化和抗炎的潛在作用機(jī)理如圖3 所示。

2.3 抑菌作用 RES 作為一種天然的植物抗毒素，對很多細(xì)菌和真菌都具有抑菌作用。李巍偉[56]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)RES 體外作用后的葡萄球菌細(xì)胞壁層次不清，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物消失、出現(xiàn)空泡的現(xiàn)象，表明RES 可破壞葡萄球菌，同樣RES 作用于皮膚蘚菌后也出現(xiàn)核膜斷裂、線粒體內(nèi)有空泡、線粒體呈致密化和髓樣化的特征，表明RES 對皮膚蘚菌有抑菌作用，但對革蘭陰性的大腸桿菌無明顯的抑制作用。RES 可增強(qiáng)抗生素的抗菌活性，如加強(qiáng)氟喹諾酮類抗生素對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的活性[57]。彭如潔[58]通過RES對幽門螺桿菌（Hp）的體外抗菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，31.25 mg/L RES 的單獨(dú)抑菌率與8 mg/L 甲硝銼的抑菌率無顯著差異，RES 與甲硝銼的聯(lián)合抑菌率顯著高于甲硝銼的單獨(dú)抑菌率，且與甲銼聯(lián)合作用時提高了耐藥Hp 對抗生素的敏感性。RES 對一些菌的抑菌效果見表1。但目前來說，RES 抗菌方面的試驗(yàn)研究還有限，其具體機(jī)制尚不清楚。根據(jù)已有的報(bào)道得知其可能的抑菌機(jī)制：①RES與細(xì)菌ATP 酶可逆結(jié)合，進(jìn)而抑制細(xì)菌ATP 水解和合成，從而影響細(xì)菌在體內(nèi)代謝，RES 還可抑制細(xì)菌對糖的代謝而導(dǎo)致細(xì)菌生長抑制[59-60]。②RES 可誘導(dǎo)細(xì)菌DNA 片段化和SOS 應(yīng)激反應(yīng)[61]。③RES 可抑制細(xì)菌生物膜穩(wěn)定性和細(xì)菌鞭毛的合成，降低細(xì)菌的集群效應(yīng)和運(yùn)動特性[62]。

圖3 RES 抗氧化和抗炎的潛在作用機(jī)理[36-42,45-47]

表1 RES 對不同細(xì)菌的最低抑菌濃度和抑菌效果

3 RES 在豬生產(chǎn)上的應(yīng)用

RES 有助于改善動物體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)。豬精子細(xì)胞膜含有多不飽和脂肪酸，在保存過程中會受ROS 影響，使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，從而引起精子質(zhì)膜和頂體的破壞，降低精子的受精能力[65]。范曉騰[66]將RES 應(yīng)用于豬精液的常溫保存中，發(fā)現(xiàn)第5 天的精液能達(dá)到與鮮精ROS 水平一致的效果，而正常保存精液的精子ROS 水平與鮮精相比卻顯著降低。在仔豬上，Zhang 等[67]研究發(fā)現(xiàn)，與未做處理的IUGI 仔豬相比，在患有宮內(nèi)生長遲緩（IUGI）哺乳仔豬的飼糧中添加RES 提高了IUGI 仔豬的飼料利用效率，有效減輕了IUGI 引起的線粒體腫脹和超氧自由基的生成，有效提高了肝臟線粒體DNA 含量、ATP生成量。Ahmed 等[68]研究發(fā)現(xiàn)日糧中添加RES 顯著提高了灌服大腸桿菌和沙門氏菌的仔豬干物質(zhì)消化率和血清免疫球蛋白G（IgG）水平，對飼料轉(zhuǎn)化率有改善作用，降低了TNF 水平，增強(qiáng)了仔豬對沙門氏菌和大腸桿菌的防護(hù)作用。在育肥豬上，Zhang 等[69]通過在日糧中添加300 mg/kg 或600 mg/kg RES 顯著提高了肌肉總抗氧化能力（T-AOC）和GSH-Px 的mRNA 水平，降低了MDA 含量。Zhao 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，RES 能有效抑制豬偽狂犬病毒引起的NF-κB 通路的活化。龐衛(wèi)軍等[70]研究發(fā)現(xiàn)RES 可顯著抑制豬前提脂肪細(xì)胞增殖和分化，減少細(xì)胞內(nèi)脂肪的合成。

綜上所述，RES 在養(yǎng)豬生產(chǎn)中具有以下潛在應(yīng)用價(jià)值：①可作為豬精液常溫保存中較好的抗氧化劑和抗凋亡劑，作為豬精液稀釋液中的營養(yǎng)物質(zhì)添加使用，以增加精子的保存時間和保存效果，提高母豬受精率和仔豬整體質(zhì)量。②作為輔助劑同抗生素共同使用來部分替代抗生素，增強(qiáng)抗生素效果，從而達(dá)到減抗的目的。③商品豬飼糧中可添加適宜比例的RES 來提高其飼料轉(zhuǎn)化率和生長性能等指標(biāo)，增強(qiáng)商品豬的抗病性和肉品質(zhì)，提高經(jīng)濟(jì)效益。

4 小結(jié)與展望

飼用抗生素濫用不僅造成環(huán)境污染，嚴(yán)重威脅食品安全與人類健康，從某種意義上來說也增加了養(yǎng)殖的附加成本。無抗養(yǎng)殖是未來畜牧業(yè)的重要趨勢。RES 具有抗氧化、抗炎、抑菌等多種生物學(xué)功能，可有效改善豬的免疫性能，提高豬的繁殖和生長性能，預(yù)防疾病，改善豬肉品質(zhì)，因此可作為飼用抗生素的潛在替代品應(yīng)用于養(yǎng)豬生產(chǎn)中。但RES 本體在體內(nèi)的生物利用度相對較低，在人類和不同動物模型中均可被迅速吸收、代謝和排泄。因此，利用最新的代謝組學(xué)技術(shù)探究RES 在動物體內(nèi)的代謝，并闡明相關(guān)代謝產(chǎn)物的生理功能對合理利用RES 至關(guān)重要。在當(dāng)前非洲豬瘟背景下，基于RES 及其代謝產(chǎn)物的生理功能及作用機(jī)理將其合理應(yīng)用于提高豬的免疫和抗病力，為養(yǎng)豬生產(chǎn)提供新的選擇與思路。