裴 飛，王雪冬，李寶龍，唐 強，朱路文

1 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001；

2 黑龍江中醫(yī)藥大學針灸推拿學院暨康復學院，黑龍江 哈爾濱150001

* 通信作者：朱路文，E-mail：zhuluwen1983@126.com

缺血性腦卒中是神經功能障礙的主要原因，給患者、護理人員，以及社會帶來重大負擔。 對于缺血性腦卒中主要采用藥物以及針灸、推拿、運動等康復手段治療，尤其是運動康復療法在臨床中對于缺血性腦卒中有很好的治療效果。 朱路文等［1］研究表明腦缺血后神經功能恢復的加快可能通過針康法（頭穴叢刺長留針結合現代康復方法）上調缺血腦組織血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達而實現；孫國劍等［2］也發(fā)現電針療法與運動訓練都能夠提高缺血再灌注大鼠大腦皮層中VEGF mRNA 表達量，而且兩者結合效果更好。 運動預處理目前也是研究的熱點，動物研究表明，運動預處理對腦缺血有益的作用，包括提高存活率、減輕氧化損傷、改善腦血流量和維持神經血管完整性［3-5］，但是沒有研究證明運動預處理對于腦缺血再灌注大鼠VEGF、神經元核心抗原（neuronal nuclear antigen，NeuN）的影響。 因此，本實驗欲探討運動預處理對于腦缺血再灌注大鼠VEGF、NeuN 的影響，從而為腦卒中的預防機制提供動物實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

1.1.1動物 健康清潔級Sprague-Dawley 雄性大鼠96 只，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物許可證號為SCXK（遼）2015-0001，體質量（220±20） g，月齡3 個月。 飼養(yǎng)條件：SPF 級實驗中心，安靜環(huán)境、室溫20～25 ℃，濕度為50%～60%，清潔級飼養(yǎng)，12 h 明暗光照交替，晝夜循環(huán)，通風良好，大鼠自由進食進水，每日固定點喂食。

1.1.2 分組 采用隨機數字表法將大鼠隨機分為假手術組、模型組、運假組（運動預處理與假手術組）和運模組（運動預處理與模型組），每組24 只。 每組按再灌注24 h、3 d 后又分為2 個亞組，每個亞組12 只。實驗所有大鼠處置方法均符合小動物倫理。

1.2 主要器材和試劑

動物實驗跑臺（安徽正華生物儀器設備有限公司）；CX41RF 顯微鏡（OLYMPUS 公司）；HM525NX U冷凍切片機和Excelsior AS 自動組織脫水機（上海賽默飛世爾儀器有限公司）；WB 系統(tǒng)（BIO-RAD 公司）；VEGF（Affinity Biosciences，Ab-AF5131）；NeuN（Affinity Biosciences，Ab-DF6145）；二抗：山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司，ZB-2301）；Actin（bioss，bs-0061R）；4%多聚甲醛PBS 溶液（安徽雷根生物技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1模型制備 模型組和運模組大鼠術前12 h禁食不禁水，采用Longa 改良線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，2 h 后將線栓緩慢拔出至頸總動脈主干分叉處。6 h 后采用改良的Bederson 標準進行神經功能初步評分，即：①0 分，無神經功能缺失體征；②1 分，提尾時損傷對側前肢屈曲；③2 分，前肢屈曲及對側抵抗力下降；④3 分，向對側轉圈；⑤4 分，向對側轉圈及意識障礙。 評分為1～3 分的大鼠納入本次實驗。 假手術組和運假組大鼠造模方法同上，但線栓僅從頸總動脈插入約10 mm 以后即拔出，不能阻塞大腦中動脈血流供應。

1.3.2處理方法 模型組與假手術組不給予任何治療。 運模組和運假組給予跑臺訓練，先給予適應性跑臺訓練，速度10 m／min，每天訓練20 min，持續(xù)3 d；正式性跑臺訓練：速度15 m／min，每天訓練30 min，坡度為0，每周訓練6 d，連續(xù)訓練3 周。 運模組和運假組正式訓練3 周以后，4 組大鼠同時進行造模處理，分別在再灌注24 h、3 d 后對指標進行觀察及取材。

1.4 檢測指標及取材

1.4.1改良神經功能評分（modified neurologic severity score，mNSS） 參照文獻［6］，分別在再灌注24 h、3 d 后進行檢測，包括：①運動測試：包括提尾測試和行走測試；②感覺測試：包括放置測試和本體感覺測試；③平衡木測試；④反射消失和異常運動：包括耳廓反射，角膜反射，驚恐反射，癲癇、肌陣攣、肌張力異常4 個方面評估大鼠神經功能缺損程度，總分越高表明損傷程度越重。

1.4.2取材及標本處理 再灌注24 h、3 d 以后，每組取6 只大鼠，大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，從心尖以4%多聚甲醛磷酸鹽（PBS）緩沖液（pH＝7.4，4 ℃）進行緩慢灌注后快速斷頭取腦。 分離缺血側腦組織，然后放入4%多聚甲醛PBS 溶液中固定48 h 后，取視交叉和其后4 mm 處兩點，切取腦冠狀薄片，厚度約4 mm，脫水，常規(guī)石蠟包埋。

再灌注24 h、3 d 以后，對各組其余的6 只大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，快速取缺血側鮮腦皮層，置于液氮中快速降溫，然后迅速放入-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3免疫組化染色檢測VEGF 表達情況 將每組大鼠腦組織石蠟切片，切片厚度為3～5 μm 粘附在防脫玻片上，56～60 ℃烤片2 h。 脫蠟至水，高溫抗原修復，PBS 沖洗3 min×3 次，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，PBS 沖洗3 min×3 次，滴加山羊血清封閉液，37 ℃30 min。 加VEGF 一抗（1∶100），4 ℃過夜?；謴椭潦覝睾螅琍BS 沖洗3 min×3 次。滴加即用型山羊抗兔二抗，室溫孵育20 min，PBS 沖洗3 min×3 次，DBA 顯色5～10 s，水洗終止；蘇木素復染20 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡在10×40倍下對視野中VEGF 陽性率表達觀察，Image-Pro Plus 軟件行圖像分析，計算目的蛋白表達面積與組織總面積的比率，取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.4.4Western blot 測定NeuN 蛋白表達水平 將腦組織從-80 ℃冰箱中取出，按每0.1 g 腦組織加1 mL 組織蛋白裂解液至玻璃勻漿器勻漿好的組織當中，充分混勻后，采用去垢劑兼容型考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒定量檢測各標本總蛋白濃度。 每組取20 μg 蛋白裂解液制樣，①電泳：包括制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，本次實驗濃縮膠濃度5%，分離膠濃度12%，灌膠，上樣。 ②蛋白電泳：將電泳儀調至恒壓100 V 后開始電泳，待指示劑進入分離膠后，調整電壓120 V 繼續(xù)電泳，待藍色指示條接近凝膠底部后停止電泳。 ③轉膜：將凝膠按照陽極、海綿墊、濾紙、PVDF 膜、凝膠、濾紙、海綿墊、陰極的順序夾入轉膜夾中，然后將轉膜夾按照正負極裝配到轉膜槽中，連接好正負極，將電泳儀調至恒流200 mA 轉膜2 h，此時的蛋白已從凝膠轉移至PVDF 膜上。④封閉：將有目的蛋白的PVDF 膜浸泡在TBST 配制的5%脫脂牛奶中，室溫下在垂直脫色搖床上封閉1 h。相繼加NeuN 一抗（1∶500）、二抗（1∶5 000）孵育進行免疫反應，取出PVDF 膜浸入PBST 中，搖床搖動10 min，重復3 次，加ECL 發(fā)光液，顯色曝光。 結果采用Quantity One 圖像分析軟件進行定量分析等量的樣品蛋白灰度值，以各組NeuN 與內參Actin 灰度比值即為相對灰度，再除以假手術組相對灰度作為統(tǒng)計指標。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。 數據符合正態(tài)分布采用（±s）表示，多組的組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較在方差齊性的情況下用LSD-t法進行后效檢驗，方差不齊的情況下用Tamhane'sT2 方法進行事后檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 神經功能缺損評估

假手術組和運假組均未出現神經功能缺損表現。 與模型組比較，運模組在再灌注24 h 后神經功能缺損評分降低（P＜0.05）；與模型組比較，運模組在再灌注3 d 后神經功能缺損評分降低（P＜0.05）。評分越低，損傷程度越輕。 見表1。

表1 4 組大鼠不同時間mNSS 評分比較（±s） 分Table 1 Comparison of mNSS scores in four groups of rats at different times （±s）Scores

表1 4 組大鼠不同時間mNSS 評分比較（±s） 分Table 1 Comparison of mNSS scores in four groups of rats at different times （±s）Scores

注：與模型組比較，1） P＜0.05。Note: Compared with the model group, 1) P＜0.05.

組別假手術組運 假 組模 型 組運 模 組n 再灌注24 h 再灌注3 d 12 12 12 12 00 00 12.50±0.47 11.50±0.381）9.50±0.57 7.25±0.351）

2.2 免疫組化染色VEGF 表達

腦組織半暗帶區(qū)，VEGF 免疫組織化學染色中的棕褐色或棕黃色顆粒沉著在細胞漿和包膜及細胞周邊區(qū)，在腦組織的神經元、膠質細胞和內皮細胞均可表達。 再灌注24 h 后，假手術組可見少量的血管內皮生長因子VEGF 表達，陽性細胞胞體小，突起細，陽性率較低。 見表2、圖1 和圖2。

表2 4 組大鼠不同時間VEGF 表達比例%Table 2 The ratio of VEGF expression in four groups of rats at different times%

圖1 4 組腦缺血再灌注24 h 后缺血側VEGF 表達（×400）Figure 1 VEGF expression in four groups on ischemic side 24 hours after cerebral ischemia reperfusion （×400）

圖2 4 組腦缺血再灌注3 d 后缺血側VEGF 表達（×400）Figure 2 VEGF expression in four groups on ischemic side 3 days after cerebral ischemia reperfusion （×400）

2.3 NeuN 蛋白的表達水平

NeuN 蛋白的Western blot 結果顯示，再灌注24 h后運模組與模型組都有下降，運模組下降程度相比模型組較少；再灌注3 d 后都有升高，運模組升高程度相比模型組較多。 再灌注24 h 和3 d 后，運模組分別與假手術組、模型組、運假組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見圖3 和圖4。

圖3 4 組大鼠腦缺血周邊區(qū)NeuN 蛋白表達Figure 3 NeuN protein expression in the peripheral area of cerebral ischemia in four groups of rats

3 討 論

在“針康同步、動態(tài)治療、整體康復”的腦卒中康復思想“針康法”指導下［7］，本課題組前期研究做了大量關于動物實驗以及臨床研究［8］，表明針康法促進缺血區(qū)周圍皮質突觸可塑，降低腦缺血后神經元的損傷，加速神 經功能 重建［9］；抑制神 經元凋亡［10］，保護神經元；促進血管新生［11-12］；降低炎性損傷程度［13］等。 總之，針康法對微血管、神經元、膠質細胞的保護不是單一的，而是整體上調控，從而促進腦缺血后神經血管單元功能重塑［14］。 另外，針康法也強調腦卒中預防的重要性，研究表明運功預處理可改善腦缺血再灌注大鼠血腦屏障通透性，具有腦保護作用［15］；電針預處理降低炎癥反應，減少細胞凋亡［16］，炎癥反應在缺血性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色，參與病理損傷的全過程［17］。

圖4 4 組大鼠腦缺血周邊區(qū)NeuN 蛋白灰度值比較Figure 4 Comparison of the gray value of NeuN protein in the cerebral ischemic peripheral area in four groups of rats

本研究結果發(fā)現，腦缺血再灌注3 d 后VEGF表達更多，3 d 時運模組在缺血周邊區(qū)的表達明顯高于模型組、運假組和假手術組，這一結果提示運動預處理促進了VEGF 表達，腦缺血再灌注以后也會促進VEGF 表達，而同樣在腦缺血再灌注的條件下，運動預處理組的大鼠VEGF 表達更多，神經功能缺損表現更低；腦缺血再灌注3 d 以后NeuN 蛋白表達明顯增多，神經功能缺損表現也更低。 在實驗中也發(fā)現運假組在腦缺血再灌注3 d 后，VEGF、NeuN 蛋白表達都有增高，考慮主要是運動預處理促進了相關蛋白表達。

目前對于運動預處理的作用機制有很多研究，其主要在于在反復的運動中，出現短暫的、輕微的腦缺血可有效誘導缺血／缺氧耐受，導致具有調節(jié)神經環(huán)境、再生過程、神經細胞凋亡和氧化應激等作用，另外也有圍繞血流動力學和血管內皮功能，誘導VEGF 信號［18］。 VEGF 為血管內皮細胞增殖和遷移以及血管通透性的關鍵調節(jié)因子［19］。 有文獻報道，VEGF 及受體是血管生成中特異、有效的作用元素，在血管生成中具有重要的意義，而VEGF 表達的主要刺激因素為血流量增加、內皮剪應力增加、氧化代謝增強等［20］，VEGF 在運動誘導血管生成和增加腦側支循環(huán)中的作用需要反復進行中、高強度的運動訓練［21］。另有研究報道，Fc-axatilin 通過調節(jié)下游信號通路減弱VEGF 誘導的內皮通透性，這可能有助于其對缺血性腦血管滲漏的保護作用［22］。 基質金屬蛋白酶-9、VEGF 參與了腦梗死的發(fā)生、發(fā)展過程，在缺血性腦卒中其具有重要的臨床意義［23-24］。

NeuN 是一種核蛋白，在成熟神經元胞核中表達，是一種特異的神經元標志物，神經元的成熟與NeuN 的表達量成正相關性，因此作為神經元的標記物［25］。金媛媛等［26］觀察到腦缺血后，缺血區(qū)NeuN 陽性細胞減少。 因此，本研究采用中等強度跑步訓練，觀察運動預處理對于腦缺血再灌注后VEGF、NeuN的影響。

臨床研究表明，運動訓練可以提高老年人的腦血管反應性，增加健康老年人大腦中的小血管數目，并減少血液流變特性的異常［27-28］。 糾正心腦疾患危險因素的重要方法即為運動療法，其在心腦血管疾病一級和二級預防中起著重要作用［29］。 缺血性腦卒中的危險因素有效管理對于降低腦卒中的復發(fā)率是很重要的［30］，社會支持是患者應對疾病的有效資源之一［31］，然而目前公眾對健康生活方式的認識和對危險因素的控制仍然不是最理想的［32］。 本研究結果表明，腦缺血再灌注前給予運動預處理可減少腦缺血再灌注以后的腦損傷程度，通過增強VEGF、NeuN 蛋白的表達，從而改善感覺運動功能障礙和運動行為。 本實驗進一步證明臨床中運動預處理對于腦卒中的預防機制，從而提供具有腦卒中風險人群預防的依據。