黃貞偉，張 慶，黃莉莉，張小琴，黃鳴清

福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122

* 通信作者：張小琴，E-mail：2012030@fitcm.edu.cn；黃鳴清，E-mail：hmq1115@126.com

缺血性腦卒中是一種急性腦血管疾病，可導(dǎo)致偏癱，甚至死亡，影響人們生活質(zhì)量，加重社會(huì)負(fù)擔(dān)［1］。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種固有的免疫細(xì)胞，在缺血性腦卒中發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中過(guò)度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞引發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而損傷腦組織［2］。Toll 受體4（TLR4）是Toll 樣受體家族中的一員，是脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的關(guān)鍵受體之一，其在腦內(nèi)主要分布于小膠質(zhì)細(xì)胞，可參與炎癥相關(guān)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)［3］。 絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1／2）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK），可參與調(diào)節(jié)多種生理活動(dòng)，與細(xì)胞炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［4］。 既往研究表明，TLR4／MAPK 信號(hào)通路在缺血性腦卒中引發(fā)以及LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用［5-6］。

片仔癀（Pien Tze Huang，PZH）是我國(guó)一種名貴中成藥，由麝香、牛黃、三七、蛇膽等名貴藥材精制而成，具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛等功效。現(xiàn)代藥理研究也發(fā)現(xiàn)PZH 具有抗腫瘤、解熱抗炎和腦保護(hù)作用［7-8］。劉麗星等［9］發(fā)現(xiàn)PZH 可降低大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠腦內(nèi)IL-6 等促炎因子的表達(dá)水平，減輕腦卒中后神經(jīng)炎癥損傷。 本課題組前期研究也表明PZH可以抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，減輕腦缺血再灌注損傷［10］。以上提示PZH 具有抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)的作用，但是PZH 是否通過(guò)TLR4／MAPK 信號(hào)通路改善小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥損傷未見(jiàn)報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)LPS建立BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥損傷模型對(duì)此進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑

PZH（漳州片仔癀藥業(yè)有限公司）；LPS、MTT（美國(guó)Sigma 公司）；BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；RPMI-1640 完全培 養(yǎng) 基（美國(guó)Gibco 公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；ChamTM SYBR?qPCR Master Mix （南京Vazyme 公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司）；TLR4（美國(guó)SANTA CRUZ 公司）；iNOS（美國(guó)abcam 公司）；βactin、ERK1／2、p-ERK1／2、p38、p-p38、JNK、p-JNK、COX-2 和兔二抗（美國(guó)CST 公司）。

1.2 主要儀器

電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；光學(xué)顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；4 ℃離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）；BIO-RAD 電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)BIO-RAD 公司）；7900H 熒光定量PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）。

1.3 藥物制備

將PZH 研磨至粉末狀，稱(chēng)取一定量粉末，溶于含20% DMSO 的磷酸緩沖鹽中，配制成濃度為25 mg／mL 的母液備用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞（中國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心），培養(yǎng)于RPMI-1640 完全培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液，隔天傳代，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.5 模型建立和分組

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞接種于96 孔板，然后置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，再用LPS 刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞12 h，LPS 終濃度為100 ng／mL。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組，LPS 模型組（100 ng／mL），PZH 低劑量組（0.05 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS），PZH中劑量組（0.10 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS），PZH高劑量組（0.15 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS）。

1.6 MTT 法檢測(cè)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞存活率

將BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞種于96 孔板，種板密度為5×104個(gè)／mL，每孔100 μL，設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 MTT 實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組，LPS 模型組（100 ng／mL），單獨(dú)PZH組（0.05 mg／mL、0.10 mg／mL、0.15 mg／mL），PZH 低劑量組（0.05 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS），PZH中劑量組（0.10 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS），PZH高劑量組（0.15 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS）。 培養(yǎng)12 h 細(xì)胞后更換新的培養(yǎng)基，按照組別加入對(duì)應(yīng)的PZH 和LPS，再將孔板放入37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h，然后取出96 孔板更換新的培養(yǎng)基，再加入MTT（5 mg／mL）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后吸棄培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，置于搖床振蕩10 min，然后使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 處吸光度（A 值），最后根據(jù)A 值計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.7 顯微鏡下觀察BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化

將BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞接種于24 孔板，種板密度為5×104個(gè)／mL，每孔500 μL，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培育12 h 后更換新培養(yǎng)基，按照組別加入對(duì)應(yīng)的PZH 和LPS，繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后取出，置于顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)并拍片。

1.8 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清中促炎因子IL-6 的水平

細(xì)胞種板、造模和給藥方法同“1.7”，然后收集細(xì)胞上清液，于4 ℃離心機(jī)離心（12 000 r／min）5 min，然后取上清。 按照ELISA 法測(cè)定說(shuō)明書(shū)，依次加入樣品／標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體、親和素-過(guò)氧物酶復(fù)合物以及顯色液，最后加入終止液后于450 nm 處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中IL-6 的含量。

1.9 RT-qPCR 法檢測(cè)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 轉(zhuǎn)錄水平

將BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞接種于6 孔板，種板密度為1.6×105個(gè)／mL，每孔2 mL，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培育12 h 后更換新培養(yǎng)基，按照組別加入對(duì)應(yīng)的PZH 和LPS，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后棄上清，用預(yù)冷的PBS 洗滌3 遍后加入TRIzol 提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，然后以該cDNA 為模板，使用擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。 采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5 設(shè)計(jì)促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 以及內(nèi)參GAPDH 的引物序列。 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，退火60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。 相應(yīng)引物序列見(jiàn)表1。

表1 IL-1β、IL-6、TNF-α 和GAPDH 基因引物序列Table 1 Primer sequences of IL-1β，IL-6，TNF-α and GAPDH genes

1.10 Western blot 法檢測(cè)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中炎性蛋白酶COX-2 和iNOS 的水平

細(xì)胞種板、造模和給藥同“1.9”，然后棄上清液，用預(yù)冷的PBS 洗滌3 遍后加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，再加入5%加樣緩沖液，于100 ℃中煮10 min 制備蛋白樣品。 每組取40 μg 蛋白樣品，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）分離蛋白，再將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，然后置于脫脂奶粉（或BSA）中封閉1.5 h。 接著孵育一抗（COX-2、iNOS、β-actin）和相應(yīng)二抗，再置于凝膠成像系統(tǒng)中顯影，最后使用Image Lab 軟件分析圖像。

1.11 Western blot 法檢測(cè)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4／MPAK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

蛋白樣品制備方法同“1.10”。 每組取40 μg 蛋白樣品，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）分離蛋白，再將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，然后置于脫脂奶粉（或BSA）中封閉1.5 h。 然后依次孵育一抗（TLR4、ERK1／2、p-ERK1／2、p38、p-p38、JNK、p-JNK、β-actin）和相應(yīng)二抗，然后置于凝膠成像系統(tǒng)中顯影，最后使用Image Lab 軟件分析圖像。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 計(jì)量資料用（±s）表示，當(dāng)數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布時(shí)，組間比較采用單因素方差分析，如果方差齊則采用LSD-t法，如果方差不齊則采用Games-Howell 法；當(dāng)數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布時(shí)，組間比較則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PZH 和LPS 對(duì)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

采用MTT 法檢測(cè)LPS 和PZH 干預(yù)后BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的存活率。 與正常對(duì)照組比較，LPS（100 ng／mL）刺激BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞12 h 后，細(xì)胞存活率沒(méi)有發(fā)生明顯變化；當(dāng)PZH（0.05、0.10、0.15 mg／mL）單獨(dú)作用或PZH 和LPS 同時(shí)刺激BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞12 h 時(shí)，細(xì)胞存活率仍然沒(méi)有明顯變化。 綜上表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，LPS 和PZH 對(duì)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。 見(jiàn)表2。

表2 PZH 和LPS 對(duì)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響（±s）Table 2 Effect of PZH and LPS on the viability of BV2 microglial cells （±s）

表2 PZH 和LPS 對(duì)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響（±s）Table 2 Effect of PZH and LPS on the viability of BV2 microglial cells （±s）

組別正常對(duì)照組LPS 模型組0.05 mg／mL PZH 組0.10 mg／mL PZH 組0.15 mg／mL PZH 組PZH 低劑量組（0.05 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS）PZH 中劑量組（0.10 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS）PZH 高劑量組（0.15 mg／mL PZH＋100 ng／mL LPS）n66666666存活率／%100.00±4.40 102.97±9.89 95.52±15.71 101.07±8.73 107.47±7.55 106.47±4.74 100.24±4.20 103.94±8.38

2.2 PZH 對(duì)LPS 誘導(dǎo)后BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞在LPS 刺激12 h 后，細(xì)胞胞體變大，細(xì)胞突起增多變長(zhǎng)，表明細(xì)胞被激活；而加入不同濃度PZH 干預(yù)后，BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞突起明顯減少，表明PZH 可抑制BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，見(jiàn)圖1。

圖1 PZH 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）Figure 1 Effect of PZH on the morphology of LPS-induced BV2 microglial cells （×200）

2.3 PZH 對(duì)LPS 誘導(dǎo)后BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子IL-6 表達(dá)的影響

采用ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-6 的水平。與正常對(duì)照組比較，BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞在LPS 刺激12 h后，IL-6 表達(dá)水平明顯上升（P＜0.001）；與LPS 模型組比較，在給予不同濃度的PZH（0.05、0.10、0.15 mg／mL）共同干預(yù)12 h 后，IL-6 表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）。 見(jiàn)表3。

2.4 PZH 對(duì)LPS 誘導(dǎo)后BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎因子IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 水平的影響

RT-qPCR 法檢測(cè)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α 轉(zhuǎn)錄水平。 與正常對(duì)照組比較，LPS 刺激12 h 后，BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β（P＜0.001）、IL-6（P＜0.001）和TNF-α（P＜0.01）的mRNA 水平明顯上升；與LPS 模型組比較，不同濃度的PZH 可明顯降低細(xì)胞中IL-1β（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）、IL-6（P＞0.05，P＜0.01，P＜0.001）和TNF-α（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.001）的mRNA 水平。 見(jiàn)表4。

表3 PZH 對(duì)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6 的影響（±s）Table 3 Effect of PZH on the IL-6 secretion of BV2 microglial cells （±s）

表3 PZH 對(duì)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6 的影響（±s）Table 3 Effect of PZH on the IL-6 secretion of BV2 microglial cells （±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1） P＜0.001；與LPS 模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01；與PZH 低劑量組比較，4） P＜0.05。Note: Compared with the normal control group, 1) P＜0.001;Compared with the LPS model group, 2) P＜0.05, 3)P＜0.01; Compared with the low-dose PZH group, 4)P＜0.05.

IL-6／（pg／mL）56.80±1.79 1 240.39±15.831）843.50±51.332）597.30±69.442）394.97±59.403）4）組別正常對(duì)照組LPS 模型組PZH 低劑量組PZH 中劑量組PZH 高劑量組n33333

表4 PZH 對(duì)LPS 誘導(dǎo)后BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 水平的影響（±s）Table 4 Effect of PZH on the mRNA levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in LPS-induced BV2 microglial cells （±s）

表4 PZH 對(duì)LPS 誘導(dǎo)后BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 水平的影響（±s）Table 4 Effect of PZH on the mRNA levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in LPS-induced BV2 microglial cells （±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1） P＜0.001，2） P＜0.01；與LPS 模型組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01，5） P＜0.001；與PZH 低劑量組比較，6） P＜0.001。Note: Compared with the normal control group, 1) P＜0.001, 2) P＜0.01; Compared with the LPS model group, 3) P＜0.05, 4) P＜0.01, 5) P＜0.001; Compared with the low-dose PZH group, 6) P＜0.001.

TNF-α mRNA 1.00±0.20 7.61±1.592）2.71±0.474）2.39±0.994）0.88±0.095）組別正常對(duì)照組LPS 模 型 組PZH 低劑量組PZH 中劑量組PZH 高劑量組n33333 IL-1β mRNA 1.00±0.06 749.24±77.731）589.43±89.813）469.66±73.094）188.41±20.965）IL-6 mRNA 1.00±0.07 223.77±19.401）208.15±12.11 162.79±23.274）73.31±10.045）6）

2.5 PZH 對(duì)LPS 誘導(dǎo)后BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中炎性蛋白酶COX-2 和iNOS 表達(dá)的影響

Western blot 法檢測(cè)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)中COX-2 和iNOS 蛋白表達(dá)水平。 與正常對(duì)照組比較，LPS刺激12 h 后，BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中COX-2 和iNOS 蛋白水平均明顯增加（P＜0.001，P＜0.001）；與LPS 模型組比較，不同濃度PZH（0.05、0.10 和0.15 mg／mL）共同干預(yù)12 h 時(shí)，PZH 可明顯降低細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)水平（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.001）以及iNOS 蛋白表達(dá)水平（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），見(jiàn)表5 和圖2。

表5 PZH 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中COX-2 和iNOS 蛋白表達(dá)的影響（±s）Table 5 Effect of PZH on the protein expression of COX-2 and iNOS in LPS-induced BV2 microglial cells （±s）

表5 PZH 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中COX-2 和iNOS 蛋白表達(dá)的影響（±s）Table 5 Effect of PZH on the protein expression of COX-2 and iNOS in LPS-induced BV2 microglial cells （±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1） P＜0.001；與LPS 模型組比較，2）P＜0.01，3）P＜0.001；與PZH 低劑量組比較，4） P＜0.05，5） P＜0.01。Note: Compared with the normal control group, 1) P＜0.001;Compared with the LPS model group, 2) P＜0.01, 3)P＜0.001; Compared with the low-dose PZH group, 4)P＜0.05, 5) P＜0.01.

iNOS 蛋白1.00±0.00 2.28±0.411）1.47±0.292）1.17±0.242）1.12±0.062）組別正常對(duì)照組LPS 模型組PZH 低劑量組PZH 中劑量組PZH 高劑量組n33333 COX-2 蛋白1.00±0.00 4.23±0.251）3.01±0.152）2.33±0.172）4）1.13±0.223）5）

圖2 PZH 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中COX-2和iNOS 蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of PZH on the protein expression of COX-2 and iNOS in LPS-induced BV2 microglial cells

2.6 PZH 對(duì)LPS 誘導(dǎo)后BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4／MAPK 信號(hào)通路的影響

Western blot 法檢測(cè)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4／MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。 與正常對(duì)照組比較，LPS 刺激12 h 后，BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4（P＜0.05）、p-ERK1／2（P＜0.01）、p-p38（P＜0.01）表達(dá)水平明顯上升；與LPS 模型組比較，不同濃度的PZH 可抑制TLR4（P＞0.05，P＜0.05，P＜0.05）、p-ERK1／2（P＞0.05，P＜0.05，P＜0.01）、p-p38（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）蛋白表達(dá)。 LPS 刺激后BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中p-JNK 有一定上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），PZH 對(duì)p-JNK 蛋白表達(dá)則無(wú)明顯影響。 見(jiàn)表6 和圖3。

表6 PZH 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4／MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）Table 6 Effect of PZH on the protein expression of TLR4／MAPK signal pathway-related proteins in LPS-induced BV2 microglial cells （±s）

表6 PZH 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4／MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）Table 6 Effect of PZH on the protein expression of TLR4／MAPK signal pathway-related proteins in LPS-induced BV2 microglial cells （±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與LPS 模型組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01。Note:Compared with the normal control group,1)P＜0.05,2)P＜0.01;Compared with the LPS model group,3)P＜0.05,4)P＜0.01.

p-p38 蛋白1.00±0.00 2.09±0.282）1.32±0.363）0.99±0.284）0.81±0.264）組別正常對(duì)照組LPS 模型組PZH 低劑量組PZH 中劑量組PZH 高劑量組n33333 TLR4 蛋白1.00±0.00 1.55±0.071）1.37±0.24 1.16±0.203）1.09±0.233）p-ERK1／2 蛋白1.00±0.00 2.10±0.072）1.44±0.24 1.00±0.033）0.88±0.044）p-JNK 蛋白1.00±0.00 1.24±0.17 1.25±0.11 1.13±0.05 1.25±0.11

圖3 PZH 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4／MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of PZH on the protein expression of TLR4／MAPK signaling pathway-related proteins in LPS-induced BV2 microglial cells

3 討 論

神經(jīng)炎癥反應(yīng)是缺血性腦卒中發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中一個(gè)非常重要的分子機(jī)制，參與腦缺血再灌注損傷，造成腦內(nèi)組織壞死、水腫，最終導(dǎo)致機(jī)體多重功能損傷。 小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)的巨噬細(xì)胞，約占大腦膠質(zhì)細(xì)胞的10%～20%，正常情況下激活的小膠質(zhì)細(xì)胞具有維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的重要生理作用，但是在缺血性腦卒中發(fā)生后過(guò)度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放促炎因子和炎性蛋白酶，如IL-6、COX-2 和iNOS 等，參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)并損傷周?chē)窠?jīng)元。 而且，損傷的神經(jīng)元細(xì)胞會(huì)釋放出毒性物質(zhì)再次刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)一步加重神經(jīng)炎癥反應(yīng)［11-12］。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞引發(fā)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，可減輕神經(jīng)炎癥造成的損傷，且有益于神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)，這在缺血性腦卒中的治療及康復(fù)過(guò)程中具有重要的意義。

IL-1β、IL-6 和TNF-α 是小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥損傷過(guò)程中重要的炎癥因子，參與炎癥信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的啟動(dòng)和放大以及炎癥反應(yīng)損傷，其表達(dá)水平代表神經(jīng)炎癥反應(yīng)損傷的程度［13］。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)LPS 刺 激 后，BV2 小 膠 質(zhì) 細(xì) 胞 中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 水平明顯上升，促炎因子IL-6 分泌大量增加；PZH 干預(yù)后，BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 水平明顯下降，抑制LPS 誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6。 COX-2 是將花生四烯酸轉(zhuǎn)化成前列腺素的一種限速酶，后者在參與調(diào)控慢性和急性炎癥中扮演重要角色［14］。 iNOS 是NO 合成的關(guān)鍵酶，炎癥反應(yīng)發(fā)生后iNOS 高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)合成大量的NO 以參與炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致自由基形成、血腦屏障通透性增加，進(jìn)而加重腦損傷［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在LPS 刺激后，BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)COX-2 和iNOS 蛋白，PZH 干預(yù)可以顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)COX-2 和iN OS。 總之，結(jié)果表明PZH 可抑制LPS 誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

為了闡明PZH 抑制LPS 誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-6、COX-2 和iNOS 表達(dá)的機(jī)制，本研究進(jìn)一步探究了PZH 對(duì)信號(hào)通路TLR4／MAPK 的影響。研究發(fā)現(xiàn)，LPS 與小膠質(zhì)細(xì)胞膜上的TLR4 受體相結(jié)合后可促進(jìn)TLR4 高表達(dá)，并且在髓樣分化因子（MyD88）的作用下激活MAPKs（ERK1／2、JNK 和p38 MAPK）信號(hào)通路，而MAPKs 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥應(yīng)答中扮演重要角色，與IL-6、iNOS 和COX-2 等一系列促炎因子和炎性蛋白酶的大量合成釋放密切相關(guān)［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在LPS刺激BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞后，TLR4 表達(dá)增加，且磷酸化MAPKs 水平升高，即TLR4／MAPK 信號(hào)通路被激活。 PZH 的干預(yù)則可明顯降低LPS 誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4 的表達(dá)，并且抑制MAPKs 磷酸化，即降低了p-ERK1／2 和p-p38 蛋白的表達(dá)水平，但是PZH 對(duì)p-JNK 蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響，結(jié)果提示PZH 可抑制LPS 誘導(dǎo)的TLR4／MAPK 信號(hào)通路的激活。

綜上所述，PZH 可能是通過(guò)抑制TLR4／MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNFα 轉(zhuǎn)錄，降低促炎因子IL-6 以及促炎性蛋白酶COX-2、iNOS 的表達(dá)，發(fā)揮其改善LPS 誘導(dǎo)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥損傷的作用。 本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究PZH 治療腦卒中的機(jī)制以及其臨床應(yīng)用提供依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。