費曉娟，金美林，盧曾奎，狄 冉，魏彩虹*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050）

綿羊是重要的家畜之一，擁有11 000 年的馴化史，是史上第一個被馴化的游牧動物。根據(jù)綿羊尾型可分為短瘦尾羊、長瘦尾羊、短脂尾羊、長脂尾羊和肥臀羊五類[1]。肥尾羊大約在5 000 年前從瘦尾羊中演化而來，目前肥尾羊數(shù)量已占全世界總羊數(shù)的四分之一[2]。本實驗室前期的研究表明，在哈薩克羊（肥尾羊）和藏羊（瘦尾羊）脂肪組織中有464 個基因差異表達，其中BMP2基因與綿羊脂尾的發(fā)育有關(guān)[3-5]。進一步研究表明，BMP2基因能夠促進綿羊前體脂肪細胞的分化，參與綿羊尾部脂肪沉積，從而影響綿羊尾型發(fā)育[6]。

1965 年 Urist 在成人的脫鈣骨基質(zhì)中提取出一種能誘導異位骨發(fā)生的活性蛋白，并根據(jù)其生物學特性命名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMPs），屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（The Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族[7]。BMPs 家族成員至少有40 個，目前關(guān)于骨代謝的研究最多[8]。BMPs 家族被分為5 個亞型，其中，BMP2與骨的生長和分化相關(guān)，屬于第一類亞型[9-10]。BMPs 是一種參與生物機體機能發(fā)生和調(diào)節(jié)的分泌蛋白，與細胞增殖和分化、細胞凋亡、形態(tài)發(fā)生、器官形成等相關(guān)[11]，BMP2同樣具有廣泛的生物學功能[12-17]。本文就BMP2基因的結(jié)構(gòu)和功能及其參與的信號通路等進行綜述，為進一步研究BMP2基因提供理論依據(jù)。

1 BMP2 基因的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)

1988 年Wozney 等[18]首次克隆出了人的BMP2基因，由3 個外顯子和2 個內(nèi)含子組成，且該基因翻譯起始于第2 外顯子結(jié)束于第3 外顯子[19]。研究表明，不同物種的BMP2基因的編碼區(qū)序列同源性較高[20]。采用Needle 工具（https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）比較不同物種BMP2基因編碼區(qū)核苷酸的同源性（表1），綿羊與牛的BMP2編碼區(qū)核苷酸的同源性最高；山羊與豬、牛和雞的BMP2編碼區(qū)核苷酸序列同源性較高，均在50% 以上；綿羊與雞的BMP2編碼區(qū)核苷酸序列同源性最低。

BMP2 蛋白屬于疏水性蛋白，是由信號肽、前體蛋白和成熟結(jié)構(gòu)域組成的較大前體蛋白。蛋白分泌后去除信號肽，前體蛋白發(fā)生二聚，然后特異性蛋白水解酶將二聚后的前蛋白裂解，釋放成熟區(qū)域。成熟區(qū)域可以與自身或者其他BMP 蛋白二聚，生成具有生物活性的二聚成熟蛋白，從而發(fā)揮生物學功能[21]。成熟的BMP2蛋白是由2 個114 肽亞單位通過二硫鍵共價連接的同二聚體[22-23]。在BMP2 蛋白的羧基末端有一段由 7 個半胱氨酸殘基形成的保守區(qū)域，其中 6 個半胱氨酸形成了3 個分子內(nèi)二硫鍵，第7 個半胱氨酸殘基通過二硫鍵發(fā)揮二聚作用[23]。此外，BMP2單體的核心是一個半胱氨酸結(jié)，由8 反向平行的β-折疊和一個α-螺旋形成，且每個單體只有2 個色氨酸殘基，在骨的修復和誘導過程中發(fā)揮重要的作用[10-11]。

表1 不同物種之間BMP2 基因編碼區(qū)核苷酸序列的比較

2 BMP2 基因的表達

BMP2基因在人和動物的不同器官中均有不同程度表達[24-25]。小鼠BMP2基因在胚胎期的表達模式為胚胎外區(qū)域在第6 天[28]、羊膜的中胚層細胞在第8.5 天[11]、背部神經(jīng)管的外胚層在第8.5～9.5 天[11]、心臟的外心肌層和脊椎頂部的外胚層在第9.5～10.5 天[11]、眼睛、牙齒和胡須在第12.5 天[11]表達。與正常組織相比，BMP2在癌細胞中高表達，可作為人類癌癥、腫瘤等疾病的檢測標志物[26]。BMP2基因同樣在健康組織中表達，如在鯉魚的鰓、腸、肝、脾、腦和血液中都有較高的表達水平，與鰭的發(fā)育或再生相關(guān)[27]。

3 BMP2 的生理功能

BMPs家族通過TGF-β超家族的I 型受體和II 型受體傳遞信號發(fā)揮生物學功能，目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)TGF-β超家族有7 種Ⅰ型受體和 5 種Ⅱ型受體，且均具有絲蘇氨酸激酶活性[29]。BMPs 家族受體由一個短的胞外結(jié)構(gòu)域、一個單一的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個具有活性絲氨酸/蘇氨酸區(qū)域的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域三部分構(gòu)成[23]。BMPs家族受體包括3 種Ⅰ型受體BMPIA型受體、BMPIB型受體和激活素受體（如kinase、ACVRI 和 ALK2 等）；3 種Ⅱ型受體BMPRII、ActRIIA 和ActRIIB。BMPs 蛋白分泌后，BMPs 配體與II 型受體結(jié)合并磷酸化I 型受體，隨后再磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子，形成復合物并轉(zhuǎn)移到細胞核，啟動相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化等生命活動[30-31]。

3.1BMP2與骨形成BMP2屬于特異成骨基因，現(xiàn)已被美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準用于脊椎融合的臨床治療中。BMP2在骨形成的過程中，受其他因子影響。Chio 等[32]在大鼠骨質(zhì)疏松癥體內(nèi)模型中觀察到維生素C 使BMP2的表達增強，抑制大鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。此外，Kovermann 等[17]研究表明，含有BMP2的體外培養(yǎng)基能夠誘導人滑膜源性干細胞形成軟骨，在含有TGF-β1 和BMP2的聯(lián)合培養(yǎng)基中與軟骨形成相關(guān)的聚蛋白多糖（Aggrecan，ACAN）的表達也顯著上調(diào)，更加促進軟骨形成。此外，BMP2/7異二聚體蛋白聯(lián)合低濃度的全反式維甲酸（All-Trans Retinoic-Acid，ATRA）可使小鼠骨髓源巨噬細胞中破骨細胞生成相關(guān)基因的表達下調(diào)，阻斷破骨細胞生成并降低破骨細胞的吸收活性[33]。綜上，這些因子與BMP2之間形成調(diào)控骨發(fā)生的網(wǎng)絡(luò)，為骨疾病的治療提供新的見解。

3.2BMP2與脂肪沉積 將人的骨髓源性干細胞提取、分離并在三維成骨或成脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果顯示在補充了BMP2的三維培養(yǎng)基中形成的脂滴明顯多于其他培養(yǎng)基[34]。對547 例不同體重指數(shù)個體的內(nèi)臟和皮下組織檢測，發(fā)現(xiàn)在肥胖人群中內(nèi)臟組織和皮下組織中BMP2的表達顯著高于健康人群[35]。在體外研究大鼠的肌腱干細胞中脂肪生成機制的過程中，BMP2可磷酸化并激活下游的環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白（cAMPresponse Element Binding Protein，CREB）和Smad 蛋白，隨后上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ2（Peroxisome Proliferator-Activated Receptorγ2，PPARγ2）的表達，從而增強肌腱干細胞脂肪分化的趨勢[36]。這些結(jié)果與Birgit 等[37]的研究結(jié)果一致，均表明BMP2與組織中脂肪沉積相關(guān)。

本課題組使用Illumina Ovine SNP50 芯片，對10個本土綿羊品種進行群體結(jié)構(gòu)分析和基因組選擇分析，發(fā)現(xiàn)這些地方品種分為肥尾和瘦尾2 種類型；用FST和hapFLK 方法分析發(fā)現(xiàn)BMP2基因與綿羊尾型的發(fā)育有關(guān)[4-5]，并確定BMP2可作為綿羊尾型發(fā)育的關(guān)鍵候選基因[38]。此外，有報道稱BMP2可以促進豬前體脂肪的分化[14]。本課題通過構(gòu)建慢病毒載體，將BMP2基因過表達于綿羊前體脂肪細胞中，發(fā)現(xiàn)BMP2基因在mRNA 水平過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome Proliferator-Activated Receptorγ，PPARγ）和脂蛋白脂酶（Lipoprteinlipase，LPL）均上調(diào)，但是蛋白表達水平差異不顯著，推斷BMP2同樣能夠促進綿羊前體脂肪細胞的分化，參與綿羊尾部脂肪沉積，影響綿羊尾型發(fā)育。但是其作用機制尚不清楚，需要進一步研究[6]。

3.3BMP2與生長發(fā)育BMP2是細胞分化和增殖過程中重要的介質(zhì)，BMP2的表達水平與細胞的增殖和凋亡息息相關(guān)。以腸缺血再灌注大鼠為模型，分別在24 h和48 h 處死，發(fā)現(xiàn)灌注大鼠的空腸中BMP2基因和蛋白的表達均顯著上升，且空腸和回腸的細胞數(shù)量增加[39]。同時BMP2通過不同途徑促進小鼠星形膠質(zhì)細胞分化，小鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞經(jīng)過BMP2處理后，激活了轉(zhuǎn)錄共激活因子相關(guān)蛋白（Yes-associated Protein，YAP），并與Smad1/5/8 蛋白相互作用并穩(wěn)定Smad1/5/8 蛋白的表達，從而促進小鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞的分化[39]；在小鼠神經(jīng)干細胞中發(fā)生DNA 損傷的模型中，BMP2通過激活Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子（The Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions，JAK-STAT）信號通路，上調(diào)星形細胞標記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP）的表達，同樣促進衰老細胞的星形膠質(zhì)細胞的分化[40]。此外，當過表達miR-378 時可激活BMP2基因參與的BMP-Smad 信號通路，促進綿羊成肌細胞的增殖[41]。

BMP2還對胚胎發(fā)育過程中器官的形成產(chǎn)生影響，對胚胎發(fā)育是否畸形起決定性作用。用逆轉(zhuǎn)錄病毒RASC-BMP2感染雞胚中腸，發(fā)現(xiàn)在雞胚腸道形成更緊密的卷曲環(huán)，每個循環(huán)管的長度和半徑顯著減少；腸系膜背側(cè)的細胞密度增加，并且其面積明顯減小[42]。在小鼠胚胎發(fā)育過程中，BMP2殘缺會導致前羊膜腔不能閉合，形成畸形羊膜，同時也會造成小鼠心臟發(fā)育缺陷[43]。

3.4BMP2與癌癥 近年來的研究表明，BMP2既可以促進癌癥的發(fā)生又可以抑制癌癥的發(fā)生，這可能是由于細胞種類或者細胞所處的環(huán)境不同，從而出現(xiàn)這一矛盾的結(jié)果。在乳腺癌細胞系MCF-7 中發(fā)現(xiàn)，BMP2基因啟動子甲基化使BMP2表達下調(diào)，增強了乳腺癌細胞的耐藥性，促進癌癥發(fā)生[44]。而將小鼠和人的乳腺癌細胞MCF-7 分別用BMP2處理，結(jié)果顯示BMP2抑制癌細胞的遷移和增殖[45-46]。在鼻咽癌中，sox9與BMP2啟動子結(jié)合，增強了BMP2表達，進而激活了BMP2誘導的mTOR 信號轉(zhuǎn)導，促進鼻咽癌中癌細胞的增殖、遷移和侵襲[47-48]。在小鼠慢性胰腺癌細胞發(fā)現(xiàn)BMP2可增強miR-200 的表達，抑制慢性胰腺癌細胞纖維化[49]。此外，激活素A 直接抑制BMP2誘導的多發(fā)性骨髓瘤細胞系的抗增殖活性，通過設(shè)計BMP2變異體，發(fā)現(xiàn)該變異體對特定的II 型受體表現(xiàn)出增強的受體結(jié)合親和力，進而促進骨生長，這為多發(fā)性骨髓瘤的治療提供新的思路[50]。

4 BMP2 參與的調(diào)控通路

4.1BMP2與PI3K/Akt 信號通路 磷脂酰肌醇3-蛋白激酶（PI3K/AKT）信號通路調(diào)節(jié)細胞的生長發(fā)育，同時介導多種癌癥的發(fā)生。在含有胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠前骨細胞，發(fā)現(xiàn)BMP2只需要磷酸化Akt位點Ser473，就可以促進成骨細胞分化；在不含胎牛血清的培養(yǎng)基中，BMP2需要磷酸化Ser473 位點并使Akt的Thr308 位點去磷酸化來增加成骨細胞的分化[51]。在胰腺癌細胞系panc-1 和胃癌細胞中，BMP-2刺激上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）的發(fā)生，同樣使PIK3下游因子Akt發(fā)生磷酸化，從而促進癌細胞的運動和侵襲[52]?？梢姡珺MP2對Akt的磷酸化，是激活PI3K/Akt 通路的關(guān)鍵。此外，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠軟骨細胞系N1511，并加入50 ng/mLBMP2，發(fā)現(xiàn)BMP2能夠通過PI3K/Akt 抑制細胞的凋亡，深入研究發(fā)現(xiàn)BMP2通過激活PIK3信號，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表達[53]。

4.2BMP2與Smad 信號通路 Smad 信號通路是BMP2的經(jīng)典通路，BMP2蛋白分泌后，配體與II 型受體結(jié)合并激活I(lǐng) 型受體的絲蘇氨酸激酶活性位點，隨后啟動Smad 家族蛋白質(zhì)的信號級聯(lián)。具體來說是Smad1/5/8被BMP2受體復合物磷酸化，然后與Smad4 結(jié)合形成Smad1/5/8Smad4 復合物，復合物再向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運，隨后以組織和發(fā)育階段特有的方式啟動基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細胞的生命活動[54-55]。該通路涉及到BMP2介導的多種細胞調(diào)節(jié)活動。Ahsan 等[56]將惡性外周神經(jīng)鞘瘤（Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors，MPNSTs）細胞用BMP2 I型受體抑制劑LDN-193189 處理，發(fā)現(xiàn)Smad1/5/8 的表達下調(diào)，并且MPNSTs 細胞的活性和侵襲性顯著降低，抑制了MPNSTs 細胞的惡性擴散。在脊椎動物胚胎心臟前體細胞中BMP2和Wnt信號通路下游因子糖原合成酶激酶3β（Glycogen Synthase Kinase 3 beta，GSK3β）促進Smad1 磷酸化，調(diào)節(jié)心臟前體細胞的遷移軌跡，促進心臟的形成[54]。在顱骨缺損模型中發(fā)現(xiàn)，胞外鈣離子可增強BMP-2對Smad 信號通路的磷酸化，使骨鈣素、成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runt-related Transcription Factor2，Runx2）和成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Osterix，Osx）的表達上調(diào)，促進了體內(nèi)骨再生[57]。

4.3BMP2與MAPK 信號通路 促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinases，MAPKs）包括應激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal Kinase，JNK）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellular Regulated Protein Kinases，ERK）和p383 個亞族[58]。該通路同樣參與癌癥的發(fā)生，體內(nèi)外試驗表明抑制BMP2的表達或者抑制p38 的表達會抑制肝癌細胞增殖、遷移、侵襲以及微血管密度和血管生成[59]。同時BMP2通過該通路調(diào)節(jié)細胞分化，在C2C12 間充質(zhì)干細胞中發(fā)現(xiàn)Runx2上游因子p38被BMP2激活，使Runx2的表達上調(diào)，促進間充質(zhì)前體細胞的分化[60]。將原代小鼠顱源性成骨細胞在BMP2培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)，并抑制p38的表達，堿性磷酸酶活性也會降低；抑制JNK 的表達，骨鈣素的表達明顯下調(diào)，從而影響骨分化[61]。此外，Yang 等[62]研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2磷酸化JNK，可以增強成骨細胞分化。

4.4BMP2與PPARγ信號通路PPARs是具有調(diào)節(jié)血糖和脂質(zhì)平衡的一種過氧化物酶體增殖物激活受體，是一種核激素受體和轉(zhuǎn)錄因子，包括PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-δ3種亞型[63]。PPARγ通路在不同的細胞中調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化，在細胞生命活動中起重要的作用。在間充質(zhì)干細胞中PPARγ的激活能夠增強Runx2啟動子的組蛋白激活標記來影響B(tài)MP2的作用，同時PPARγ靶基因啟動子的組蛋白激活標記的表達在一定條件下也可通過BMP2刺激而提高，因此BMP2與PPAR-γ信號通路是相互交叉的，共同調(diào)節(jié)細胞活動[64]。通過構(gòu)建慢病毒載體過表達BMP2與前體脂肪細胞中發(fā)現(xiàn)，PPARγ的表達顯著上調(diào)，促進前體脂肪細胞的分化[6]。此外，在血管平滑肌細胞中PPARγ通過連接上游因子TGF-β1 和BMP2，協(xié)同調(diào)節(jié)細胞增殖和糖代謝[65]。

5 總結(jié)及展望

BMP2基因從發(fā)現(xiàn)至今取得了較大的研究進展，其在組織中的生物學功能基本被明確。BMP2作為最活躍的骨生長因子，現(xiàn)已被應用于臨床治療。目前的研究發(fā)現(xiàn)BMP2在成骨過程中與其他生長因子或成骨基因之間相互作用形成成骨調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這為臨床骨治療提供新的思路。同時BMP2在癌細胞內(nèi)廣泛表達，可作為檢測癌癥的標志物，BMP2基因既可以促進癌細胞的增殖與擴散，又能抑制癌細胞的增長。同樣地，在BMP2介導的癌癥發(fā)生的多條信號通路中，也存在抑制或促進癌細胞的遷移、擴散和增殖，針對這一矛盾結(jié)果，還需要深入研究。本實驗室前期研究表明BMP2可能與綿羊尾部脂肪沉積相關(guān)，影響綿羊尾型的發(fā)育。進一步的研究表明BMP2基因能夠促進綿羊前體脂肪細胞的分化，但是機制尚不明確。后期研究將集中于BMP2在綿羊尾部脂肪沉積的調(diào)控機理，為培育不同尾型的綿羊提供理論基礎(chǔ)。